專(zhuān)利名稱(chēng)：靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米纖維膜的制備領(lǐng)域，特別涉及一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法。
背景技術(shù)：
酶的固定化就是通過(guò)某些操作將酶與載體相結(jié)合后成為不溶于含有底物的相中，從而使酶被集中或限制在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行酶解反應(yīng)。固定化酶在保持游離酶高效、專(zhuān)一及溫和的催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還具有如下優(yōu)點(diǎn)酶的固定化后其性質(zhì)如活性、穩(wěn)定性、最適溫度、最適pH、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及對(duì)底物的專(zhuān)一性等會(huì)呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。這種改變一般有兩方面原因一是酶自身發(fā)生變化；二是固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)影響引起的變化。 固定化酶的載體材料也是影響固定化酶性能的主要因素之一。載體材料與酶分子之間的相互作用能夠改變酶分子的三維構(gòu)象和其催化反應(yīng)的微環(huán)境，影響底物向酶活性中心和產(chǎn)物向外擴(kuò)散的速率。除了化學(xué)組成，載體材料的結(jié)構(gòu)、孔徑、表面積等因素也會(huì)影響酶分子的催化性能。通過(guò)酶固定化技術(shù)，將酶固定在膜表面制成酶膜，可以將酶的催化功能和膜的分離功能有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，這一點(diǎn)是其他載體材料無(wú)法比擬的。這其中，近十幾年間發(fā)展起來(lái)的靜電紡絲法制備納米纖維膜的技術(shù)表現(xiàn)尤為強(qiáng)勁。糖具有良好的親水性、生物相容性以及對(duì)蛋白質(zhì)的特異識(shí)別性，因此糖基化膜可把糖的生物功能和膜分離技術(shù)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，從而拓展其在蛋白質(zhì)分離純化、細(xì)菌特異性捕捉、細(xì)胞聚集增長(zhǎng)等方面的應(yīng)用。與未改性聚丙烯微孔膜相比，通過(guò)等離子體引發(fā)含糖單體接枝聚合而得的糖基化聚丙烯微孔膜的親水性及生物相容性顯著改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，本發(fā)明采用自由基聚合方法制備丙烯腈與含糖聚合物共聚物，提高了共聚物的可紡性，改善了材料的生物相容性及親水性，本發(fā)明的膜材料含有豐富的可反應(yīng)親水活性功能基團(tuán)，在酶的固定化應(yīng)用中表現(xiàn)良好的吸附性，固定化酶的活性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯提高。本發(fā)明的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，包括(I)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3-4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯；(2)將摩爾比1:1 4:1的己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質(zhì)量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質(zhì)量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應(yīng)4-5天，過(guò)濾、旋蒸后層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖 OVAG ；
(3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，0VAG:AN的摩爾比為1:20，以過(guò)硫酸銨作為引發(fā)齊U，H2O作溶劑，然后于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4-5h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共聚物；(4)將質(zhì)量比為3. 6:1的Poly (AN-CO-0VAG)和OVAG溶于DMAC:DMF混合溶劑體系中，磁力攪拌至完全溶解，靜電紡絲。真空干燥即得Poly (AN-co-OVAG) /OVAG超細(xì)納米纖維膜。所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開(kāi)劑的化學(xué)組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比為9:1，用I2顯色。所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在 于所述步驟(2)中的0VAG，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開(kāi)劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發(fā)劑濃度為1%，OVAG的濃度為20g/100mL H2O,聚合溫度為60°C。所述步驟(3)中的聚合反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物反復(fù)經(jīng)丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒(méi)反應(yīng)的 OVAG。所述步驟(4)中的紡絲液中Poly (AN-co-OVAG)/OVAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占紡絲重量的2-10wt%，其中 OVAG 占 Poly (AN-co-OVAG)/OVAG 總質(zhì)量的 21. 45%。所述步驟(4)中的靜電紡絲的參數(shù)為注射器規(guī)格為5ml，直徑14mm，流速
