專利名稱：一種細胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組織工程支架材料，尤其涉及一種用于腫瘤細胞體外三維培養(yǎng)的具有微米孔道的細菌纖維素/膠原支架材料及其制備方法。
背景技術：
癌癥是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。癌癥與心腦血管疾病和意外事故一起，構成當今世界所有國家三大死亡原因。世界衛(wèi)生組織(WHO)和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項首要任務。在抗癌藥發(fā)展應用的初期，對抗癌藥功效的檢測通常采用體外細胞培養(yǎng)板中二維培養(yǎng)病變組織細胞和動物實驗。由于人體組織中，細胞生長的微環(huán)境是在三維的條件下，而且三維的立體環(huán)境對腫瘤組織的調節(jié)和惡化都有很重要的影響。因此，在二維培養(yǎng)的情況下，細胞組織對抗癌藥的反應與在體內使用情況有較大的差異，導致二維培養(yǎng)條件下構建的腫瘤模型得出的結論對癌癥病變和治療缺少一定的權威性。雖然在抗癌藥研究初期，腫瘤組織細胞體外二維培養(yǎng)為腫瘤的研究和治療起到不可忽略的作用，但是這種存在明顯不足的研究方法勢必會被新的技術方法取代。隨著組織工程的發(fā)展，人們對組織工程的應用更加了解。組織工程的目的是通過在支架材料上體外培養(yǎng)受損部位的正常組織細胞，獲得可以替代受損組織器官的新再生物。與正常組織細胞相比，腫瘤細胞也是細胞的一種，雖然有其獨特的生長微環(huán)境，但是也經(jīng)歷細胞的增殖與分化等過程，因此，對培養(yǎng)支架也有共同的要求。受組織工程的影響，組織工程支架材料可以用于腫瘤細胞的體外培養(yǎng)，適合于正常組織細胞生長增殖的組織工程直接也適合與腫瘤細胞的生長。因此，在支架材料的選擇上腫瘤細胞與正常細胞具有一致性。經(jīng)過對腫瘤組織細胞在膠原、蠶絲蛋白等的立體的三維支架中的培養(yǎng)獲得的效果表明在組織工程支架材料進行體外培養(yǎng)(三維培養(yǎng))得到的細胞的行為表達更接近于體內組織，而且觀察到二維培養(yǎng)中沒有出現(xiàn)的腫瘤細胞典型的凋亡和壞死行為，使我們進一步了解到腫瘤組織在人體內的行為效應。除此以外，腫瘤細胞典型的缺氧誘導因子和血管再生因子等也顯著表達。通過對與細胞板二維培養(yǎng)對比，發(fā)現(xiàn)在立體支架材料上的三維培養(yǎng)可以提供一個更類似人體組織的微環(huán)境。但是目前臨床效果較好的支架基材都是膠原或蠶絲蛋白等昂貴的原材料，因此改善現(xiàn)有的支架材料并探索新的支架材料用于腫瘤組織三維體系的體外構建具有非常重要的臨床意義和現(xiàn)實意義。在眾多的高分子支架材料中，細菌纖維素引起人們的關注。細菌纖維素具有精細的三維的納米網(wǎng)絡結構、良好的力學性能、超高的純度、顯著的透氣性能、超強的持水保濕能力、良好的形狀維持能力以及良好的生物相容性等。正是由于細菌纖維素具有獨特的性能，使其在生物醫(yī)用領域中具有十分廣泛的應用潛力，已被廣泛應用于人工皮膚、傷口敷料、人工血管、人工角膜、軟骨替代、以及牙齒修復等方面?；诩毦w維素在組織工程領域取得的大量研究結果，使其在腫瘤細胞的培養(yǎng)上具有了可行性，此外，研究表明，與活性更好的生物大分子相結合可以進一步改善細菌纖維的生物相容性，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，在細菌纖維素的納米纖維表明包覆一層明膠或殼聚糖等，細菌纖維素的生物活性得到顯著的改善。眾所周知，膠原作為生物活性高分子，在組織工程領域和腫瘤細胞培養(yǎng)領域都得到了廣泛的研究，但是其價格昂貴限制了其應用范圍，所以選擇膠原與細菌纖維素復合制備一種細菌纖維素復合支架，不僅可以保證支架的生物活性與力學強度，同時又可以大大降低膠原的用量，降低支架的制作成本，可以達到雙重效果。