專利名稱：一種金絲小棗酸性多糖提取及結(jié)構(gòu)表征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物多糖提取及其結(jié)構(gòu)表征，具體地說，涉及一種金絲小棗酸性 多糖的提取及其結(jié)構(gòu)表征，屬于功能食品生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，是多種中草藥的有效成分之一，具有 多種生物活性，它能提高機(jī)體的免疫功能，是理想的免疫增強(qiáng)劑，而對正常細(xì)胞沒有毒副作 用。目前，全球至少有12種以上的多糖正在用于臨床試驗(yàn)，分別用于抗腫瘤、抗病毒、抗衰 老等藥物的研究中，1997年全球從植物中提取的糖類藥物的銷售額達(dá)73億美元。隨著多 糖的制備、結(jié)構(gòu)、合成、藥理學(xué)及臨床學(xué)研究的不斷深入，多糖藥物將具有更廣闊的前景。因 此，開發(fā)多糖類藥物已成為當(dāng)今世界新藥研制的熱點(diǎn)之一。棗(Zizyphus jujuba Mill.)別名大棗、良棗、紅棗,為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬 (Ziziphus Mill.)落葉喬木。它是我國最古老的果樹之一，與桃、李、杏、梅一起被譽(yù)為“中 國五大名果”。棗不僅是一種滋補(bǔ)佳品，而且也是一味傳統(tǒng)的中藥，因富含營養(yǎng)和保健成分 而享譽(yù)中外，為我國傳統(tǒng)藥食兼用果品。我國古醫(yī)學(xué)對紅棗的營養(yǎng)、保健價值早已作了十分 精辟的闡述，認(rèn)為它具有補(bǔ)血健腦、補(bǔ)脾益胃、養(yǎng)心安神、緩和藥性等功效?，F(xiàn)代藥理研究還 表明，它具有抗衰老、抗腫瘤、抗變態(tài)反應(yīng)、鎮(zhèn)靜、保肝、抗炎等多方面藥理作用。棗的諸多功 效是與其成分密切相關(guān)的。近年來，研究表明，紅棗除含有豐富的維生素及Ca、P、Fe等礦物 質(zhì)元素，還含有生理活性極高的多糖。目前，隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，棗越來越引起科技工作者的興趣，并日益增進(jìn) 了對棗藥用價值的認(rèn)識。社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，人們的保健意識逐步增 強(qiáng)，越來越要求食品向綠色型、環(huán)保型發(fā)展。本專利通過對金絲小棗酸性多糖的提取及其結(jié) 構(gòu)表征，為開發(fā)出藥理清晰、藥效明確，便于質(zhì)量監(jiān)控的新藥提供有力的技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金絲小棗酸性多糖的提取方法。本發(fā)明研究亞臨界水 和超聲微波相結(jié)合提取金絲小棗多糖的方法，以金絲小棗為原料，經(jīng)過去核、烘干、粉碎、醇 洗去雜、亞臨界水和超聲微波相結(jié)合萃取、聚酰胺脫色和柱層析后得到金絲小棗酸多糖。本發(fā)明同時對金絲小棗酸性多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，一種金絲小棗酸性多糖是由 —4)-a -GalpAd —通過 0-4 位與一2)-a -Rhap (1 —、一 2，4) - α-Rhap (1 —連接形成主 鏈，其中41. 85%半乳糖醛酸羧基被甲酯化，主鏈中的一2，4) - α -Rhap (1 —通過0_4與其它 糖殘基連接形成支鏈；一6)-β -Galp(l —、一 5)-a -Araf (1 —聚合形成半乳聚糖和阿拉伯 聚糖是金絲小棗酸性多糖側(cè)鏈的主要組成，其支鏈通過Gal殘基和Ara殘基的0_1位與主 鏈的Rha殘基的0-4相連。側(cè)鏈一6) - β -Galp (1 —構(gòu)成的半乳聚糖通過0_3、0-4產(chǎn)生分 支，側(cè)鏈一5)-a-Araf(l —構(gòu)成的阿拉伯聚糖通過0_3產(chǎn)生分支。本發(fā)明的技術(shù)解決方案流程見

圖1，工藝要點(diǎn)如下
1.原料粉碎以金絲小棗為原料進(jìn)行粉碎處理，粉碎粒度80-100目。2.乙醇回流去雜將上述金絲小棗用95%工業(yè)酒精在70°C回流3次，每次2h，以鈍化金絲小棗的內(nèi)源性酶并去除部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)醇溶性成分，離心去除上清液，沉淀在70°C烘箱 干燥3小時，得到金絲小棗粉。3.亞臨界水提取準(zhǔn)確稱取上述干燥后的金絲小棗粉，以水作為溶劑，料液比為1 15-1 25 (g/ mL)，提取溫度為150-180°C，提取時間為5-10min。4.超聲微波萃取離心后的沉淀加水后，超聲-微波萃取，超聲功率50W，微波功率260-300W，提取時 間 8-15min，料液比 1 10-1 20。5.脫色上清液合并加入聚酰胺進(jìn)行攪拌30min進(jìn)行脫色，然后于4000r/min條件下離心 10-12分鐘，收集，上清液加工業(yè)酒精調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，離心后沉淀依次用無 水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，即為金絲小棗粗多糖。5.層析將金絲小棗粗多糖過陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 4. 5 X 35cm)，用0_1. 5mol/L NaCL (配制于醋酸鹽緩沖液)進(jìn)行線性梯度洗脫，苯酚-硫酸 法跟蹤檢測多糖含量(OD49tl)。分別收集最大組分的酸性粗多糖。然后過凝膠過濾層析柱 Sepharose CL-6B，收集第三個組分，得金絲小棗酸性多糖。金絲小棗酸性多糖組分。