本發(fā)明涉及昆蟲雙鏈RNA（dsRNA）介導的基因沉默的領域。更具體地，本發(fā)明涉及遺傳構(gòu)建體，其被設計用來在植物中表達蚜蟲基因的dsRNA。這些構(gòu)建體可被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，對取食該植物的蚜蟲具有潛在的抑制或殺傷作用。

背景技術(shù)：
蚜蟲危害棉花、小麥、油菜等多種作物?；瘜W殺蟲劑是目前主要的控制手段。但化學殺蟲劑存在副作用，它們不僅污染環(huán)境，也沒有特異性，除了對蚜蟲殺傷外，也會對作物及其它昆蟲造成傷害?；瘜W殺蟲劑在環(huán)境中代謝緩慢，會進入食物鏈中，在高級的捕食物種中積累，并產(chǎn)生毒性。因為生物殺蟲劑可以避免化學殺蟲劑的這些危險，而受到青睞。例如，Bacillusthuringiensis(B.t.)細菌作為一種環(huán)境安全的生物殺蟲劑已經(jīng)市場化應用超過30年了。生物殺蟲劑除了能保持土壤和水清潔外，也會因化學殺蟲劑使用量的降低而使田間有益昆蟲的數(shù)量增加。RNAi對靶基因mRNA抑制的特異性和高效性使之成為一種控制基因表達的有力工具。RNAi是由小干擾RNA（siRNA）介導的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。RNAi由dsRNA觸發(fā)，細胞中的dsRNA被Dicer核酸酶水解為21～23nt的siRNA，siRNA再引導核酸內(nèi)切酶對細胞內(nèi)的與之序列配對的mRNA進行降解。有些動物的消化道可以吸收來自食物的dsRNA，并誘導消化道細胞產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象，或進一步地引起系統(tǒng)性的基因沉默。通過飼喂表達dsRNA的細菌，以成功建立了線蟲基因沉默的方法。如果dsRNA引發(fā)沉默的基因是害蟲生存所必需的，則該dsRNA就可能研制為殺蟲劑。dsRNA能否達到殺蟲的效果，與dsRNA能否被昆蟲中腸有效吸收和在昆蟲細胞中能否引發(fā)強烈的RNAi效應有關。為此，dsRNA首先必須在昆蟲中腸達到較高的濃度。本發(fā)明提供了一種RNAi載體，可以使轉(zhuǎn)基因植物在韌皮組織中表達棉蚜的dsRNA和ToMV的CP蛋白，該dsRNA由于包含OAS而可以被CP包裝，從而降低在消化道的降解，在中腸形成較高的濃度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種植物表達載體、蚜蟲基因dsRNA表達載體及其應用。一種植物表達載體，用于構(gòu)建dsRNA植物表達載體，dsRNA序列與番茄花葉病毒（ToMV）的起始組裝序列（originalassemblysequence，OAS）相連，因此轉(zhuǎn)錄的RNA分子能夠被ToMV的外殼蛋白（CP）所包裝；所述的植物表達載體還包含了ToMV的CP基因的表達框架，其編碼的CP能包裝含OAS的RNA分子，dsRNA編碼序列和CP基因序列均置于一個韌皮部優(yōu)勢表達的啟動子之下，使dsRNA和CP蛋白能在轉(zhuǎn)基因植物的篩管中積累。將棉蚜靶標基因序列與ToMV的OAS相連，并同時表達ToMV的CP蛋白；CP蛋白可以識別OAS，并從OAS開始對RNA包裝；蛋白質(zhì)的包裝可以降低RNA與RNA酶的接觸，從而減少降解的風險；另外，蚜蟲取食于植物的篩管，本發(fā)明用韌皮部特異性的啟動子使RNA和CP能在篩管中形成較高的濃度，而在其它組織中表達很低。本發(fā)明載體在OAS兩側(cè)提供了兩組由同尾酶（XbaI/AvrII和XmaI/BspEII）組成的插入位點，當靶標序列的兩側(cè)分別為XbaI和XmaI及其同尾酶時，均可被克隆到上述兩個位點。本發(fā)明載體以pCAMBIA2300為骨架，可以用農(nóng)桿菌介導法對目標植物進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細胞用卡那霉素篩選。在實施例中，用于產(chǎn)生dsRNA的靶標序列是從棉蚜中分離的V-型質(zhì)子泵ATPase的A亞基基因的同源片段。但靶標序列可以不限于該基因以及棉蚜。本發(fā)明載體中，dsRNA的轉(zhuǎn)錄是由韌皮部特異性啟動子驅(qū)動的，使dsRNA主要在篩管中積累。其潛在的害蟲防治對象為用刺吸式口器取食的蚜蟲、粉虱、介殼蟲等。附圖說明圖1為pBiRolCPOAS載體圖；圖2為PRNAiAV2載體圖；圖3為PCR產(chǎn)物電泳；圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥抑制取食棉蚜AV2基因的表達。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1：載體構(gòu)建所需DNA片段的制備載體（圖1）構(gòu)建所需ToMVCP、ToMVOAS和NOS終止子等DNA片段均通過PCR獲得，兩端克隆所需的酶切位點通過PCR引物引入，所用引物如下：ToMVOAS和ToMVCP的擴增，以ToMV的基因組RNA為模板，分別用引物對OAS_F/OAS_R和CP_F/CP_R進行RT-PCR。RT-PCR采用IIIOne-StepRT-PCRSystemwith（目錄編號12574018，Invitrogen）試劑按說明書操作完成。NOS終止子的擴增以pBI221為模板，用引物NOS_F/NOS_F進行PCR。PCR產(chǎn)物均采用瓊脂糖凝膠電泳分離。NOS終止子擴增產(chǎn)物大小為272bp，ToMVOAS的擴增產(chǎn)物大小為414bp，ToMVCP的擴增產(chǎn)物大小為495bp（圖3）Rol啟動子（SEQIDNO:2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并克隆到pUC57載體。實施例2：pBiRolCPOAS載體構(gòu)建下列過程中酶切產(chǎn)物的分離均采用瓊脂糖凝膠電泳方法，用QIAquickGelExtractionKit純化，DNA片段的連接用T4DNA連接酶（promega，目錄號M1801）按說明書進行。