專利名稱：花刺參中皂苷類抗真菌化合物Variegatuside F～I的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，是從海洋動物花刺參中分離得到的4 個新的皂苷類抗真菌化合物Variegatuside F、 G、 H、 I。
背景技術：
花朿IJ參CSWc/2o; ^ van'eg"^s Semper)是一禾中廣泛生長于我國廣東、 廣西和海南沿海的海參綱動物，屬剌參科剌參屬。體形較大，體長一 般20cm，最大可達90cm體稍呈方柱狀?；ù虆⑹侵匾氖秤煤⒅?一，民間也常做藥用，中醫(yī)主要用于治療腎陽虛損、水濕停聚者(廖 玉麟編著.中國動物志，棘皮動物門，海參綱.北京科學出版社， 1997， 115)。但至今未見有關從花刺參中分離得到皂苷類抗真菌化合 物Variegatuside F、 G、 H、 I的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種從生長在海南三亞海域的花刺參中分離得到的 新的皂苷類抗真菌化合物，分別命名為Variegatuside F， Variegatuside G， Variegatuside H， Variegatuside I，它們的化學結構通式如下<formula>formula see original document page 5</formula>
其中，各化合物的R, 、R2、R3、 R4基團搭配分別為:
<formula>formula see original document page 5</formula>
本發(fā)明化合物的制備方法如下
(l)制備粗總皂苷提取物將花剌參干品粉碎，按常規(guī)用75%乙醇 水溶液加熱提取，減壓回收乙醇液，得流浸膏，將流浸膏分散在于水 中，依次用石油醚、水飽和正丁醇分別萃取，減壓濃縮正丁醇液至干， 得到粗總皂苷提取物；(2)分離提純按常規(guī)將上述粗總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以
體積比為氯仿甲醇水=8~6 :2 4 :1的混合溶劑洗脫，薄層層析檢 測，收集含有皂苷的流份，再經過ODS反相柱層析，以體積比為甲 醇水=5 10 :5~0梯度洗脫，薄層層析檢測，分別得到化合物 Variegatuside F I 。
經多種現(xiàn)代光譜分析，特別是綜合應用多種先進的二維核磁共振 波譜解析，確定了上述4種化合物的化學結構和立體構型。
1. Variegatuside F 為白色結晶性粉末。m.p.214 215°C(MeOH-H20)， Liebermann- Burchard禾卩Molish反應陽性。 IR(KBr，cm-'): 3422(OH)， 1760(C=O)， 1635(OC)等主要吸收峰。電 噴霧-飛行時間-正離子質譜ESI-MS+中的準分子離子峰m/z: 1461[M+Na]+;負離子質譜ESI-MS—中的分子離子峰m/z: 1437[M-H] 一。"CNMR與'HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2。以三氟乙酸水解皂苷后 得到組成皂苷糖鏈的單糖，將所得單糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用 GC-MS進行分析，通過對照標準糖的糖腈乙酸酯，確定variegatuside F糖鏈由木糖、葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖，比例為2:3:1。
2 . Variegatuside G 為白色結晶性粉末。m.p.214
216°C(MeOH-H20)， Liebermann- Burchard和Molish反應陽性。
IR(KBr,cm"): 3422(OH)， 1760(C=O)， 1635(C-C)等主要吸收峰。電
噴霧-飛行時間-正離子質譜ESI-MS +中的準分子離子峰m/z: 1463[M+Na]+;負離子質譜ESI-MS—中的分子離子峰m/z: 1439 [M-H]—。 13CNMR與'HNMR數(shù)據(jù)見表3和表4。以三氟乙酸水解皂苷后得到組成皂苷 糖鏈的單糖，將所得單糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用GC-MS進行分 析，通過對照標準糖的糖腈乙酸酯，確定variegatusideG糖鏈由木糖、 葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖，比例為2:3:1。