O.5-1. 5ml/h，靜電壓12-17KV，接收器為接地鋁箔，接收距離15_20cm。本發(fā)明制備的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜應(yīng)用于酶的固定化包括以下步驟將空白纖維膜首先放入PBS中約20min，將膜取出，放入環(huán)氧氯丙烷溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3-4h后取出，用PBS (pH=7.4)反復(fù)沖洗5次。配制新鮮的的過(guò)氧化氫酶溶液。將活化過(guò)的纖維膜放入酶液中，在4 ° C水浴中振蕩反應(yīng)一定時(shí)間(Ih，2h，3h，4h，5h，6h)后取出，用PBS反復(fù)沖洗，收集洗液和原酶液以測(cè)定載酶量。最后將膜儲(chǔ)存于4° C測(cè)定固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。所述的載酶量的測(cè)定方法用Bradford方法在595nm處測(cè)定原酶液與洗液的吸光度，對(duì)比BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出對(duì)應(yīng)的酶含量，間接地得出固定酶量。所述的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的測(cè)定方法將游離酶溶液(O. I mg/mL)和一批處于濕態(tài)的固定化酶膜置于4° C下保存，間隔一段時(shí)間取出一份樣品測(cè)定其活性。通過(guò)考察酶殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。本發(fā)明以6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖(OVAG)、OVAG/丙烯腈共聚物Poly(AN-co-OVAG)為紡絲材料，以DMAC:DMF (v/v=2:l)為溶劑，調(diào)整過(guò)程參數(shù)，成功的紡出Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜，為實(shí)驗(yàn)中固定過(guò)氧化氫酶提供了合適的載體材料。有益.效果(I)本發(fā)明采用自由基聚合方法制備丙烯腈與含糖聚合物共聚物，提高了共聚物的可紡性，改善了材料的生物相容性及親水性。(2)本發(fā)明的膜材料含有豐富的可反應(yīng)親水活性功能基團(tuán)，在酶的固定化應(yīng)用中表現(xiàn)良好的吸附性，固定化酶的活性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯提高。


圖I (a)為實(shí)施例I中所得的Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜掃描電鏡圖，圖I (b)為所得纖維的直徑分布圖(紡絲電壓為14kv，接收距離為17cm，噴射流速為lml/h。紡絲液中Poly (AN-co-OVAG) /OVAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占紡絲液質(zhì)量的6wt%，其中OVAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占 Poly (AN-co-OVAG) /OVAG 質(zhì)量的 2L 45% (wt/wt)。 圖2為實(shí)施例2中測(cè)得的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖3為實(shí)施例3中游離酶與固定化酶在30d中殘留活性隨時(shí)間的變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例I(I)稱(chēng)取O. 36mol己二酸、2. Ig乙酸汞、O. 07g醋酸銅于250mL圓底燒瓶中，加入150mL乙酸乙烯酯，置于60°C油浴鍋中加熱并攪拌，約5min后加入3_4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，硅膠柱層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯，洗脫劑與展開(kāi)劑的化學(xué)組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯體積比為9:1，用I2顯色。(2)稱(chēng)取12g己二酸二乙烯酯、4g葡萄糖，溶于75-100mL吡啶中，1.5g堿性蛋白酶為催化劑，50°C搖床中反應(yīng)4-5天，過(guò)濾、旋蒸后硅膠柱層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖(OVAG)，洗脫劑為乙酸乙酯，展開(kāi)劑為乙酸乙酯、甲醇與水的混合物，乙酸乙酯、甲醇與水的體積比為17:3:1，用I2顯色。(3)在反應(yīng)瓶中加入丙烯腈AN和0VAG，以過(guò)硫酸銨(占葡萄糖乙烯脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1%)作為引發(fā)劑，H2O作溶劑(OVAG濃度為20g/mL H20)，然后于60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly (AN-co-OVAG)共聚物；(4)將質(zhì)量比為3. 6:1的Poly (AN-co-OVAG)和OVAG溶于體積比為2 :1的DMAC: DMF混合溶劑體系中，磁力攪拌至完全溶解，得Po I y (AN-co-OVAG) /OVAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占紡絲液質(zhì)量6% (wt/wt)的紡絲液，其中OVAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占Poly(AN-Co-OVAG)/OVAG總質(zhì)量的21. 45%;用5mL注射器吸取紡絲液，固定于靜電紡絲裝置上，控制噴出流速I(mǎi). Oml/h，靜電壓14kv，接收屏采用鋁箔接地接收，針頭與接收屏的距離為17cm，得Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜；放入真空干燥箱中37°C恒溫干燥36h ;其電鏡照片如圖1(a)所示，直徑分布如圖1(b)所示。
