專利名稱：一種水溶性雙光子熒光聚合物納米粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水溶性雙光子熒光聚合物納米粒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
相比于傳統(tǒng)的單光子突光顯微鏡，雙光子突光(TPF)顯微鏡具有近紅外光激發(fā)、 降低光損傷和光漂白、穿透深、信噪比好等優(yōu)勢，近年來已成為生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的常用工具。以傳統(tǒng)的熒光材料(如熒光素、香豆素等)為基礎(chǔ)的熒光探針雖然也可以用于TPF成像，但由于它們的雙光子吸收偏小，使用時需用高強(qiáng)度激光激發(fā)以獲得足夠強(qiáng)的 TPF，易造成生物樣品熱損傷，這大大削弱了 TPF顯微技術(shù)優(yōu)勢的發(fā)揮。因此合成新的具有優(yōu)良性能的TPF材料成為了研究的熱點。有機(jī)分子因有好的可設(shè)計性和可裁接性而成為強(qiáng)TPF材料的研究重點。為了獲得大的雙光子吸收截面，一方面可設(shè)計合成新的線性雙光子吸收化合物，如已報道的以芴、聯(lián)苯、萘等為連接橋的D- -A、D- -D、A- -A(A和D分別代表電子受體和電子給體，π指共軛橋)等線型分子的結(jié)構(gòu)；另一方面可在不發(fā)生分子間聚集的條件下提高發(fā)色團(tuán)的數(shù)密度，設(shè)計合成含雙光子吸收基團(tuán)的多分支結(jié)構(gòu)，如以三苯胺、芳環(huán)或稠環(huán)芳烴等為中心的多枝分子。(錢鷹，林保平，孫岳明，肖國民，精細(xì)化工，2006，23 (12) ,1155-1158 ；Pawlicki M， Collins HA,Denning RG, Anderson HL,Angew Chem Int Ed Engl. 2009,48(18) :3244-66. Kimw H M, Cho B R, Chem. Commun. ,2009,153-164)。但現(xiàn)已報道的強(qiáng) TPF 化合物多數(shù)水溶性差，大大限制了它們在生物體系中的應(yīng)用。獲得具有水溶性的雙光子熒光材料對TPF探針的開發(fā)具有重要意義。納米技術(shù)日益成為當(dāng)今世界科學(xué)技術(shù)向前發(fā)展的主導(dǎo)技術(shù)。將小分子TPF材料與納米材料相結(jié)合，如負(fù)載TPF小分子的納米?；蛉玖闲》肿幼跃奂纬杉{米粒,利用形成的納米結(jié)構(gòu)控制、影響并提高材料的性能，并使之得到更好的應(yīng)用是TPF材料發(fā)展的一個重要方向(Tsuboi Y, Shimizu R, Shoji T, Kitamura N, Anal Sci，2010，26，1241-1245. Wu WB ；Liu C ；ffang ML ;Huang W ;Zhou SR Jiang W ；Sun YM ；Cui YP ；Xu CX. J Solid State Chem,2009,182(4), 862-868 !Enhancement of 2-photon absorption of a dye in a polymer microsphere based on an optical cavity effect. Y Tsuboi, R Shimizu, T Shoji, N Kitamura，Anal. Sci. ,2010,26 :1241-1245)。但以包埋熒光分子或染料小分子自聚集方式獲得的熒光納米粒易發(fā)生熒光分子泄露，影響其穩(wěn)定性。另外已報道的用于包埋 TPF小分子的納米粒多為無機(jī)納米材料，它們的水溶性及表面可修飾性能較差。聚合物納米粒的研究日益受到生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重視?；诰酆衔锏挠袡C(jī)TPF納米材料較易通過調(diào)節(jié)納米粒的組成改善其水溶性及提供表面可修飾基團(tuán)，但相關(guān)的研究報道很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水溶性雙光子熒光聚合物納米粒及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明用萘酰亞胺熒光團(tuán)接枝水溶性聚丙烯酸(PAA)形成兩親性聚合物，然后在溶液中自組裝形成熒光納米粒。具體制備過程為在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，聚丙烯酸與二氯亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng)制備聚丙烯酰氯，然后再與4- (2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-I，8-萘酰亞胺在35-40°C反應(yīng)5h ;然后將反應(yīng)液放入透析袋，透析袋置于蒸餾水中透析，透析完成后將透析袋內(nèi)液體冷凍干燥得目標(biāo)納米粒。作為一種優(yōu)選的方案，所述聚丙烯酸的數(shù)均分子量在O. 8-2. 6萬。添加的4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1，8-萘酰亞胺中氨基與聚丙烯酸中羧基的摩爾比為I : I 2。本發(fā)明的萘酰亞胺/PAA熒光納米粒，它是由疏水性萘酰亞胺熒光團(tuán)接枝水溶性聚丙烯酸聚合物，形成兩親性聚合物，然后在溶液中自組裝形成具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光納米粒。具有如下優(yōu)點I)無染料泄露的問題。萘酰亞胺熒光團(tuán)以化學(xué)鍵合的方式與PAA相連而不易泄露。2)溶于水，且在水溶液中具有在800nm強(qiáng)雙光子吸收，500-570nm波段強(qiáng)熒光發(fā)射的優(yōu)良光學(xué)性能。3)實用性。納米粒能進(jìn)入細(xì)胞，且在雙光子激發(fā)下顯示較強(qiáng)的熒光；其具有活性基團(tuán)，易于進(jìn)行不同的修飾，在開發(fā)用于雙光子熒光顯微成像、生物檢測和識別領(lǐng)域的TPF 納米探針方面有應(yīng)用潛力。