3 . Variegatuside H為白色結晶性粉末。m.p.212 214°C(MeOH-H20)， Liebermann畫Burchard和Molish反應陽性。 IR(KBr,cm"): 3422(OH)， 1760(C=O)， 1635(C二C)等主要吸收峰。電 噴霧-飛行時間-正離子質譜ESI-MS+中的準分子離子峰m/z: 1505[M+Na]+;負離子質譜ESI-MS—中的分子離子峰m/z: 1481 [M-H] 一。"CNMR與'HNMR數(shù)據(jù)見表5和表6。以三氟乙酸水解皂苷后 得到組成皂苷糖鏈的單糖，將所得單糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用 GC-MS進行分析，通過對照標準糖的糖腈乙酸酯，確定variegatuside H糖鏈由木糖、葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖，比例為1:3:2。
4 . Variegatuside I 為白色結晶性粉末。m.p.215 217°C(MeOH-H20)， Liebermann- Burchard禾卩Molish反應陽性。 IR(KBr,cm-'): 3422(OH)， 1760(C=O)， 1635(CK:)等主要吸收峰。電 噴霧-飛行時間-正離子質譜ESI-MS+中的準分子離子峰m/z: 1447[M+Na]+;負離子質譜ESI-MS—中的分子離子峰m/z: 1423 [M-H] 一。^CNMR與'HNMR數(shù)據(jù)見表7和表8。以三氟乙酸水解皂苷后 得到組成皂苷糖鏈的單糖，將所得單糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用 GC-MS進行分析，通過對照標準糖的糖腈乙酸酯，確定variegatusideH糖鏈由木糖、葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖，比例為3:1:2。
表1. variegatuside F苷元部分的NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
Position5i"./in Hz)HMBC
136.481.51 (2H, m)
227.351.96 (1H, 2.12 (1H, m)
389.093.35 (IH， dd, 3.6,C1 Xyll
439.68
48.211.06 (1H, t, 5.7)C:4. 10. 19. 28.
623.482.04 (2H, m)
7120.225.72 (1H, m)
8146.77
947.593.53 (1H, br,d, 13.3)
1035.77
1123.13L86 (2H, m)
1230.472.07 (1H, m)
1.99 (1H, m)C:9, 13, 18
1358.69
1451.45
1534.441.71 (1H, m) 1.83 (1H， m)
1625.011.96 (1H, m) 2.07 (1H, m)
1754.382.41 (1H, dd, 4.0,
18180.01
1924.221.24 (3H, s)C:1,9, 10
2083.38
2127.201.59 (3H, s)C:17, 20, 22,
2243.452.01 (lH,m;)C:20,21
2.13 (1H, m)C:20,21
2368.495.58(lH,m)
2444.842.47 (1H, dd,7.7,C:22, 23, 25， 26,
2.34 (1H, dd, 5.4,C:22, 23, 25, 26,
25141.89
26114.514.94 (2H, brs)，
2722.53l.卯(3H, s)C:24, 25, 26
2817.571.19 (3H， s)C:3, 4， 5, 29
2928.991.34 (3H, s)C:3， 4, 5,28
3031.121.15 (3H, s)C:8, 13， 14, 15
OCOCH3170.72
OCOCH321.402.20 (3H, s)表2 . variegatuside F糖鏈部分的& NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
PositionscSHC/in Hz)腿BC
Xyll (l-—C-3)
1105.464.85 (IH， d， 7.2)C-3
283.294.18 (1H, m)
375.734.32 (1H, m)
477.744.32 (IH， m)
564.183.72 (1H, m) 4.26 (H, m)
Glul(l->2Xyll)
1105.855.32 (IH， d, 7.8)C-2(Xyll-2)
275,854.15 (1H, m)
376.87 a3.90 (1H， m)
480.634.44 (1H, m)
576.774.12 (1H, m)
661.374,48 (1H, m) 4.67 (1H, m)
Xyl2(l —'4Glul)
1105.135.20(1H, d， 7.2)C-4(Glul-4)