金絲 小棗酸性多糖經(jīng)凝膠層析、HPLC及瓊脂糖電泳三種方法都鑒定為均一性組分。6.金絲小棗酸性多糖結(jié)構(gòu)表征(1)金絲小棗酸性多糖其單糖組成金絲小棗酸性多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，其摩爾比為 1 2. 13 19. 3，半乳糖是主要成分，占總中性糖的38.8%，其糖醛酸的含量為67. 59%。(2)金絲小棗酸性多糖部分酸水解分析0. l、0.5mol/L酸水解產(chǎn)物中都含有半乳糖，表明半乳糖以較高的聚合度與主鏈 相連，0. 01,0. lmol/L酸水解產(chǎn)物中存在葡萄糖，而0. 5、2mol/L酸水解產(chǎn)物中不存在葡萄 糖，表明葡萄糖可能位于金絲小棗酸性多糖多糖支鏈非還原性末端。阿拉伯糖主要存在于 0. lmol/L酸水解產(chǎn)物中，表明阿拉伯糖位于金絲小棗酸性多糖多糖支鏈末端。鼠李糖主要 存在于截留液中，表明鼠李糖位于金絲小棗酸性多糖多糖主鏈。(3)金絲小棗酸性多糖酯化度分析果膠的酯化度(DE)與A1730/ (A1730+A1630)呈良好的線性關(guān)系(R2 = 0. 9862)。 通過紅外測定，經(jīng)計算可知金絲小棗酸性多糖的酯化度為41. 85%。(4)金絲小棗酸性多糖甲基化分析金絲小棗酸性多糖經(jīng)甲基化、水解、還原、和乙酰處理后進(jìn)行GC-MS分析，對其甲基化碎片中摩爾含量較高的峰進(jìn)行歸屬，甲基化分析結(jié)果見表1。表1金絲小棗酸性多糖的甲基化分析(mol. % )
權(quán)利要求
1.一種金絲小棗酸性多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，其摩爾比為 1 2. 13 19. 3，半乳糖是主要成分，占總中性糖的38.8%，其糖醛酸的含量為67.59% ；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于主要是一4)GalpA(l —，一 3， 6)Galp(l —，一 4，6)Galp(l —，一 3)Araf(l —，一 6)Galp(l — ,Araf (1 —，Galp(l —，一 5) Araf(l —，― 2) Rhap(l —，― 3, 5) Araf (1 —，― 4)Galp(l —，― 2，4) Rhap (1 —組成；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于GalpA殘基是金絲小棗酸性多 糖的主要單元，以1 — 4連接方式存在；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于Gal殘基以1—、1 — 6、1 — 3， 6、1 — 4，6、1 — 4連接方式存在，78. 3%的Gal以1 — 6連接，其中在一6)Gal (1 —中，76. 9% 的有分支，表明其分支度相對較高；51. 7%的分支在3位上，25. 7%的分支在4位上；
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于一6)Gal (1 —中有分支， 51. 7%的分支在3位上，25. 7%的分支在4位上；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于Ara殘基以1—、1 — 5、1 — 3， 5、1 — 3連接方式存在，它們的摩爾比2. 05 1.60 1.61 2.32;
7.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于Ara殘基42.4%以1 — 5 鍵連接，其中近一半的一5) Araf(l —在3位上有分支；
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其特征在于Rha殘基以1— 2連接方式存 在，其中26. 3%在4位上有分支；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述金絲小棗酸性多糖，其提取方法亞臨界水和超聲微波相結(jié)合進(jìn)行；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征是金絲小棗的預(yù)處理以金絲小棗為原料 進(jìn)行粉碎處理，粉碎粒度為80-100目；
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于亞臨界水提取金絲小棗酸性多糖的 條件為料液比為1 15-1 25(g/mL)，提取溫度為150-180°c，提取時間為5-lOmin ；
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于超聲_微波萃取，超聲功率50W，微波 功率260-300W，提取時間8-15min，料液比1 10-1 20。
全文摘要
本發(fā)明公開一種金絲小棗酸性多糖是由→4)-α-GalpA(1→通過O-4位與→2)-α-Rhap(1→、→2，4)-α-Rhap(1→連接形成主鏈，其中41.85％半乳糖醛酸羧基被甲酯化，主鏈中的→2，4)-α-Rhap(1→通過O-4與其它糖殘基連接形成支鏈；→6)-β-Galp(1→、→5)-α-Araf(1→聚合形成半乳聚糖和阿拉伯聚糖是金絲小棗酸性多糖側(cè)鏈的主要組成，其支鏈通過Gal殘基和Ara殘基的O-1位與主鏈的Rha殘基的O-4相連。其主要制備過程為金絲小棗去核、烘干、粉碎、醇洗去雜、亞臨界水和超聲微波相結(jié)合萃取、聚酰胺脫色，洗脫液進(jìn)行濃縮，經(jīng)陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow和凝膠過濾層析柱Sepharose CL-6B分離得到金絲小棗酸性多糖。
文檔編號C08B37/00GK102079792SQ20101058010
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者李進(jìn)偉, 范柳萍 申請人:江南大學(xué)