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供一種具有微米孔道結構的細菌纖維素/膠原復合材料，并將其應用到腫瘤細胞的體外三維培養(yǎng)中。本發(fā)明先將細菌纖維素激光消融造孔處理，再與膠原復合，首次將原花青素用于細菌纖維素和膠原復合材料的制備，使膠原包裹在細菌纖維素的纖維表面，制得細菌纖維素/膠原復合材料，然后首次將其應用到幾種腫瘤細胞的體外三維培養(yǎng)。微米孔道引入到細菌纖維素中解決了細菌纖維素中缺少微米大孔的結構缺陷，有利于細胞的長入和營養(yǎng)的運輸；膠原引入到細菌纖維素中提高了細菌纖維素的生物活性有利于細胞的粘附、生長和繁殖,滿足腫瘤細胞體外培養(yǎng)對支架材料的要求。本發(fā)明制備工藝簡單，未使用任何有毒藥品，安全無毒性。為了解決上述技術問題，本發(fā)明一種細胞培養(yǎng)支架材料予以實現(xiàn)的技術方案是 它的組分由下列原料組成細菌纖維素凝膠膜、膠原和原花青素；所述細菌纖維素凝膠膜、 膠原、原花青素的質量比100-200 1-5 4-6;其中，所述細菌纖維素凝膠膜具有微米孔道，所述微米孔道的直徑范圍為100-300 μ m，所述微米孔道的孔間距為l-2mm。本發(fā)明一種細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，經(jīng)過如下步驟制得a.將細菌纖維素凝膠膜激光消融處理造孔，孔直徑為100-300 μ m，孔間距為 l_2mm ；b.將制得的具有微米孔道的細菌纖維素凝膠膜放入l-5g/l的膠原水溶液中， 37 °C恒溫浸泡O. 5-2天；C.將上述處理好的凝膠膜取出放入4_6g/l的原花青素溶液中，37°C恒溫攪拌 l-3h，即得細菌纖維素/膠原復合材料；d.將制得的細菌纖維素/膠原復合材料取出，清洗干凈后，做冷凍干燥滅菌處理， 即得細胞培養(yǎng)支架材料。其中，將細菌纖維素凝膠膜激光消融處理造孔是將所述細菌纖維素凝膠膜置于 JG-1080型數(shù)控激光切割機下，加工直徑為100-300 μ m的孔，孔間距為l_2mm。進一步講，本發(fā)明細胞培養(yǎng)支架材料中，所述細菌纖維素凝膠膜是由根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、木醋桿菌中的一種或幾種微生物發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性備用。所述細菌纖維素凝膠膜優(yōu)選由木醋桿菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性，激光消融處理后再用堿液和去離子水多次煮沸清洗至中性備用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明中，將少量的膠原引入細菌纖維素支架中既可以提高細菌纖維素的生物活性又可以大大減少膠原的用量，降低成本，起到一舉兩得的作用。本發(fā)明首先對細菌纖維素進行激光消融處理，然后制備了細菌纖維素/膠原復合材料，最后將其用于多種腫瘤細胞的體外培養(yǎng)，并得到一系列具有科學意義的實驗結果。相比于普通的細菌纖維支架材料，該材料不僅具有更高的生物相容性，而且具有獨特的微米孔道結構，滿足了組織工程對理想支架材料的要求。這種在生物相容性和微觀結構上都滿足組織工程支架材料要求的支架將在組織工程領域具有很高的臨床應用價值。本發(fā)明將具有微米孔道的細菌纖維素與膠原復合，首次以原花青素作為交聯(lián)劑將膠原包裹在細菌纖維素的纖維表面，制得細菌纖維素/膠原復合材料，然后首次將制備的復合材料用于腫瘤細胞體外三維培養(yǎng)。細菌纖維素中微米孔道的引入解決了普通細菌纖維素缺少微米大孔的缺陷，使其具有獨特的微米孔道結構，有利于細胞的長入和營養(yǎng)氧氣的運輸，將膠原帶入改進的細菌纖維素中，進一步改善細菌纖維素的生物活性，有利于細胞的粘附、貼壁、生長和繁殖，滿足組織工程支架的要求。本發(fā)明使用的激光消融技術是一種純物理的相互作用，不會進入有毒物質，交聯(lián)劑原花青素作為可食用的滋補品，安全無毒性。本發(fā)明使用的原料廉價易得，成本低。本發(fā)明在常壓下即可完成材料制備，工藝簡單，未使用任何有毒藥品，安全無毒性。