273.854.10 (IH， m)
388.064.13 (1H, m)
469.304.13 (1H, m)
566.723.65 (1H, m) 4.26 (1H, m)
MeGlu(l—3 Xyl2)
1105.855.34 (1H, d, 7.2)C-3(Xyl2-3)
275.324.08
388.153.78
470.734.22
578.43a4.03
662.254.36 (1H, m) 4.53 (1H， m)
OMe60.93
Glu2 (l-+4Xyll)
1103.025.07 (IH， d)C-4(Xyll-4)
273.384.10 (1H, m)
388.234.10 (1H, m)
469.884.16 (1H, m)
578.433.98 (1H, m)
662.394.36 (1H, m) 4.67 (IH， m)
Glu3 (卜+3 Glu2)
1105.925.34 (1H, d, 7.9)C-3(Glu2-3)
275.734.31 (1H, m)
378.784.08 (1H, m)
471.814.27 (IH， m)
578.544.03 (m, m)
662.684.36 (1H, m) 4.60 (1H, M)表3 . variegatuside G苷元部分的'H NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
Positionsc5HC/in Hz)麗BC
136.471.45 (2H， m)
227.352.09 (1H， m)
2.14 (1H, m)
389.053.15 (1H, dd， 3.5， 11.5)C: 1 Xyll
439.67
548.81.02(lH，m)C:4. 10. 19. 28.29
623.482.05 C2H，
7120.195.72 (1H, m)
8146.78
947.593.46 (IH， br,d， 13.1)
1035.76
1123.111.81 (2H, m)
1230.442.02 (IH， m)
1.98 (1H， m)C: 9， 13，8
1358.65
1451.43
1534.431.68 (1H, m)
1.81 (1H, m)
1625.012.01 (IH,
2.20 (1H, m)
1754.382.41 (lH，dd,4.01， 10.2)
18179.9
1924.221.24 (3H, s)C: 1， 9， 10
2083.37
2127.161.59 (3H, s)C: 17, 20, 22，
2244.272.28 (IH， m)C: 20， 21
1.98 (1H, m)C:20,2
2368.495.52(lH,m)
2445.531.38 (1H， m)C: 22， 23， 25, 26, 27
1.67 (1H, m)C: 22， 23, 25, 26, 27
2524.741.65 (lH,m)
2622.321.02 (3H, d, 6.2)C: 24， 25,
2723.350.98 (3H， d, 6.2)C: 24， 25
2817.561.19 (3H, s)C: 3， 4， 5, 29
2928.981.37 (3H, s)C:3,4, 5, 28
3031.120.97 (3H， s)C: 8， 13, 14, 15
OCOCH3170.93
OCOCH321.502.21 (3H, s)表4. variegatuside G糖鏈部分的NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
PositionSc5H ( / in Hz)畫BC
Xyll (1—C-3)
1105.454.85 (1H, d, 7.2)C-3
283.354.18 (1H, m)
375.774.32 (1H, m)
477.724.32(lH，m)
564.173.72 (1H, m) 4.26 (1H, m)
Glul (1-—2Xyl1)
1105.865.32 (IH， d, 7.8)C-2(Xyll-2)
275.844.15 (1H, m)
376.863.90 (1H, m)
480.594.44(lH,m)
576.784.12 (1H， m)
661.354.48 (1H, m) 4.67 (1H, m)
Xyl2(l一'4Glul)
1105.135.20 (1H, d, 7.2)C-4(Glul-4)
273.824.10 (1H,
388.064.13 (1H, m)
469.284.13 (1H, m)
566,713.65 (1H, m) 4.26 (1H, m)
MeGlu(l'—3 Xyl2)
1105.865.34 (1H, d, 7.2)C-3(Xyl2-3)
275.3〗4.08
388.153.78
470.714.22
578.48a4.03
