專利名稱：聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于氧化鋅量子點的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備，特別是一種聚甲基丙 烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點(ZnO@PDMAEMA-co-PMAA)及制備和 應(yīng)用，它是一種具有轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和生物成像功能的非病毒載體的制備。
背景技術(shù)：
基因治療(gene therapy)是分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，是利用最先進 的生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的技術(shù)，通過導(dǎo)入人的正常基因或有治療作用的基因從而發(fā)揮治療 作用的一種治療方法。目前應(yīng)用于基因治療的載體主要有病毒載體(viral vector)和非 病毒載體(nonviral vector)兩種?？刹捎玫牟《据d體有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒 (AAV)等，但病毒載體存在免疫原反應(yīng)和腫瘤化危險。非病毒載體包括裸DNA、脂質(zhì)體、陽 離子高聚物等。陽離子聚合物作為非病毒載體的一大類，除了存在非病毒載體的特點(即 低毒性，低免疫源性和低致病性)以外，還有自身的優(yōu)勢，就是對轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因的尺寸沒有限 制，有利于其作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。 量子點(Quantum Dot)是近年來新興的一種納米材料，由于其具有優(yōu)良的隨尺寸 變化的性質(zhì)，尤其是光學(xué)性質(zhì)，無論在基礎(chǔ)研究還是在實際應(yīng)用方面都具有重要的價值。半 導(dǎo)體量子點多指基于II-VI族(如CdSe， ZnS) 、 III-V族(如GaAs， InP)及IV-VI族(如 PbS、PbSe)三個系列的納米晶體材料，是準(zhǔn)零維的納米材料。量子點表面粗糙，直徑介于 l-10nm之間，是由相對少數(shù)目的原子與分子組成的納米級團簇，其性能既不同于塊狀固體 又有別于單一的原子或分子的性質(zhì)，而是表現(xiàn)出其獨特的物理、化學(xué)性能。當(dāng)半導(dǎo)體晶體顆 粒的直徑小于該半導(dǎo)體材料體相的激子波爾半徑時，其電子能級由準(zhǔn)連續(xù)變?yōu)榉至ⅲw 顆粒處于量子受限(quantum confinement)狀態(tài)，因此稱為量子點。由于量子受限，量子點 的帶隙隨晶粒尺寸變化，呈現(xiàn)量子尺寸效應(yīng)(quantum size effect)，最直接的表現(xiàn)為光學(xué) 性質(zhì)隨著晶粒尺寸的變化而變化。與通常應(yīng)用為標(biāo)記物的有機熒光染料相比，量子點具有 發(fā)射波長可調(diào)、激發(fā)波長寬、發(fā)射波長窄、光穩(wěn)定性好和易于修飾等優(yōu)勢。由于其出眾的性 能，量子點在包括生物標(biāo)記在內(nèi)的多個領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。 以量子點為基體進行表面修飾，包括多肽、氨基酸，或與聚合物進行偶聯(lián)并應(yīng)用于 生物標(biāo)記、體內(nèi)體外成像、基因測序、基因治療等是當(dāng)前的一個研究熱點。由于目前應(yīng)用范 圍最廣、制備最為成熟的CdX(X = S、Se、Te)量子點具有極大的生物毒性，其在基因治療領(lǐng) 域的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。作為其替代物，生物友好的氧化鋅量子點越來越受到人們的重 視。ZnO量子點是一種直接帶隙的寬禁帶半導(dǎo)體材料，其一般具有兩個典型的熒光發(fā)射峰 340-380nm處的紫外發(fā)射峰和500-600nm處的可見發(fā)射峰。對于生物醫(yī)用領(lǐng)域，ZnO的可見 發(fā)射峰具有重要的意義。但是ZnO量子點本身不具備復(fù)合DNA的能力，因而無法用于介導(dǎo) 基因的轉(zhuǎn)染中。目前的文獻和公開的專利尚無ZnO量子點作為轉(zhuǎn)基因載體的報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹
3氧化鋅量子點及制備和應(yīng)用。它具有熒光示蹤能力，并且能夠有效復(fù)合DNA并進行基因轉(zhuǎn) 染，其合成條件溫和，制備簡單， 一步法完成，不涉及常用的Zn0量子點后修飾的繁瑣工藝。 以該方法制備的聚N， N- 二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯_聚甲基丙烯酸鹽包裹的氧化鋅量子 點具有轉(zhuǎn)基因能力，并能通過光學(xué)方法實現(xiàn)對于DNA運輸過程的跟蹤，即基因轉(zhuǎn)染和生物 標(biāo)記和成像可在單一的生物相容性良好的Zn0量子點上實現(xiàn)。 本發(fā)明提供的一種聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量
