專利名稱：一種細胞－材料單元的三維受控堆積成形方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞-材料單元的三維受控堆積成形制造組織器官雛形的工藝方法，屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體病損組織與器官的修復(fù)與替代是二十一世紀令人矚目的科學(xué)前沿。為了解決這一科學(xué)難題，組織工程技術(shù)在二十世紀八十年代中期誕生了，它的本質(zhì)在于將活的細胞通過某種方式與基質(zhì)材料或支架結(jié)合起來制造新的組織。經(jīng)過二十年左右的發(fā)展，組織工程在支架、細胞、生長因子、構(gòu)建技術(shù)、生物學(xué)評價、檢測技術(shù)與標準、臨床實驗和產(chǎn)業(yè)化等方面取得了長足的進步。但是，在構(gòu)建技術(shù)方面，細胞與基質(zhì)材料或支架的復(fù)合方法通常是采用細胞懸液浸泡或者注射裝置灌注等方法。這些方法在構(gòu)建具有復(fù)雜的功能梯度結(jié)構(gòu)的組織和器官時，存在以下缺陷一是對于比較厚的組織工程支架，細胞的遷入和繁殖不是特別的理想，血管的長入受到限制；二是不能將不同的細胞在空間準確定位與定點放置，滿足構(gòu)建組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求，然而在復(fù)雜組織器官的人工制造過程中，必須將不同細胞和材料堆積到空間指定位置并為它們之間相互作用創(chuàng)造條件。對于細胞-材料的堆積成形，必須滿足如下條件①細胞-材料混合物在成形之前呈現(xiàn)一定的流動性，便于擠壓和噴射；②噴射到指定位置后，細胞-材料的混合物能夠迅速的改變狀態(tài)，使其保持一定的形狀，具有一定的強度；③材料在擠壓、噴射之前和堆積成形之后都必須保持適合細胞生存的含大量水分、便于營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物交換過程的環(huán)境。
中國發(fā)明專利(申請?zhí)?0124985.1)公開了一種“無加熱液化過程的擠壓、噴射成形工藝方法”，該方法無法在細胞-材料的堆積成形中應(yīng)用。該方法是將材料經(jīng)過擠壓、噴射后，通過溶劑揮發(fā)、水分蒸發(fā)、同點或不同點噴射固化劑、粘接劑固化和氫鍵結(jié)合等五種方法使液態(tài)的材料固化。所謂固化，材料中就不能包含大量游離的水分，因此這種固化后的環(huán)境不適合細胞的生存。
楊洪義，陳立峰和劉海霞等發(fā)表于《電加工與模具》2004年第1期的文章“RP技術(shù)新進展細胞打印的初步研究”，雖然提出了一種細胞-材料單元的堆積成形工藝方法，但是該方法在材料制備的過程中，將細胞與凝膠混合后，進行擠壓和堆積，擠出后的細胞-凝膠材料通過固化成形。這種方法同樣基于材料固化的成形機理，固化后的環(huán)境同樣不適合細胞的生存發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的組織工程中的組織器官構(gòu)建方式，提供一種細胞-材料單元的三維受控堆積成形工藝方法，該方法在現(xiàn)有的計算機控制下的三維快速成形技術(shù)的基礎(chǔ)上，基于材料在擠壓、噴射之后的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)細胞-材料的受控堆積成形。使成形前的細胞生存在材料溶液環(huán)境中，成形后的細胞生活在含有大量水分的水凝膠環(huán)境中，保證在堆積成形之前和堆積成形之后細胞生存的適合環(huán)境，便于細胞的增殖與分化，同時成形后的結(jié)構(gòu)體又具有一定的結(jié)構(gòu)和強度，實現(xiàn)一種或多種細胞在三維空間的準確定位與裝配堆積，構(gòu)建組織器官雛形。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種細胞-材料單元的三維受控堆積成形方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1)將離子濃度敏感材料和一種或多種促進細胞黏附生長的生物可降解材料制備成水溶液，濃度為10～100g/L，其中的離子濃度敏感材料與促進細胞黏附生長的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；2)選定一種或多種細胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細胞-材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，在計算機的控制下，將所述的各種細胞-材料溶液的混合物分別通過不同的噴頭擠壓或噴射出來，形成離散的微滴、微片、微段或連續(xù)的微流狀細胞-材料單元，堆積到空間指定位置；3)在堆積過程中，細胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強度的細胞-材料凝膠；4).通過逐點逐層的堆積，得到由細胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
