專利名稱：能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種能識別土 霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制備方法。
技術(shù)背景目前世界各國為了保證人民的身體健康，防止不合理地使用抗生素，對于抗 生素(如土霉素和恩諾沙星)的使用和殘留都做了嚴(yán)格的規(guī)定并制定了相應(yīng)的標(biāo) 準(zhǔn)，如歐盟、日本、美國和我國農(nóng)業(yè)部對各種動物性食品、不同組織中的恩諾沙 星殘留規(guī)定了不同的最低檢測限量，如牛奶中最高不能高于100ppm。 土霉素屬 于四環(huán)素類抗生素，恩諾沙星為第3代氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones), 二者都是廣泛使用的人畜共用的藥物，目前常用于預(yù)防和治療動物性疾病。如果 濫用藥物以及不遵守休藥期提前屠宰等會使藥物殘留在動物組織及牛奶中，且由 于耐藥菌株的產(chǎn)生，常常將不同的抗生素合并用藥，以控制疾病的發(fā)展。另外， 由于耐藥菌株一般對同一類抗生素有更強(qiáng)的交叉耐藥性，臨床上常常將不同類的 抗生素合并使用，繼而殘留在生物和環(huán)境樣品中。目前，對于檢測復(fù)雜的生物和環(huán)境樣品中的抗生素殘留， 一般都要對樣品進(jìn) 行前處理。其中，分子印跡技術(shù)是一種基于分子識別基礎(chǔ)上的化學(xué)聚合物制備技 術(shù)，因其內(nèi)部具有和目的分子互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)和基團(tuán)，且具有"記憶"功能，所 以可特異地和模板分子發(fā)生作用，并可以通過相應(yīng)的方式洗脫，從而達(dá)到純化和 富集目的分子的作用。由于分子印跡聚合物是采用化學(xué)方法合成的，具有抵抗酸 堿等惡劣環(huán)境的優(yōu)點，可重復(fù)使用，所以應(yīng)用越來越廣泛。由于用藥情況復(fù)雜， 樣品中可能存在多種藥物殘留，這就要求樣品處理和分析方法能同時適應(yīng)多種被 分析物。制備能特異地識別多種藥物的分子印跡聚合物，是分子印跡技術(shù)發(fā)展的 重要方向。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的分子印跡聚合物除了對印跡的模板分 子有特異識別能力外，對模板類似物，如同一類抗生素中的其它成員，依據(jù)各自
分子結(jié)構(gòu)的差異，也表現(xiàn)一定的交叉識別能力。如Hu X等在《Journal of Chromatography A》(2008:1188:97-107.)上發(fā)表的"Pr印aration and evaluation of solid-phase microextraction fiber based on molecularly imprinted polymers for trace analysis of tetracyclines in complicated samples"中，以四環(huán)素為模板在丙酮中制備了能對四種四環(huán)素類抗生素進(jìn)行多 殘留分析的分子印跡聚合物。Yan H等在《Analytical Chemistry》 (2007;79:8242-8248.)上發(fā)表的"Molecularly Imprinted-Matrix Solid-Phase Dispersion for Selective Extraction of Five Fluoroquinolones in Eggs and Tissue"中，于甲醇和水的混和物中制備了能對五種喹諾酮類藥物進(jìn)行多殘留分 析的分子印跡聚合物。但是用這些文章介紹的方法制備的分子印跡聚合物對多種 抗生素的識別能力都局限在同一類的抗生素內(nèi)。在藥物的多殘留分析方面，能處 理不同類抗生素的分子印跡聚合物還未見報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能識別土霉素和恩諾沙 星的分子印跡聚合物的制備方法，所得聚合物可以直接從含水樣品中選擇性的結(jié) 合土霉素和恩諾沙星從而實現(xiàn)對被分析物的濃縮、凈化，同時去除樣品中雜質(zhì)的 影響，提高現(xiàn)有檢測方法的檢測靈敏度。所得聚合物可以用于固相萃取的固定相， 直接用于對土霉素和恩諾沙星的分離和富集，同時也可以開發(fā)成色譜的填料，用 于痕量土霉素和恩諾沙星的檢測。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟 第一步，將模板分子土霉素與恩諾沙星、金屬離子、功能單體甲基丙烯酸和 交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比為0.2 1: 0.6 1: 1: 2 10: 20， 混合后溶解到致孔劑中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN); 所述的金屬離子為Ni2+, Fe2+,或C,中一種。 所述致孔劑為甲醇和水的混合溶液，體積比為9: 1 3。 所述金屬離子和致孔劑的用量為當(dāng)金屬離子為0. lmmol時，致孔劑的體積 為4 7ml。第二步，將以上混合液置入安培瓶中，充入氮氣，在氮氣保護(hù)下將安培瓶封 口 ， 60 70。C水浴保溫反應(yīng)24 48小時得到反應(yīng)產(chǎn)物； 所述充入氮氣，其時間為5 10分鐘。