照片；圖
I是實施例I所得細菌纖維素/膠原復合材料的紅外譜2(a)是實施例I所得細菌纖維素凝膠膜的掃描電鏡(SEM)照片；
2(b)是實施例I所得細菌纖維素/膠原復合材料的掃描電鏡照片；
2(c)是實施例I所得細菌纖維素/膠原復合材料孔壁上纖維結構的掃描電鏡
3是實施例I所得細菌纖維素/膠原復合材料和細胞復合體的HE染色照片；
4是實施例I所得細菌纖維素/膠原復合材料和細胞復合體的掃描電鏡照片； 5是實施例2所得細菌纖維素/膠原復合材料和細胞復合體的HE染色照片；
6是實施例2所得細菌纖維素/膠原復合材料和細胞復合體的掃描電鏡照片； 7是實施例3所得細菌培養(yǎng)支架材料孔壁上纖維結構的掃描電鏡照片；
8是實施例3所得細菌纖維素/膠原復合材料和細胞復合體的HE染色照片；
9是細胞在實施例3所得細菌培養(yǎng)支架材料上的細胞生長(MTT)曲線。
具體實施例方式以下通過實施例講述本發(fā)明的詳細過程，提供實施例是為了理解的方便，絕不是限制本發(fā)明。實施例I :將葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鈉按質量分數(shù)分別為2. 5%U%>0. 75%,1% 依次加入燒杯中，用醋酸調節(jié)PH值至4.5，115°C高溫滅菌30min后取出，作為木醋桿菌生長的液體培養(yǎng)基。木醋桿菌菌種置于瓊脂固體培養(yǎng)基中，在4°C下冷藏保存待用。用鐵絲在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基中輕輕劃一下，立即浸入IOOml上述制得的液體培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)30h， 搖床轉速為160轉/分鐘，作為木醋桿菌種子溶液備用。
將木醋桿菌種子溶液按照體積比為6%的接種量接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中， 充分振蕩使菌液均勻，30°C恒溫靜置培養(yǎng)5天，得到細菌纖維素凝膠膜。用質量比1%的氫氧化鈉溶液清洗至乳白色，再用去離子水洗至中性。將上述制得的細菌纖維素凝膠膜放于激光器(選用JG-1080型數(shù)控激光切割機) 的操作臺上，按照孔徑為150μπκ孔間距為I. 5mm進行激光消融造孔，然后再次清洗多次， 至此制得具有微米孔道的細菌纖維素凝膠膜備用；配制100ml 2. 5g/l的膠原(美國Sigma 公司生產(chǎn))水溶液，取20g上述具有微米孔道的細菌纖維素凝膠膜放入膠原水溶液中，37°C 恒溫充分攪拌，浸泡I天；將上述處理好的凝膠膜取出，放入100ml 5g/l原花青素水溶液中，37°C恒溫攪拌2h，反應結束后，即得細菌纖維素/膠原復合材料；將上述制得的細菌纖維素/膠原復合材料取出清洗掉未反應的膠原和原花青素，清洗至不變色，做冷凍干燥滅菌處理，即得本發(fā)明產(chǎn)物細胞培養(yǎng)支架材料，備用。綜上，本發(fā)明制備細胞培養(yǎng)支架材料，首先以原花青素作為交聯(lián)劑制得細菌纖維素/膠原復合材料，最終形成具有微米孔道的細胞培養(yǎng)支架材料。將本發(fā)明細胞培養(yǎng)支架材料應用到腫瘤細胞的體外三維培養(yǎng)中，按照接種濃度為 IXio6細胞/ml的人乳腺癌231細胞，共培養(yǎng)3天，做HE染色和掃描電鏡觀察。