本發(fā)明所述的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，觸發(fā)離子為Ca離子。所述的促進細胞黏附生長的生物可降解材料采用蛋白質(zhì)、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生長因子。。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點及突出性效果1)本發(fā)明將離散/堆積成形原理應(yīng)用于細胞操作。離散堆積成形是一種在計算機驅(qū)動控制下的高度柔性的先進成形技術(shù)。將它與材料擠壓/噴射技術(shù)結(jié)合，能夠解決組織工程研究中具有復(fù)雜梯度結(jié)構(gòu)的組織器官構(gòu)建的難題。
2)將細胞等生物活體納入了工程技術(shù)可加工成形的材料范疇。本發(fā)明所采用的工藝方法可以對細胞等生物活體進行裝配堆積成形而不損傷其活性。使成形前的細胞生存在材料溶液環(huán)境中，成形后的細胞生活在含有大量水分的水凝膠環(huán)境中，保證在堆積成形之前和堆積成形之后細胞生存的適合環(huán)境，便于細胞的增殖與分化，同時成形后的結(jié)構(gòu)體又具有一定的結(jié)構(gòu)和強度，實現(xiàn)一種或多種細胞在三維空間的準確定位與裝配堆積，構(gòu)建組織器官雛形。通過這些生物活體的裝配成形，將工程制造的對象擴大到生命體的范圍，是對傳統(tǒng)的工程制造概念的重要突破。


圖1為細胞-材料溶膠的擠壓/噴射堆積成形工藝流程示意圖。
圖2為實現(xiàn)本發(fā)明的工藝方法的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
圖1為本發(fā)明的工藝路線。將離子濃度敏感材料和一種或多種促進細胞黏附生長的生物可降解材料，在室溫下制備成濃度為10～100g/L的生物材料水溶液，其中的離子濃度敏感材料與促進細胞黏附生長的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；所選擇的材料能夠溶解于水形成溶膠，具有特殊的離子濃度敏感特征，能夠在特定的離子的觸發(fā)下發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，觸發(fā)條件要在細胞的生理條件之內(nèi)，在擠壓/噴射之前保持流動態(tài)，在擠壓/噴射到目標部位后迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。
圖2為實現(xiàn)本發(fā)明的工藝方法的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。選定一種或多種細胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細胞-材料溶液的混合物；將這種混合物輸入擠壓/噴射堆積成形設(shè)備中，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。整個裝置包括若干個擠壓噴射噴頭1、2、3，三維運動平臺4，噴射驅(qū)動裝置5，成形空間和消毒裝置6；在計算機CAD模型直接驅(qū)動下，通過控制各噴頭的掃描運動與擠壓噴射運動。根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述細胞-材料溶膠的混合物通過不同的噴頭擠壓或噴射出來，形成細胞-材料單元(如微滴、微片、微段和微流等)，堆積到空間指定位置；在相應(yīng)的觸發(fā)條件下(在空間中充滿霧化的觸發(fā)劑或者噴射觸發(fā)劑)，堆積后的細胞-材料單元迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變等，形成具有一定的形態(tài)和強度的細胞-材料凝膠。通過逐點逐層的堆積，得到具有一定的結(jié)構(gòu)的組織器官雛形。
3)在堆積過程中，細胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強度的細胞-材料凝膠；4).通過逐點逐層的堆積，得到由細胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
實施例1通過該工藝方法制造的軟骨細胞-明膠-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉和促進細胞粘附生長的明膠的混合物制備成水溶液，濃度為100g/L，其中海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比為1∶10，滅菌備用；將軟骨細胞與材料溶液混合均勻，得到軟骨細胞-明膠-海藻酸鈉溶液的混合物；制備10％的氯化鈣溶液的作為觸發(fā)劑并使之在成形空間內(nèi)霧化；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過微滴噴射的方法噴射到充滿霧化觸發(fā)劑的常溫?zé)o菌成形室中；溶液在噴射到指定位置后，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成軟骨細胞-明膠-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含軟骨細胞的三維結(jié)構(gòu)。