子點結(jié)構(gòu)如下式所示
<formula>formula see original document page 4</formula> 其中，m = 20-200， n = 50-200。 本發(fā)明提供的一種聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量 子點是以單體N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯與甲基丙烯酸鋅為原料共聚而成，兩單體 的共聚摩爾比為1-30 : 1。 聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯_聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點的制備方法包 括以下步驟 甲基丙烯酸鋅(Zn(MAA)2) 、 N， N- 二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于無水 乙醇中，攪拌均勻。加熱至8(TC后加入偶氮二異丁腈(AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后反應(yīng)體系 變?yōu)槿榘咨?，此時加入水合氫氧化鋰乙醇溶液，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成 后，待產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm條件下離心5分鐘。棄去上清液，將所得白色沉淀溶解于 去離子水中，并于去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0. 22微米孔徑濾膜 過濾所得溶液，凍干即得最終產(chǎn)物。其中偶氮二異丁腈的加入量為單體總量的0. 5% -5%; 水合氫氧化鋰與甲基丙烯酸鋅等摩爾。 本發(fā)明的優(yōu)點在于所制備的聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹 氧化鋅量子點能夠有效復(fù)合壓縮DNA，并成功將DNA導(dǎo)入細胞并使其成功表達。在轉(zhuǎn)基因 過程中能夠通過熒光作用隨時跟蹤DNA/載體的位置并確定其胞內(nèi)分布。步驟是將上述載 體溶于原子級水中得到不同濃度的載體溶液，并用0. 22 ii m濾器過濾除菌。為制備復(fù)合比 為1_60 : l(復(fù)合比均為載體與DNA的質(zhì)量比，簡稱為復(fù)合比)的載體/pDNA復(fù)合物溶液， 將一定濃度的載體溶液加入到等體積的質(zhì)粒(pGL3) DNA溶液中，20-37°C復(fù)合30分鐘。將 復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長期的C0S-7細胞不含血清的培基中，轉(zhuǎn)染4小時后將 培養(yǎng)基換為包含血清的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性。 轉(zhuǎn)染過程中可隨時用激光掃描共聚焦顯微鏡定位DNA/載體復(fù)合物的位置并觀察其胞內(nèi)分 布，激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長570nm。 本發(fā)明用N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯及甲基丙烯酸鋅為單體，以自由基聚合技術(shù)，制備了聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點。本發(fā)明 的優(yōu)點在于其制備方法簡單，合成條件溫和，以該方法制備的聚N， N- 二甲基胺基甲基丙烯 酸乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹的氧化鋅量子點具有轉(zhuǎn)基因的能力并能通過光學(xué)方法實現(xiàn) 對于DNA運輸過程的跟蹤。


圖1是激光掃描共聚焦顯微鏡對DNA/載體復(fù)合物胞內(nèi)分布的觀察。
具體實施方式

實施例一 取59mg甲基丙烯酸鋅(Zn(MAA)2)、0.84ml N， N_ 二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯 (DMAEMA)溶于IO毫升無水乙醇中，攪拌均勻。加熱至8(TC后加入8.2mg偶氮二異丁腈 (AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后反應(yīng)體系變?yōu)槿榘咨?，此時加入含10. 5mg水合氫氧化鋰的乙醇 溶液10毫升，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成后，待產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm 條件下離心5分鐘。棄去上清液，將所得白色沉淀溶解于30毫升去離子水中，并于去離子 水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0. 22微米孔徑濾膜過濾所得溶液，凍干即 得最終產(chǎn)物。由核磁共振氫譜確定其摩爾共聚比(DMAEMA/MAA)為4. 95。