662.234.36 (1H, m) 4.53 (1H, m)
OMe60.91
Glu2(l —"Xyll)
1103.035.07 (1H, d,)C-4(Xyll-4)
273.344.10 (1H, m)
388.244.10 (IH， m)
469.864.16 (IH， m)
578.423.98 (1H, m)
662.374.36 (1H, m) 4.67 (1H, m)
Glu3 (1—>3 Glu2)
1105.955.34 (1H, d, 7.9)C-3(Glu2-3)
275.724.31 (IH，
378.774.08 (1H, m)
471.794.27 (1H, m)
578.534.03 (IH， m)
662.654.36 (IH， m) 4.60 (1H, M)表5. variegatuside H苷元部分的NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
Positionsc5H (J in Hz)腿BC
136,471.51 (2H, m)
227.341.99 (IH， m) 2.20 (IH，
389.093,35 (1H, dd, 3.6， 11.6)C:1 Xyil
439.67
548.211.06(lH，m)C:4. 10. 19. 28. 29
623.492.04 (2H, m)
7120.205.72 (1H, m)
8146.78
947.593.53 (IH， br, d, 133)
1035.76
123.131.85 (2H, m)
1230,472.05 (IH， m)
1.95 (1H, m)C:9, 13， 18
1358.65
1451.45
1534.431.71 (1H, m) 1.83 (]H， m)
1624.951.96 (IH， m) 2.07 (1H, m)
1754,292.41 (IH， m)
18179.971
1924.211.30 (3H， s)C:1,9， 10
2083.35
2127,191.59 (3H, s)C:17, 20， 22，
2243,451.99 (IH， m)C:20,21
2.26(1 H， m)C:20,21
2368.125.58 (1H, m)
2444.832.34 (IH， dd, 5.4, 13.5)C:22, 23, 25， 26, 27
2.47 (1H, dd, 7.7， 13,5)C:22, 23, 25, 26, 27
25141.91
26114.494.94(2H， brs),
2722.521.90 (3H, s)C:24, 25， 26
2817.551.20 (3H, s)C3, 4, 5, 29
2928.981.32 (3H,s)C3,4,5,28
3031.101.15 (3H， s)C8, 13, 14， 15
OCOCH3170.68
OCOCH321.372.20 (3H， s)表6 . variegatuside H糖鏈部分的NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
Position&5H ( / in Hz)HMBC
Xyll (1 —《-3)
1105.434.85〔1H， d， 7.0)C-3
283.274.18〔1H， m)
375.314,07〔IH, m)
477.784.30〔1H， m)
564.143.79 4.46〔IH, m) 〔IH, m)
Glul (1 —>2Xyll)
1105.805.32〔IH, d, 7.8)C-2(Xyll-2)
276.13a4.15〔1H， m)
76.773.90〔IH, m)
481.274.45〔IH, m)
76.594.12〔1H， m)
661.754.48 4.64〔IH, m) 〔IH, m)
Glu2 (1- 4 Glul)
1104.625.07〔1H， d， 7.7)C-4(Glul-4)
273.764.16〔IH, m)
388.13c4.16〔1H， m)
469.89b4.16〔1H， m)
78.084.05〔IH, m)
662.384.36 4.53〔lH,m) 〔IH, m)
MeGlu(l-—3 Glu2)
1105.845.34〔1H， d, 8.5)C-3(Glu2-3)
:275.304.07〔IH, m)
388.193.81〔IH, m)
470.734.20〔1H， m)
578.503.98(1H, m)
662.264.36 4.53(1H, m) (1H, m)
OMe60.913.94(3H， m)
Glu3 (l — 4Xyll)
1103.055.24(1H, d, 7.7)C-4(Xyll-4)
273.344.11(1H, m)
388.093.79(1H, m)
469.84b4.20(1H, m)
78.504.03(1H, m)