本發(fā)明制得的具有微米孔道的細胞培養(yǎng)支架材料，是首次以原花青素作為交聯(lián)劑制得細菌纖維素/膠原復合材料。圖I顯示了細菌纖維素/膠原復合材料的紅外圖譜，譜線上出現(xiàn)了酰胺鍵的吸收峰，表明了膠原的存在，此外無其他雜質峰，證明制得了成分純凈的細菌纖維素/膠原復合材料。圖2 (a)、圖2 (b)、圖2 (c)顯示了具有微米孔道的細菌纖維素/膠原復合材料的掃描照片，顯示了復合材料的微觀形貌，可以發(fā)現(xiàn)在納米纖維表面包覆的膠原。由圖3和圖4可知，人乳腺癌231細胞在具有微米孔道的細菌纖維素/膠原復合材料之上有很好的生長狀態(tài)。實施例2:在實施例2中，將微米孔道的直徑設計為180 μ m,孔間距1mm。配制100ml 2g/l的膠原(美國Sigma公司生產(chǎn))水溶液。取20g激光消融處理的細菌纖維素凝膠膜放入膠原水溶液中，37°C恒溫充分攪拌I天。將該凝膠膜取出，放入 100ml 4g/l原花青素水溶液中，37°C恒溫攪拌2h。反應結束后，將該凝膠膜取出清洗掉未反應的膠原和原花青素，清洗至不變色，既得細菌纖維素/膠原復合材料，將該復合材料凍干滅菌后既得本發(fā)明產(chǎn)物細胞培養(yǎng)支架材料。其他制備條件同實施例I。按照接種濃度為I X IO5細胞/ml的人乳腺癌1028原代細胞，共培養(yǎng)3天，做MTT、 HE染色和掃描電鏡觀察。圖5和圖6顯示了乳腺癌1028原代細胞在實施例2中制備的支架材料上的生長狀況。實施例3 在實施例3中，將微米孔道的直徑設計為300 μ m,孔間距1mm。配制100ml 3g/l的膠原(美國Sigma公司生產(chǎn))水溶液。取20g激光消融處理的細菌纖維素凝膠膜放入膠原水溶液中，37°C恒溫充分攪拌I天。將該凝膠膜取出，放入100ml 6g/l原花青素水溶液中，37°C恒溫攪拌2h。反應結束后，將該凝膠膜取出清洗掉未反應的膠原和原花青素，清洗至不變色，既得細菌纖維素/膠原復合材料，將復合材料凍干滅菌既得本發(fā)明產(chǎn)物細胞培養(yǎng)支架材料。其他制備條件同實施例I。按照接種濃度為I X IO5細胞/ml的人乳腺癌231細胞，共培養(yǎng)7天，做MTT、HE染色和掃描電鏡觀察。圖7顯示了實施例3中支架的微米孔道，圖8顯示了乳腺癌231細胞系在實施例 3中制備的支架上的生長狀況。圖9實施例3中細胞在所制備支架上的MTT曲線。實施例4 在實施例4中，將微米孔道的直徑設計為150 μ m,孔間距1mm。配制100ml 5g/l的膠原(美國Sigma公司生產(chǎn))水溶液。取20g激光消融處理的細菌纖維素凝膠膜放入膠原水溶液中，37°C恒溫充分攪拌I天。將凝膠膜取出，放入IOOml 6g/l原花青素水溶液中，37°C恒溫攪拌2h。反應結束后，將凝膠膜取出清洗掉未反應的膠原和原花青素，清洗至不變色，既得細菌纖維素/膠原復合材料，將復合材料凍干滅菌既得本發(fā)明產(chǎn)物細胞培養(yǎng)支架材料。其他實驗條件同實施例I。按照接種濃度為I X IO4細胞/ml的病患的乳腺癌腫瘤原代細胞，共培養(yǎng)14天，做 MTT、HE染色和掃描電鏡觀察，實驗結果與上述幾個實例中變化規(guī)律類似，這里不再一一贅述。盡管上面結合圖對本發(fā)明進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式
，上述的具體實施方式
僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨的情況下，還可以作出很多變形，這些均屬于本發(fā)明的保護之內。
權利要求
1.一種細胞培養(yǎng)支架材料，其特征在于，它的組分由下列原料組成細菌纖維素凝膠膜、膠原和原花青素；所述細菌纖維素凝膠膜、膠原、原花青素的質量比 100-200 1-5 4-6;其中，所述細菌纖維素凝膠膜具有微米孔道，所述微米孔道的直徑范圍為100-300 μ m，所述微米孔道的孔間距為l-2mm。