第三步，將合成的聚合物攪拌分散后，得到粒徑在0. 1 1. 5 U m之間的顆粒， 除去微細(xì)的顆粒；第四步，通過索氏萃取，進(jìn)一步除去模板分子；所述的索氏萃取的條件為萃取劑為甲醇、醋酸和1.0 mol L—1 HC1的混合 液，三者的體積比例為8:1:1，萃取3次以上，每次8 12小時，最后用純甲醇 萃取1 2次，除去剩余的醋酸。第五步，將除去模板分子的聚合物干燥過夜，獲得土霉素和恩諾沙星共同印 跡的分子印跡聚合物。所述干燥，其溫度為6(TC。所述分子印跡聚合物，其粒徑在約lym。本發(fā)明制備的分子印跡聚合物為球狀顆粒，直徑在1.0um左右，在含水豐 富的環(huán)境中對土霉素和恩諾沙星都有特異性吸附。通過實驗測得該聚合物在固相 萃取中的最大吸附量為，每克聚合物理論上吸附1. 83 y mol 土霉素和0. 78umo1 恩諾沙星。制備的分子印跡聚合物可以作為固相萃取的填料，有效地凈化基質(zhì)， 高效富集土霉素和恩諾沙星，結(jié)合已有檢測方法(如ELISA、 HPLC等)，顯著提 高土霉素和恩諾沙星殘留的檢測靈敏度和檢測效率，具有較大的推廣應(yīng)用價值。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實施例。實施例1.1、 將土霉素O. lmmol、恩諾沙星O. l腿ol， NiCl20. l醒ol， MAA0.2腦1， EGDMA 2. 0 mmol混合，倒入甲醇與水混合液5ml，甲醇與水體積比是4: 1，室 溫靜置l小時后，加入引發(fā)劑AIBN 10mg。2、 將以上混合液置入安培瓶中，超聲振動除氣10分鐘。將除氣后的體系， 通氮氣除氧5分鐘。在氮氣保護(hù)下迅速封口。 6(TC水浴保溫反應(yīng)24小時。得到 反應(yīng)產(chǎn)物。3、 反應(yīng)結(jié)束后，將制備的分子印跡聚合物攪散，通過乙醇清洗。通過丙酮 沉降3次后，干燥得到的聚合物，聚合物的粒徑在O. 1 1.5um之間。4、 通過索氏萃取24小時，除去模板分子。萃取的試劑為甲醇、醋酸與l.Omol L—1 HC1的混合液，三者比例為8:1:1。用甲醇洗脫殘留的醋酸。5、將除去模板分子的分子印跡聚合物6(TC干燥過夜，得到恩諾沙星和土霉素的分子印跡聚合物。 實施例2.1、 將土霉素0. 1 mmol、恩諾沙星0. 1 mmol， CuS040. 1 mmol， MAA 0. 4 mmol， EGDMA2.0mrao1混合，倒入甲醇、水混合液5. 5ml中，其中甲醇、水體積比是4: 1，室溫靜置l小時后，加入引發(fā)劑AIBN 10mg。2、 將以上混合液置入安培瓶中，超聲振動除氣10分鐘。將除氣后的體系， 通氮氣除氧5分鐘。在氮氣保護(hù)下迅速封口。 6(TC水浴保溫反應(yīng)24小時。得到 反應(yīng)產(chǎn)物。3、 反應(yīng)結(jié)束后，將制備的分子印跡聚合物攪散，通過乙醇清洗。通過丙酮 沉降3次后，干燥得到的聚合物，聚合物的粒徑在O. 1 1.5um之間。4、 通過索氏萃取24小時，除去模板分子。萃取的試劑為甲醇、醋酸和l.O mol L—1 HC1的混合液，三者比例為8:1:1。用甲醇洗脫殘留的醋酸。5、 將除去模板分子的分子印跡聚合物60'C干燥過夜，得到恩諾沙星和土霉 素的分子印跡聚合物。實施例3.1、 將土霉素0. 1腿ol、恩諾沙星0. 1腿ol， FeS04 0. 1 mmol, MAA 0. 8mmo1， EGDMA 2.0 mraol混合，倒入甲醇、水混合液6.0ml，甲醇、水體積比是4: 1, 室溫靜置l小時后，加入引發(fā)劑AIBN 10mg。2、 將以上混合液置入安培瓶中，超聲振動除氣10分鐘。將除氣后的體系， 通氮氣除氧5分鐘。在氮氣保護(hù)下迅速封口。 6(TC水浴保溫反應(yīng)24小時。得到 反應(yīng)產(chǎn)物.3、 反應(yīng)結(jié)束后，將制備的分子印跡聚合物攪散，通過乙醇清洗。通過丙酮 沉降3次后，干燥得到的聚合物，聚合物的粒徑在O. 1 1.5um之間。4、 通過索氏萃取24小時，除去模板分子。萃取的試劑為180ml甲醇、醋酸 與l.O mol L—1 HC1的混合液，三者比例為8:1:1。用甲醇洗脫殘留的醋酸。5、 將除去模板分子的分子印跡聚合物6(TC干燥過夜，得到土霉素和恩諾沙 星的分子印跡聚合物。實施例4.