將上述載體溶于原子級水中得到不同濃度的載體溶液，并用0. 22 ii m濾器過濾除 菌。為制備復(fù)合比為25 : 1的載體/pDNA復(fù)合物溶液，將一定濃度的載體溶液加入到等體 積的質(zhì)粒(pGL3) DNA溶液中，20-37t:復(fù)合30分鐘。將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生 長期的C0S-7細胞不含血清的培基中，轉(zhuǎn)染4小時后將培養(yǎng)基換為包含血清的培養(yǎng)基后繼 續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為7. 69X 106RLU/mg protein。
實施例二 取118mg甲基丙烯酸鋅(Zn(MAA)2)、0.84ml N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯 (DMAEMA)溶于IO毫升無水乙醇中，攪拌均勻。加熱至8(TC后加入8.2mg偶氮二異丁腈 (AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后反應(yīng)體系變?yōu)槿榘咨?，此時加入含21mg水合氫氧化鋰的乙醇溶 液10毫升，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成后，待產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm條 件下離心5分鐘。棄去上清液，將所得白色沉淀溶解于30毫升去離子水中，并于去離子水 中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0. 22微米孔徑濾膜過濾所得溶液，凍干即得 最終產(chǎn)物。由核磁共振氫譜確定其摩爾共聚比(DMAEMA/MAA)為2. 95。
將上述載體溶于原子級水中得到不同濃度的載體溶液，并用0. 22 ii m濾器過濾除 菌。為制備復(fù)合比為25 : 1的載體/pDNA復(fù)合物溶液，將一定濃度的載體溶液加入到等 體積的質(zhì)粒(pGL3)DNA溶液中，20-37 t:復(fù)合30分鐘。將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù) 生長期的C0S-7細胞不含血清的培基中，轉(zhuǎn)染4小時后將培養(yǎng)基換為包含血清的培養(yǎng)基后 繼續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為1.27X 107RLU/mg protein。在 轉(zhuǎn)染過程進行3小時采用激光掃描共聚焦顯微鏡進行DNA/載體復(fù)合物分布觀察，激發(fā)波長 350nm，發(fā)射波長570nm(如下圖1所示，DNA/載體復(fù)合物進入細胞并分布于細胞質(zhì)中)。
實施例三取236mg甲基丙烯酸鋅(Zn (MAA)2) 、0. 84ml N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于IO毫升無水乙醇中，攪拌均勻。加熱至8(TC后加入8.2mg偶氮二異丁腈 (AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后反應(yīng)體系變?yōu)槿榘咨藭r加入含42mg水合氫氧化鋰的乙醇溶 液10毫升，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成后，待產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm條 件下離心5分鐘。棄去上清液，將所得白色沉淀溶解于30毫升去離子水中，并于去離子水 中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0. 22微米孔徑濾膜過濾所得溶液，凍干即得 最終產(chǎn)物。由核磁共振氫譜確定其摩爾共聚比(DMAEMA/MAA)為1.41。
將上述載體溶于原子級水中得到不同濃度的載體溶液，并用0. 22 ii m濾器過濾除 菌。為制備復(fù)合比為25 : 1的載體/pDNA復(fù)合物溶液，將一定濃度的載體溶液加入到等體 積的質(zhì)粒(pGL3) DNA溶液中，20-37t:復(fù)合30分鐘。將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生 長期的C0S-7細胞不含血清的培基中，轉(zhuǎn)染4小時后將培養(yǎng)基換為包含血清的培養(yǎng)基后繼 續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為2. 89X 106RLU/mg protein。
實施例四 取1180mg甲基丙烯酸鋅(Zn(MAA)2) 、0. 84ml N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯 (DMAEMA)溶于IO毫升無水乙醇中，攪拌均勻。加熱至8(TC后加入8.2mg偶氮二異丁腈 (AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后反應(yīng)體系變?yōu)槿榘咨藭r加入含210mg水合氫氧化鋰的乙醇 溶液10毫升，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成后，待產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm 條件下離心5分鐘。棄去上清液，將所得白色沉淀分散于30毫升去離子水中，并于去離子 水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。凍干即得最終產(chǎn)物。所的產(chǎn)物水溶性大大降低，
