專利名稱：酸性蘆薈多糖及其制備純化方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及酸性蘆薈多糖的制備、純化以及在制備
抗幽門螺旋桿菌黏附藥物和治療幽門螺旋桿菌引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
二背景技術(shù)：
蘆薈自古以來就被作為一種藥食兩用植物而廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理研究表明蘆薈具 有殺菌、消炎、瀉下、抗氧化、抗輻射、抗?jié)円约翱鼓[瘤等作用。據(jù)國內(nèi)外的研究報(bào)道，蘆 薈所含的活性成分有兩大類，一類是存在于蘆薈葉片底部及表皮附近的蘆薈素等蒽醌類物 質(zhì)，另一類是從蘆薈鮮葉薄壁管胞中分離出的蘆薈凝膠，其中約98. 5%是天然水分，而碳水 化合物——粘多糖則約占總固體量的60%以上。作為蘆薈凝膠的主要有效成分之一的蘆薈 多糖，其藥理學(xué)研究也逐漸活躍。近年來的研究表明，蘆薈多糖具有抗衰老、抗輻射、抗胃潰
瘍、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。因此，蘆薈多糖對(duì)于這些相關(guān)疾病具有潛在的預(yù)防
或治療作用。但目前尚未見其在抵抗幽門螺旋桿菌等細(xì)菌黏附方面的研究報(bào)道。 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種革蘭氏陰性、S形或弧形彎曲的細(xì)菌。
許多證據(jù)顯示胃十二指腸疾病和幽門螺桿菌之間有緊密聯(lián)系，可誘發(fā)人類的慢性胃炎、消
化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)性淋巴樣組織淋巴瘤、腸性胃癌。世界衛(wèi)生組織已將幽門螺桿菌列為
I類致癌物，它是胃癌的主要誘發(fā)因子。目前幽門螺旋桿菌的治療方案主要是采用三聯(lián)療
法，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株的發(fā)生率逐漸增加導(dǎo)致治療失敗。 研究證明，細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附是引起后期一系列病理變化并引發(fā)相關(guān)疾病的
關(guān)鍵步驟?？桂じ絼┛勺钄噙@一關(guān)鍵步驟，從而預(yù)防和治療細(xì)菌感染造成的疾病。與傳統(tǒng)
殺菌劑相比，抗黏附劑不直接殺死細(xì)菌，這樣就有效防止了耐藥菌株的產(chǎn)生。本發(fā)明中的酸
性蘆薈多糖阻斷幽門螺旋桿菌與宿主細(xì)胞的黏附過程，與傳統(tǒng)的抗菌治療相比具有不易產(chǎn)
生耐藥菌株的特點(diǎn)，是一種治療或預(yù)防幽門螺旋桿菌引起的相關(guān)疾病的新手段。同時(shí)，它也
可以抑制大腸桿菌的黏附，顯示出一定的廣譜抗黏附效果。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題 本發(fā)明致力解決酸性蘆薈多糖的制備、純化以及在制備抗幽門螺旋桿菌黏附藥物 和治療幽門螺旋桿菌感染引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案 (1)本發(fā)明所述的酸性蘆薈多糖，是采用水提醇沉法從中華蘆薈中提取并經(jīng) DEAE-52陰離子交換樹脂純化的方法制備得到，其分子量約為29. 39KDa，單糖組成主要有 37%半乳糖、15.3%阿拉伯糖、9%鼠李糖、7. 1%甘露糖、3.7%葡萄糖以及1.4%木糖，并含 有25.6%的糖醛酸； (2)酸性蘆薈多糖制備純化方法是以中華蘆薈為原料，采用熱水提取，乙醇沉淀的 方法得到粗提物，通過熱水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖。再經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析純化得到酸性蘆薈多糖； (3)本發(fā)明中的酸性蘆薈多糖可以顯著降低幽門螺旋桿菌對(duì)MKN 45細(xì)胞的黏附 率，并呈一定的劑量相關(guān)，可在開發(fā)抗幽門螺旋桿菌黏附藥物以及治療幽門螺旋桿菌感染 引起的相關(guān)疾病中應(yīng)用。 (4)本發(fā)明中的酸性蘆薈多糖還可以顯著降低大腸桿菌對(duì)LOVO細(xì)胞的黏附率， 顯示本發(fā)明中的多糖具有廣譜的抗黏附效果，可以在制備針對(duì)其他細(xì)菌的抗黏附藥物中應(yīng) 用。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是 (1)本發(fā)明以中華蘆薈為原料，采用熱水提取，乙醇沉淀的方法得到粗提物，通過 熱水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖。再經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析純化 得到酸性蘆薈多糖，該方法具有產(chǎn)物純度高、產(chǎn)率較大、設(shè)備要求簡單、重現(xiàn)性較好的特點(diǎn)， 為酸性蘆薈多糖的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和依據(jù)； (2)本發(fā)明以制備的酸性蘆薈多糖為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用藥理學(xué)、生物學(xué)方法，揭 示了酸性蘆薈多糖可以顯著降低幽門螺旋桿菌對(duì)MKN 45細(xì)胞的黏附率，并呈一定的劑量 相關(guān)，可在開發(fā)抗幽門螺旋桿菌及大腸桿菌黏附藥物中應(yīng)用。并能成為一種潛在的抗細(xì)菌 黏附藥物。 (3)此外，本發(fā)明中的酸性蘆薈多糖還可以顯著降低大腸桿菌對(duì)LOVO細(xì)胞的黏附 率，顯示本發(fā)明中的多糖具有廣譜的抗黏附效果。并能成為一種潛在的廣譜性抗黏附藥物。