實(shí)施例2(I)將5. OOmg的空白纖維膜首先放入PBS中約20min，將膜取出，放入環(huán)氧氯丙烷溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS (pH=7.4)反復(fù)沖洗5次。配制O. Img/mL的過(guò)氧化氫酶溶液。將活化過(guò)的纖維膜放入3. OmL酶液中，在4° C水浴中振蕩反應(yīng)一定時(shí)間(lh，2h，3h，4h，5h，6h)后取出，用PBS反復(fù)沖洗，收集洗液和原酶液。(2)用Bradford方法在595nm處測(cè)定固定化后原酶液與洗液的吸光度，對(duì)比BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)，求出對(duì)應(yīng)的酶含量，間接地得出固定酶量。BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)具體制作方法為準(zhǔn)確稱(chēng)取IOOmg BSA溶于IOmL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)溶解，加入到IOOmL容量瓶中定容，配成lmg/mL的BSA溶液。分別用移液槍準(zhǔn)確移取X mL(如表I)的此溶液于試管瓶中，用上述磷酸鹽緩沖溶液定容，配成系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體用量參照表I。根據(jù)以上所述Bradford方法,用紫外分光光度計(jì)于595nm處檢測(cè)不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度值為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)作圖，制得該濃度范圍的BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 表I
權(quán)利要求
1.一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，包括 (1)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3_4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯； (2)將摩爾比1:1 4:1的己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質(zhì)量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質(zhì)量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應(yīng)4-5天，過(guò)濾、旋蒸后層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ； (3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG= AN的摩爾比為1:20，以過(guò)硫酸銨作為引發(fā)劑，H2O作溶劑，然后于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4-5h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共聚物； (4)將質(zhì)量比為3.6:1的Poly(AN-co-OVAG)和OVAG溶于DMAC:DMF混合溶劑體系中，磁力攪拌至完全溶解，靜電紡絲。真空干燥即得Poly (AN-co-OVAG) /OVAG超細(xì)納米纖維膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開(kāi)劑的化學(xué)組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比為9:1,用I2顯色。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的0VAG，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開(kāi)劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發(fā)劑濃度為1%，OVAG的濃度為20g/100mL H2O,聚合溫度為 60°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的聚合反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物反復(fù)經(jīng)丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒(méi)反應(yīng)的OVAG。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的紡絲液中Poly (AN-co-OVAG)/OVAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占紡絲重量的 2-10wt%，其中 OVAG 占 Poly (AN-co-OVAG)/OVAG 總質(zhì)量的 21. 45%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的靜電紡絲的參數(shù)為注射器規(guī)格為5ml，直徑14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，靜電壓12-17KV，接收器為接地鋁箔，接收距離15_20cm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靜電紡含糖聚合物與丙烯腈共聚物納米纖維膜的制備方法，包括(1)制備己二酸二乙烯酯；(2)酶促合成6-O-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG；(3)在OVAG中加入丙烯腈AN，以過(guò)硫酸銨做引發(fā)劑，H2O作溶劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到OVAG/丙烯腈共聚物Poly(AN-co-OVAG)；(4)Poly(AN-co-OVAG)/OVAG溶于DMAC:DMF混合溶劑體系中得紡絲液，靜電紡絲后真空干燥即得Poly(AN-co-OVAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜。本發(fā)明的膜材料在酶的固定化應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的吸附性，固定化酶的活性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均明顯提高。
文檔編號(hào)C08F220/44GK102899735SQ20121023816
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者朱利民, 劉中青, 權(quán)靜, 李艷, 金成成 申請(qǐng)人:東華大學(xué)