2.根據(jù)權利要求I所述的細胞培養(yǎng)支架材料，其特征在于，所述細菌纖維素凝膠膜是由根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、木醋桿菌中的一種或幾種微生物發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性備用。
3.根據(jù)權利要求2所述的細胞培養(yǎng)支架材料，其特征在于，所述細菌纖維素凝膠膜是由木醋桿菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性， 經(jīng)激光消融造孔處理后再用堿液和去離子水多次煮沸清洗至中性備用。
4.一種細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，其特征在于，經(jīng)過如下步驟制得a.將細菌纖維素凝膠膜激光消融造孔，孔直徑為100-300μ m，孔間距為l_2mm ;b.將制得的具有微米孔道的細菌纖維素凝膠膜放入l_5g/l的膠原水溶液中，37°C恒溫浸泡O. 5-2天；c.將上述處理好的凝膠膜取出放入4-6g/l的原花青素溶液中，37°C恒溫攪拌l_3h，即得細菌纖維素/膠原復合材料；d.將制得的細菌纖維素/膠原復合材料取出，清洗干凈后，做冷凍干燥滅菌處理，即得細胞培養(yǎng)支架材料。
5.根據(jù)權利要求4所述的細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，，其特征在于，所述細菌纖維素凝膠膜是由根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、木醋桿菌中的一種或幾種微生物發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性備用。
6.根據(jù)權利要求4所述細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，其中，將細菌纖維素凝膠膜激光消融造孔是將所述細菌纖維素凝膠膜置于JG-1080型數(shù)控激光切割機下，加工直徑為 100-300 μ m的孔，孔間距為I-2mm。
7.根據(jù)權利要求4所述細胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，其中，所述細菌纖維素凝膠膜是由木醋桿菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵制得，用堿液多次煮沸清洗至乳白色再用去離子水洗至中性，激光消融處理后再用堿液和去離子水多次煮沸清洗至中性備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法，它的組分由下列原料組成細菌纖維素凝膠膜、膠原和原花青素；所述細菌纖維素凝膠膜、膠原、原花青素的質量比100-200∶1-5∶4-6；其中，所述細菌纖維素凝膠膜具有微米孔道，所述微米孔道的直徑范圍為100-300μm，所述微米孔道的孔間距為1-2mm。本發(fā)明首次用原花青素制得細菌纖維素/膠原膠復合材料，進而將其用于腫瘤細胞的體外三維培養(yǎng)。本發(fā)明提供的復合材料具有良好的力學性能、獨特的三維納米網(wǎng)絡結構、特殊的微米孔道結構以及良好的生物相容性，在結構和成分上更加滿足人們對組織工程材料的要求。本發(fā)明所用試劑安全無毒性，成本低，制備工藝簡單。
文檔編號C08J9/40GK102600507SQ201210059979
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權日2012年3月8日
發(fā)明者萬怡灶, 朱勇, 李群英, 王靜, 羅紅林 申請人:天津大學