四

圖1 :酸性蘆薈多糖提取、分離及純化流程圖。 圖2 :酸性蘆薈多糖對(duì)幽門螺旋桿菌黏附MKN45細(xì)胞的抑制效果。對(duì)照組未經(jīng)酸 性蘆薈多糖處理，其幽門螺旋桿菌黏附率作為100%。其他組分別與對(duì)照組相比，得到相對(duì) 黏附率(％)。數(shù)據(jù)經(jīng)過T檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，p〈0.05被認(rèn)為存在顯著性差異。其中， *p < 0. 05， **p < 0. 01， ***p < 0. 001。
圖3 :酸性蘆薈多糖對(duì)大腸桿菌黏附LOVO細(xì)胞的抑制效果。對(duì)照組未經(jīng)酸性蘆薈多糖 處理，其大腸桿菌黏附率作為100%。其他組分別與對(duì)照組相比，得到相對(duì)黏附率(％ )。數(shù) 據(jù)經(jīng)過T檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，p < 0. 05被認(rèn)為存在顯著性差異。其中，< 0. 001。
五具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)施
例的任何限制。 材料與來源 試劑乙醇(南京化學(xué)試劑公司)；苯酚(天津市化學(xué)試劑一廠)；三氯乙酸(上海 凌峰化學(xué)試劑有限公司)；硫酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；FITC (SIGMA公司)；氯化鈉(南 京化學(xué)試劑公司)；1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Columbia培養(yǎng)基(biom6rieux， France);瓊 脂粉(上海醫(yī)藥化工集團(tuán))；酵母浸膏(南京大治生物技術(shù)有限公司)。 材料幽門螺旋桿菌(美國菌種保存中心)；大腸桿菌(南京大學(xué)功能生物分子研 究所)。 器材UV-2201紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；BSZ-IOO自動(dòng)部份收集器(上海 滬西分析儀器廠有限公司)；酶標(biāo)儀(TECAN公司)。
實(shí)施例1酸性蘆薈多糖的制備和純化 (1)新鮮的蘆薈葉片切碎后，經(jīng)過熱水提取，乙醇沉淀后得到粗提物。稱取適量的 粗提物，用50 70 %乙醇浸泡兩次，每次24 48h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，攪拌溶于適量蒸餾 水，離心除去不溶物質(zhì)。上清液中加入三氯乙酸除蛋白，靜置過夜后離心取上清，重復(fù)上述 操作。上清減壓濃縮后加入95%乙醇靜置過夜后離心，沉淀烘干后得白色或淺黃色塊狀固 體，即為蘆薈粗多糖。 (2)蘆薈粗多糖經(jīng)過離子交換柱層析純化得到酸性蘆薈多糖。采用DEAE-52陰離 子交換樹脂，首先使用蒸餾水洗脫，之后采取O. 1 0. 4M NaCl洗脫，收集洗脫液，苯酚硫酸 法測定每管洗脫液中多糖含量，合并洗脫液，濃縮、透析、凍干即得本發(fā)明的精制酸性蘆薈 多糖。該法重現(xiàn)性好、產(chǎn)率穩(wěn)定，可為后續(xù)試驗(yàn)提供樣品。流程圖見附圖l。
實(shí)施例2酸性蘆薈多糖對(duì)幽門螺旋桿菌黏附MKN 45細(xì)胞的抑制作用 (1)幽門螺旋桿菌劃線法接種在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上(含有7%新鮮羊血)，于
37t:微需氧環(huán)境下培養(yǎng)3天。之后刮取菌落置于滅菌的生理鹽水中，調(diào)菌液為適當(dāng)濃度。
向調(diào)制好濃度的菌液中加入FITC-DMS0溶液，室溫孵育1 3h。然后將標(biāo)記好的菌懸液離
心，倒出上清，加入含有吐溫-20的D-Hanks溶液反復(fù)吹打數(shù)次，繼續(xù)離心，重復(fù)以上操作2