未用于基因轉(zhuǎn)染研究。
對比例 取0. 84ml N， N- 二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升無水乙醇中， 攪拌均勻。加熱至8(TC后加入8. 2mg偶氮二異丁腈(AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后加入含21mg 水合氫氧化鋰的乙醇溶液10毫升，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成后，待產(chǎn)物冷 卻至室溫，于去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0. 22微米孔徑濾膜過 濾所得溶液，凍干即得最終產(chǎn)物。 將上述載體溶于原子級水中得到不同濃度的載體溶液，并用0. 22 ii m濾器過濾除 菌。為制備復(fù)合比為25 : 1的載體/pDNA復(fù)合物溶液，將一定濃度的載體溶液加入到等體 積的質(zhì)粒(pGL3) DNA溶液中，20-37t:復(fù)合30分鐘。將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生 長期的C0S-7細胞不含血清的培基中，轉(zhuǎn)染4小時后將培養(yǎng)基換為包含血清的培養(yǎng)基后繼 續(xù)培養(yǎng)48小時后裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為1.41X107RLU/mg protein。
權(quán)利要求
一種聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點，其特征在于它的結(jié)構(gòu)為其中，m＝20-200，n＝50-200。F2009102450810C00011.tif
2. 按照權(quán)利要求1所述的包裹氧化鋅量子點，其特征在于它是以單體N， N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯與甲基丙烯酸鋅為原料共聚而成，兩單體的共聚摩爾比為1-30 : 1。
3. —種權(quán)利要求1所述的聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點的制備方法，其特征在于它是經(jīng)過以下步驟1) 按計量將甲基丙烯酸鋅(Zn(MAA)》、N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于無水乙醇中，攪拌均勻；加熱至8(TC后加入偶氮二異丁腈(AIBN)，反應(yīng)進行兩分鐘后加入水合氫氧化鋰乙醇溶液，于8(TC條件下回流反應(yīng)1小時；2) 產(chǎn)物冷卻至室溫，于5000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，將所得白色沉淀溶解于去離子水中，并于去離子水中透析3天，透析袋截留分子量3500 ;3) 使用0. 22微米孔徑濾膜過濾所得溶液，凍干即得最終產(chǎn)物。
4 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的甲基丙烯酸鋅、N， N- 二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯的摩爾比為1-30 : 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的偶氮二異丁腈的加入量為單體總量的O. 5% -5%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的水合氫氧化鋰與甲基丙烯酸鋅等摩爾。
7. 權(quán)利要求1所述的聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯_聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點的應(yīng)用，其特征在于用于熒光示蹤轉(zhuǎn)基因載體，實現(xiàn)DNA運輸和表達。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點熒光示蹤轉(zhuǎn)基因載體的制備方法和應(yīng)用，屬于轉(zhuǎn)基因載體的制備。該方法過程包括用N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯及甲基丙烯酸鋅為單體，以自由基聚合技術(shù)，制備了聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹氧化鋅量子點。本發(fā)明的優(yōu)點在于其制備方法簡單，合成條件溫和，以該方法制備的聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹的氧化鋅量子點具有轉(zhuǎn)基因的能力并能通過光學(xué)方法實現(xiàn)對于DNA運輸過程的跟蹤。
文檔編號C08F220/06GK101735383SQ20091024508
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者劉文廣, 張鵬 申請人:天津大學(xué)