1、 將土霉素0. 04咖ol、恩諾沙星0. 08 mraol， FeS040. 1 mmol， MAA 0. 4mmo1， EGDMA 2.0 mraol混合，倒入甲醇、水混合液6. 5ml，甲醇與水體積比是4: 1， 室溫靜止l小時后，加入引發(fā)劑AIBN 10mg。2、 將以上混合液置入安培瓶中，超聲振動除氣10分鐘。將除氣后的體系， 通氮氣除氧5分鐘。在氮氣保護(hù)下迅速封口。 6(TC水浴保溫反應(yīng)24小時。得到 反應(yīng)產(chǎn)物。3、 反應(yīng)結(jié)束后，將制備的分子印跡聚合物攪散，通過乙醇清洗。通過丙酮 沉降3次后，干燥得到的聚合物，聚合物的粒徑在O. 1 1.5um之間。4、 通過索氏萃取24小時，除去模板分子。萃取的試劑為180ml甲醇、醋酸 和l.O mol L—1的HC1混合液，三者比例為8:1:1。用甲醇洗脫殘留的醋酸。5、 將除去模板分子的分子印跡聚合物6(TC干燥過夜，得到土霉素和恩諾沙 星的分子印跡聚合物。實施例5.1、 將土霉素0. 02 mraol、恩諾沙星0. 06 mmol， FeS040. 1腿ol， MAA 0. 4mmo1， EGDMA 2. 0 ramol混合，倒入甲醇、水混合液6. 0ml中，甲醇與水體積比是4: 1， 室溫靜止l小時后，加入引發(fā)劑AIBN 10mg。2、 將以上混合液置入安培瓶中，超聲振動除氣10分鐘。將除氣后的體系， 通氮氣除氧5分鐘。在氮氣保護(hù)下迅速封口。 6(TC水浴保溫反應(yīng)24小時。得到 反應(yīng)產(chǎn)物。3、 反應(yīng)結(jié)束后，將制備的分子印跡聚合物攪散，通過乙醇清洗。通過丙酮 沉降3次后，干燥得到的聚合物，聚合物的粒徑在O. 1 1.5"m之間。4、 通過索氏萃取24小時，除去模板分子。萃取的試劑為180ml甲醇、醋酸 與l.O mol L—1 HC1的混合液，三者比例為8:1:1。用甲醇洗脫殘留的醋酸。5、 將除去模板分子的分子印跡聚合物6(TC干燥過夜，得到恩諾沙星和土霉 素的分子印跡聚合物。
權(quán)利要求
1、一種能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，將模板分子土霉素與恩諾沙星、金屬離子、功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比為0.2～1∶0.6～1∶1∶2～10∶20，混合后溶解到致孔劑中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰；第二步，將以上混合液置入安培瓶中，充入氮氣，在氮氣保護(hù)下將安培瓶封口，60～70℃水浴保溫反應(yīng)得到反應(yīng)產(chǎn)物；第三步，將合成的聚合物攪拌分散后，得到粒徑在0.1～1.5μm之間的顆粒，除去微細(xì)的顆粒；第四步，通過索氏萃取，進(jìn)一步除去模板分子；第五步，將除去模板分子的聚合物干燥過夜，獲得土霉素和恩諾沙星共同印跡的分子印跡聚合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述的金屬離子為Ni2+，F(xiàn)e2+，或Cu2+中一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述金屬離子和致孔劑的用量為當(dāng)金屬離子為0. lmmol時， 致孔劑的體積為4 7ml。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物 的制備方法，其特征是，所述致孔劑為甲醇和水的混合溶液，體積比為9: 1 3。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述充入氮氣，其時間為5 10分鐘。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述水浴保溫反應(yīng)，其反應(yīng)時間為24 48小時。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述的索氏萃取，采用的萃取劑為甲醇、醋酸和1.0molL—1 HC1的混合液，三者的體積比例為8:1:1。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物 的制備方法，其特征是，所述的索氏萃取，其萃取3次以上，每次8 12小時， 最后用純甲醇萃取1 2次，除去剩余的醋酸。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述干燥，其溫度為6(TC。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制 備方法，其特征是，所述分子印跡聚合物，其粒徑在約lwm。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的能識別土霉素和恩諾沙星的分子印跡聚合物的制備方法，具體為將土霉素與恩諾沙星、金屬離子、甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比為0.2～1∶0.6～1∶1∶2～10∶20，混合后溶解到致孔劑中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰；將以上混合液置入安培瓶中，充入氮氣，在氮氣保護(hù)下將安培瓶封口，水浴保溫反應(yīng)；將合成的聚合物攪拌分散后，得到粒徑在0.1～1.5μm之間的顆粒，除去微細(xì)的顆粒；索氏萃取；將除去模板分子的聚合物干燥過夜，獲得分子印跡聚合物。本發(fā)明制得的聚合物可應(yīng)用于含水量很高的環(huán)境中或生物樣品中土霉素和恩諾沙星殘留檢測及痕量被分析物的富集和基質(zhì)的清除。
文檔編號C08F220/06GK101397355SQ20081020264
公開日2009年4月1日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者張大兵, 武愛波, 瞿國潤 申請人:上海交通大學(xué)