次，洗去未標(biāo)記上的FITC。 (2)將培養(yǎng)在96孔板中的MKN45細(xì)胞原培養(yǎng)液棄去，換上2%小牛血清及含有不 同濃度酸性蘆薈多糖的1640培養(yǎng)液。每12個(gè)孔一組，酸性蘆薈多糖的含量分別為0、0. 01、 0. 1、0.5、1.0mg/ml，37。C中預(yù)孵lh。之后，在避光條件下向?qū)?yīng)的孔中每孔加入50 yl的 已經(jīng)標(biāo)記的菌液輕輕搖晃混勻，37t:避光孵育lh。然后，棄去含有菌和藥物的培養(yǎng)液，洗 去未黏附的細(xì)菌，于熒光酶標(biāo)儀測定每孔的熒光量，其中激發(fā)波長為485nm，而發(fā)射波長為 528nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。 圖2結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，酸性蘆薈多糖在濃度為0. 1、0. 5、以及1. 0mg/ml時(shí) 幽門螺旋桿菌對(duì)MKN45細(xì)胞的黏附率分別降至88X (p<0.05)，76% (p<0.01)以及64% (p < 0. 001)。 實(shí)施例3酸性蘆薈多糖對(duì)大腸桿菌黏附L0V0細(xì)胞的作用 L0V0細(xì)胞用含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，種96孔板培養(yǎng)。大 腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后刮取菌落，按照上述方法用FITC標(biāo)記。將在96孔板中培 養(yǎng)24h后的L0V0細(xì)胞原培養(yǎng)液棄去，每12孔一組，分別加入酸性蘆薈多糖含量分別為0、 0. 01 、0. 1、0. 5、1. Omg/ml和2%小牛血清的1640培養(yǎng)基，孵育lh。之后加入FITC標(biāo)記的大 腸桿菌孵育lh后，洗去未黏附的細(xì)菌，酶標(biāo)儀測定熒光值。結(jié)果見圖3。
圖3結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，酸性蘆薈多糖在濃度為0.5和1.0mg/ml時(shí)大腸桿 菌對(duì)L0V0細(xì)胞的黏附率分別降至78% (p < 0. 001)和68% (p < 0. 001)。
權(quán)利要求
一種酸性蘆薈多糖，其特征是采用水提醇沉法從中華蘆薈中提取并經(jīng)DEAE-52陰離子交換樹脂純化的方法制備得到的酸性蘆薈多糖，分子量約為29.39KDa，單糖組成主要有37％半乳糖、15.3％阿拉伯糖、9％鼠李糖、7.1％甘露糖、3.7％葡萄糖以及1.4％木糖，并含有25.6％的糖醛酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酸性蘆薈多糖的制備純化方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1) 新鮮的蘆薈葉片切碎后，經(jīng)過熱水提取，乙醇沉淀后得到粗提物，蘆薈多糖粗提物， 用50 70%乙醇浸泡2次，每次24 48h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，溶于蒸餾水中，離心除去不溶 物質(zhì)，上清液中加入三氯乙酸除蛋白，靜置過夜后離心取上清，并重復(fù)上述操作，上清減壓 濃縮后加入95%乙醇靜置過夜后離心，沉淀烘干后得白色或淺黃色塊狀固體，即為蘆薈粗 多糖；(2) 蘆薈粗多糖經(jīng)過離子交換柱層析純化得到酸性蘆薈多糖，采用DEAE-52陰離子交 換樹脂，首先使用蒸餾水洗脫，之后采取0. 1 0. 4M NaCl溶液洗脫，收集洗脫液后，苯酚硫 酸法測定每管洗脫液中多糖含量，合并洗脫液，濃縮、透析、凍干即得本發(fā)明的精制酸性蘆 薈多糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酸性蘆薈多糖在制備抗幽門螺旋桿菌黏附藥物以及治療幽 門螺旋桿菌感染引起的相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酸性蘆薈多糖在制備針對(duì)大腸桿菌及其他革蘭氏陰性菌的 抗黏附藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酸性蘆薈多糖的制備、純化以及其在抗幽門螺旋桿菌及大腸桿菌藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所涉及的以中華蘆薈為原料，采用熱水提取，乙醇沉淀的方法得到粗提物，通過熱水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖，再經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析純化得到酸性蘆薈多糖的方法具有產(chǎn)物純度高、產(chǎn)率較大、設(shè)備要求簡單、重現(xiàn)性較好的特點(diǎn)(見摘要附圖)。本發(fā)明的酸性蘆薈多糖可以有效降低幽門螺旋桿菌對(duì)MKN 45細(xì)胞黏附率。此外，對(duì)于大腸桿菌黏附LOVO細(xì)胞也有顯著的抑制作用。說明此酸性蘆薈多糖是一種廣譜的抗黏附劑，并可以在制備抗幽門螺旋桿菌黏附藥物以及治療幽門螺旋桿菌感染引起的相關(guān)疾病中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101724089SQ200910183529
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者徐琛, 李洪森, 郭彬歆, 阮小明 申請(qǐng)人:南京大學(xué)