圖I是實施例I獲得的納米粒的透射電子顯微鏡照片。圖2是實施例I獲得的納米粒的單光子激發(fā)和發(fā)射光譜。圖3是實施例I獲得的納米粒的雙光子熒光發(fā)射光譜(800nm激光激發(fā))。圖4是實施例I獲得的納米粒在活性Hela細(xì)胞內(nèi)的顯微成像照片(a :明場；b 800nm激光激發(fā)雙光子共聚焦)。
具體實施例方式下面的實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而非限定本發(fā)明的范圍。實施例I :聚丙烯酸(數(shù)均分子量2. 6萬)O. 5g溶于DMF中，滴加2. 3mL的氯化亞砜，保持體系溫度35°C-40°C。滴完后繼續(xù)反應(yīng)I小時左右。將反應(yīng)體系抽真空，至無氣泡冒出。取 4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1,8-萘酰亞胺(按氨基羧基=I : 1，摩爾比)緩慢加入到所制聚丙烯酰氯中，控制反應(yīng)溫度40°C以下攪拌反應(yīng)。5h后，靜置過夜，然后用蒸餾水進(jìn)行透析(透析袋截留分子量8000)。用熒光光度計測定透析袋外透析液的在530nm(438nm 激發(fā)光)下的熒光強(qiáng)度，至熒光強(qiáng)度為O時停止透析，將透析袋內(nèi)液體冷凍干燥得目標(biāo)納米粒。透射電鏡(JEM-100CXH，日本電子)對納米粒的形態(tài)進(jìn)行表征，如圖I所示納米粒為球形，粒徑25-50nm。島津UVmini_1240紫外可見分光光度計檢測紫外吸收光譜，表明納米粒在438nm具有最大吸收波長；島津RF5300熒光光譜儀記錄納米粒的熒光光譜，結(jié)果如圖2。納米粒最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為438nm和530nm。由于小分子熒光團(tuán)已經(jīng)透析除去，因此上述結(jié)果說明萘酰亞胺熒光團(tuán)已經(jīng)和PAA發(fā)生接枝反應(yīng)。實施例2 4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1，8-萘酰亞胺與數(shù)均分子量為O. 8萬的聚丙烯酸(按氨基羧基=I 1，摩爾比)發(fā)生接枝反應(yīng)，制備和表征方法同實施例I。結(jié)果表明，納米粒具有和實施例I納米粒相同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長。實施例3 4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1，8-萘酰亞胺與數(shù)均分子量為2. 6萬的聚丙烯酸(按氨基羧基=I 2，摩爾比)發(fā)生接枝反應(yīng)，制備和表征方法同實施例I。結(jié)果表明，納米粒具有和實施例I納米粒相同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長。實施例4 實例I獲得的納米粒在800nm激光激發(fā)下的雙光子熒光光譜如圖3所示。雙光子突光光譜的激發(fā)源是一臺鎖模飛秒Ti藍(lán)寶石激光器(Mira900, Coherent Inc. , Santa Clara, CA)，激光脈沖寬度120fs，重復(fù)頻率80Hz。雙光子熒光光譜用液氮制冷的CXD探測器(SPEC-10, Princeton Instruments, Trenton, NJ)記錄。實施例5 納米粒的細(xì)胞染色及雙光子熒光成像Hela細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清培養(yǎng)液中，在35°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞成長到對數(shù)期，接種于含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞爬片生長。將接種好的細(xì)胞爬片用PBS清洗后，用O. 01mg/ml的納米粒溶液染色細(xì)胞30min。染色后的玻片取出，洗去多余染液，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上，在雙光子激光共聚焦熒光顯微鏡下(800nm激發(fā))觀察成像效果。圖4是實施例I獲得的納米粒在活性Hela細(xì)胞內(nèi)的顯微成像照片(a 明場；b 800nm激光激發(fā)雙光子共聚焦)。
權(quán)利要求
1.一種水溶性雙光子熒光聚合物納米粒，其特征在于該熒光納米粒制備過程為在N，N-二甲基甲酰胺中，聚丙烯酸與二氯亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng)制備聚丙烯酰氯，然后再與4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1，8-萘酰亞胺在35-40°C反應(yīng)5h ；然后將反應(yīng)液放入透析袋，透析袋置于蒸餾水中透析，透析完成后將透析袋內(nèi)液體冷凍干燥得目標(biāo)納米粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水溶性雙光子熒光聚合物納米粒，其特征在于，制備過程中所用的聚丙烯酸的數(shù)均分子量在O. 8-2. 6萬。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的水溶性雙光子熒光聚合物納米粒，其特征在于，制備過程中所添加的4-(2-氨基乙基)氨基-N-正丁基-1，8-萘酰亞胺中氨基與聚丙烯酸中羧基的摩爾比為I: 1 2。
4.權(quán)利要求f3所述熒光聚合物納米粒在雙光子熒光顯微成像、生物檢測或識別領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于有機(jī)聚合物的水溶性雙光子熒光納米粒及其應(yīng)用。它是由疏水性萘酰亞胺熒光團(tuán)接枝水溶性聚丙烯酸聚合物，形成兩親性聚合物，然后在溶液中自組裝形成具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光納米粒。該納米粒具有水溶性，在800nm具有強(qiáng)雙光子吸收，500-570nm好的雙光子熒光發(fā)射性能，且具有供修飾的活性基團(tuán)，可用于顯微成像、生物檢測和識別等領(lǐng)域。
文檔編號C08F8/32GK102585060SQ201210040270
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者付婷, 梁淑彩, 鄢國平, 陳小慧, 項瑾, 高晨 申請人:武漢大學(xué)