RNAi載體的構(gòu)建流程為：1.將實施例1中ToMVCP通過限制性內(nèi)切酶BamHI/SacI位點克隆到pBi221，構(gòu)建為載體p221CP；2.用BamHI/PstI雙酶切將Rol啟動子從pUC57載體上切下（圖4），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，和回收后，克隆到p221CP的BamHI/PstI位點，構(gòu)建為載體p221-Rol-CP；3.將實施例1中NOS終止子通過限制性內(nèi)切酶HindIII/PstI位點克隆到p221-Rol-CP，構(gòu)建為載體p221-RolCPNOS；4.將實施例1中ToMVOAS通過限制性內(nèi)切酶BspEI/PstI位點克隆到p221-RolCPNOS，構(gòu)建為載體p221RolCPOAS；5.將p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相應位點，構(gòu)建成表達載體pBiRolCPOAS。實施例3：pRNAiAV2載體構(gòu)建本實施例是應用載體pBiRolCPOAS構(gòu)建棉蚜V型質(zhì)子泵基因(AV2)dsRNA表達載體的方法。棉蚜AV2基因片段是根據(jù)桃蚜的同源基因序列（XM_001950855）設計兼并引物，從棉蚜cDNA擴增而來。擴增片段克隆到pGEM-Teasy載體（promega），經(jīng)測序確定序列為SEQIDNO:1。pRNAiAV2載體構(gòu)建流程如下：1.用引物AV2_F（CCCGGGTTCATACAGTAAATATACAA）和AV2_R(TCTAGATATAACTGATCAAAGTCAGCACGG)擴增AV2的部分片段，在片段的兩端分別引入XmaI和XbaI位點；將擴增的片段克隆到pGEM-Teasy載體（promega）測序；2.用XmaI和XbaI從1.中T載體上把AV2片段切下，命名為AV2_XX；3.用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS，回收載體片段，并與AV2_XX連接，構(gòu)建得到載體pRolAV；4.用BspEII和AvrII消化pRolAV，回收載體片段，并與AV2_XX連接，構(gòu)建得到載體pRNAiAV2。實施例4：獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥用電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pRNAiAV2導入農(nóng)桿菌GV3101中，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。擬南芥轉(zhuǎn)化采用蘸花法。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥被用于轉(zhuǎn)化：將擬南芥種在蛭石和草炭土（1:1）的盆缽中，置到短日照（光照8h/16h黑暗）培養(yǎng)室里，22℃培養(yǎng)1個月；將光周期改為（16h光照/8h黑暗），繼續(xù)培養(yǎng)1～2周，待花薹抽出后即可用于轉(zhuǎn)化。使用200μl的移液器將準備好的農(nóng)桿菌浸染液滴在花上。浸染后的擬南芥植株用保鮮膜覆蓋保濕，24小時后去除保鮮膜。隔一周后重復處理1次。浸染后的植株在同樣的生長條件使其正常生長，收獲種子。將上述轉(zhuǎn)化的擬南芥種子播種在含有50μg/ml的卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上。經(jīng)16h光照/8h黑暗的培養(yǎng)室里培養(yǎng)約10～14天，選擇綠色、生長良好的植株（T1代轉(zhuǎn)基因植株）移栽到含有蛭石和草炭土（1:1）的盆缽中，收獲自交種子；將自交種子繼續(xù)播種在卡那霉素培養(yǎng)基中，篩選抗卡那霉素植株，自交收獲種子，每個T1植株收獲8個自交二代植株種子；每個自交T2植株播種100粒種子于卡那霉素培養(yǎng)基上，觀察幼苗（T3植株）是否存在抗性分離，留取不分離的（純合）株系。實施例5：轉(zhuǎn)基因植物對取食棉蚜基因的抑制作用隨機選取3個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，每個株系取9株用接種棉蚜。每株接種20只蚜蟲，用防蟲網(wǎng)隔離，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，飼喂7天后，收集棉蚜，用Trizol按照說明書提取棉蚜總RNA，再經(jīng)過DNAI消化后，按照FermentRevetAidTMH-MinusFirstStandCDNASynthesisKit說明書合成cDNA的。熒光定量PCR試劑；FermentRevetAidTMH-MinusFirstStandCDNASynthesisKit購自Ferment公司。表2.棉蚜基因表達分析所用引物引物名稱核酸序列AG.AV2O598FGGCACGTCATGTTGTTGAGTAG.AV2O714RGGGTCCTTGAACTTCATGGAAg.Rpl7.38FTGCCGGAGTCTGTACTCAAAg.Rpl7.292RTCACACCACGAATACGCA棉蚜基因的轉(zhuǎn)錄表達分析采用實時熒光定量PCR方法。PCR預混試劑為Roche公司的LightCyclerSYBRGREENIMaster。內(nèi)參基因為棉蚜Rp17基因，引物見表2。反應程序：94℃預變性5min；94℃15s，58℃30s，72℃20s，共40個循環(huán)；72℃下延伸10min?；虮磉_量采用2-△△CT法進行計算。結(jié)果顯示，與喂食野生型擬南芥的蚜蟲相比，取食轉(zhuǎn)基因擬南芥的蚜蟲，其AV2基因的表達受到明顯抑制（圖4）。應當理解的是，對本領域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。