662.384,36 4.60(1H, m) (1H, M)
MeGlu(l—3 Glu3)
1105.845.34(1H, d, 8.5)C-3(Glu3-3)
275.304.07(lH，m)
88.194.13(IH， m)
470.734.20(1H， m)
578.503.98(1H, m)
662.263.65 4.26(IH， m) (1H, m)
OMe60.913.94(3H, m)
13表7 . variegatuside I苷元部分的NMR and 13C NMR數(shù)據(jù)
Position Sc SHC/inHz) 腿BC
136.541.45 (2H,
227.412.09 (1H， m)
2.14 (1H, m)
389.243.15 (lH，dd, 3.5, 11.5)C: 1 Xyll
439,78
548.321.02 (1H, m)C: 4. 10. 19.28. 29
623.392.05 (2H， m)
7120.265.72 (1H, m)
8146.86
947.643.46 (1H, br, d, 13.1)
1035.83
1123.161.81 (2H, m)
1230.512.02 (]H, m)
1.98 (IH， m)C: 9， 13, 18
1358.70
451.49
1534.501.68 (1H， m)
1.81 (1H, m)
1625.052.01 (1H, m)
2.20 (1H， m)
1754.432.41 (1H, dd， 4.01, 10.2)
18180.14
1924.281.24 (3H, s)C: 1,9, 10
2083.45
2127.181.59 (3H, s)C: 17, 20， 22,
2244.302.28 (1H, m)C: 20, 21
1.98(lH,m)C: 20, 2
2368.545.52(1H, m)
2445.561.38 (1H, m)C: 22, 23, 25, 26, 27
1.67 (IH， m)C: 22, 23, 25, 26， 27
2524.771.65 (1H, m)
2622.361.02 (3H, d, 6.2)C: 24, 25,
2723.390.98 (3H, d, 6,2)C:24,25
2817.211.19 (3H, s)C: 3， 4， 5， 29
2928.701.37 (3H, s)C:3,4, 5， 28
3031.161.12 (3H， s)C.: 8, 13, 14， 15
OCOCH3170.93
OCOCH321.502.21 (3H, s)<formula>formula see original document page 15</formula>Xyl:木糖Gill:葡萄糖；MeGUl: 3-0-甲基葡萄糖；/:偶合常數(shù)
本發(fā)明化合物Variegatuside F I經體外抗真菌活性實驗，表明具 有明顯的抑制真菌菌株生長的效果，因此可用于制備抗真菌藥物。
本發(fā)明為開發(fā)新的抗真菌藥物提供了新的先導化合物，對開發(fā)利 用中國的海洋藥用資源具有重要意義。
具體實施方式
現(xiàn)結合實施例，對本發(fā)明作詳細描述。 實施例1:制備Variegatuside F~I
選擇生長于海南三亞海域的花剌參干品1500g,將花剌參干品粉 碎，用75。/。乙醇水溶液加熱提取3次(3000ml/次)，合并3次提取液， 減壓回收乙醇液，得流浸膏，將流浸膏分散于水中，依次用石油醚、 水飽和正丁醇分別萃取，減壓濃縮正丁醇液至干，得到粗總皂苷提取 物14g。將粗總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以體積比為氯仿甲醇 水=8~6:2 4:1的混合溶劑洗脫，薄層層析檢測，收集含有皂苷的流份， 再經過ODS反相柱層析，以體積比為甲醇水=5 10:5 0梯度洗脫， 薄層層析檢測，分別得到Variegatuside F I純品。其得量依次為20mg、 12mg、 14mg、 17mg。
本發(fā)明化合物Variegatuside F~I體外抗真菌活性實驗
實驗所用真菌菌株為ATCC標準菌株和臨床菌株，艮口 ATCC菌株白念珠菌(Ca"&cfoa仿^ms) SC5314
新生隱球菌(OjptococcMs weq/br,朋)BLS108臨床菌株熱帶念珠菌(Cawd/fib/r—c"feO
紅色毛癬菌(7h.c/w/ 一o" ra6r扁) 石膏狀小 包子菌(M/craA，rw附gy/wew附) 薰煙曲毒菌"5/ ergz'//附>m /g齒s) 實驗方法取無菌96孔板，于每排1號孔加RPMI 1640 100 ul 作空白對照；3 12號孔各加新鮮配制的菌液120ul; 2號孔分別加 菌液160 u 1和受試化合物溶液1. 6 w 1。 2 11號孔10級4倍稀釋， 使各孔中的藥物終濃度分別為64、 16、 4、 1、 0. 25和0. 0625、 0. 0156、 0.0039、 0.00097、 0. 00024mg L—'，各孔中畫SO含量均低于1%; 12號孔不含藥物，作陽性對照。各藥敏板于35匸培養(yǎng)。念珠菌、新 生隱球菌及絲狀菌分別于35。C培養(yǎng)24h、 72h和一周后，用酶標分析 儀于630nm測各孔OD值。