實施例2通過該工藝方法制造的肝細胞-明膠-肝細胞生長因子-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉、促進細胞粘附生長的明膠和肝細胞生長因子的混合物制備成水溶液，濃度為30g/L，其中海藻酸鈉∶(明膠+肝細胞生長因子)為1∶0.67(質(zhì)量比)，滅菌備用；將肝細胞與材料溶液混合均勻，得到肝細胞-明膠-肝細胞生長因子-海藻酸鈉溶液的混合物；制備5％的氯化鈣溶液作為觸發(fā)劑并輸入觸發(fā)劑噴頭；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過微滴噴射的方法噴射到成形室中的指定位置，觸發(fā)劑噴頭在相同位置噴射氯化鈣溶液，使細胞-材料單元迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成肝細胞-明膠-肝細胞生長因子-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含肝細胞的三維結(jié)構(gòu)。
實施例3通過該工藝方法制造的肝細胞-內(nèi)皮細胞-明膠-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉和促進細胞粘附生長的明膠的混合物制備成水溶液，濃度為10g/L，其中海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比為1∶0.5，滅菌備用；將肝細胞和內(nèi)皮細胞分別與與材料溶液混合均勻，得到兩種細胞-明膠-海藻酸鈉溶液的混合物；將兩種混合物分別輸入不同的噴頭；制備20％的氯化鈣溶液作為觸發(fā)劑輸入專用的觸發(fā)劑噴頭；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過微滴噴射的方法噴射到制定位置后，觸發(fā)劑噴頭在相同的位置噴射氯化鈣溶液，細胞-材料溶液的混合物迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成細胞-明膠-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含有準確定位的肝細胞和內(nèi)皮細胞的三維結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種細胞-材料單元的三維受控堆積成形方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1)將離子濃度敏感材料和一種或多種促進細胞黏附生長的生物可降解材料，制備成水溶液，濃度為10～100g/L，其中的離子濃度敏感材料與促進細胞黏附生長的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；2)選定一種或多種細胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細胞-材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，在計算機的控制下，將所述各種細胞-材料溶液的混合物分別通過不同的噴頭擠壓或噴射出來，形成離散的微滴、微片、微段或連續(xù)的微流狀細胞-材料單元，堆積到空間指定位置；3)在堆積過程中，細胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強度的細胞-材料凝膠；4)通過逐點逐層的堆積，得到由細胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
2.按照權(quán)利要求1所述的三維受控堆積成形方法，其特征在于所述的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，觸發(fā)離子為Ca離子。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的三維受控堆積成形方法，其特征在于所述的促進細胞黏附生長的生物可降解材料采用蛋白質(zhì)、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生長因子。
全文摘要
一種細胞—材料單元的三維受控堆積成形方法，該方法將離子濃度敏感材料和一種或多種促進細胞黏附生長的生物可降解材料制成水溶液，滅菌；然后選定一種或多種細胞，分別與滅菌的溶液混合，制成細胞—材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和路徑，將各種細胞—材料溶液的混合物分別通過不同的噴頭擠壓或噴射出來，形成細胞—材料單元，堆積到空間指定位置；在相應(yīng)的觸發(fā)條件下，形成一定形態(tài)和強度的細胞—材料凝膠；通過逐點逐層的堆積，得到具有一定的結(jié)構(gòu)的組織器官雛形。本發(fā)明基于快速成形制造的離散/堆積的基本原理，實現(xiàn)一種或多種細胞在三維空間的準確定位與成形，對細胞等生物活體進行裝配堆積成形而不損傷其活性，便于細胞的增殖與分化。
文檔編號C12N11/04GK1609210SQ20041000978
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者顏永年, 熊卓, 王小紅, 林峰, 吳任東, 張人佶, 盧清萍 申請人:清華大學(xué)