與陽性對照孔比，以OD值下降80%以上的最低濃度孔中的藥 物濃度為M1C8。(真菌生長80%被抑制時的藥物濃度)。當藥物的 MIQ。值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統(tǒng)計MICso值高于 最高濃度64 mg七—4寸，計為">64 mg七—h'; MICs。值為最低濃度或在 最低濃度以下時，不作區(qū)別，均計為"^).00024mg丄—"。實驗結果見 表9 (表中，本發(fā)明化合物以F、 G、 H、 I表示)。
表9本發(fā)明化合物F、 G、 H、 I對6種真菌的抗菌活性(MIC柳，mg'L1)
齒株白色念珠菌新生隱球菌熱帶念珠菌紅色毛癬菌石小孢子菌薰煙曲霉菌
化合物F1681616832
化合物G1681616832
化合物H32888816
化合物I168164432由表1可見，本發(fā)明化合物VariegatusideF 1對6種不同的真菌 菌株均顯示明顯的抑制作用，因而可用于制備抗真菌藥物。
權利要求
1.一種皂苷類抗真菌化合物Variegatuside F～I，其特征在于化學結構通式如下其中，各化合物的R1、R2、R3、R4基團搭配分別為R1R2R3R4Variegatuside FCH2OHH OH id="icf0002" file="A2009100562240002C2.tif" wi="21" he="8" top= "166" left = "98" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>Variegatuside GCH2OHH OH id="icf0003" file="A2009100562240002C3.tif" wi="24" he="9" top= "185" left = "99" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>Variegatuside HCH2OHCH2OH OCH3 id="icf0004" file="A2009100562240002C4.tif" wi="21" he="8" top= "204" left = "99" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>Variegatuside IHH OCH3 id="icf0005" file="A2009100562240002C5.tif" wi="37" he="9" top= "224" left = "100" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2.權利要求1所述化合物的制備方法，步驟如下-(1) 制備粗總皂苷提取物將花刺參干品粉碎，按常規(guī)用75%乙醇 水溶液加熱提取，減壓回收乙醇液，得流浸膏，將流浸膏分散在于水 中，依次用石油醚、水飽和正丁醇分別萃取，減壓濃縮正丁醇液至干， 得到粗總皂苷提取物；(2) 分離提純按常規(guī)將上述粗總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以體積比為氯仿甲醇水=8~6 :2 4 :1的混合溶劑洗脫，薄層層析檢 測，收集含有皂苷的流份，再經過ODS反相柱層析，以體積比為甲 醇水=5~10 :5~0梯度洗脫，薄層層析檢測，分別得到化合物 Variegatuside F~I。
3.權利要求1所述化合物在制備抗真菌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，是從海洋動物花刺參中分離得到的4個新的皂苷類抗真菌化合物Variegatuside F、G、H、I?；瘜W結構通式如右式(Ⅰ)，其中，各化合物的R₁、R₂、R₃、R₄基團搭配分別為右式(Ⅱ)。經實驗表明其具有明顯的抑制真菌活性，因此可用于制備抗真菌藥物。本發(fā)明為開發(fā)新的抗真菌藥物提供了新的先導化合物。
文檔編號C08B37/00GK101613416SQ20091005622
公開日2009年12月30日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權日2009年8月11日
發(fā)明者劉寶姝, 文 張, 張宏偉, 易楊華, 玲 李, 王增蕾, 袁衛(wèi)華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學