專利名稱：：制備共聚物-1的方法制備共聚物-1的方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求在2005年8月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/708,218的優(yōu)先權(quán)。這個(gè)臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到此。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于制備共聚物-1的改進(jìn)方法。結(jié)構(gòu)式為聚[L-Alaw，L-Glux，L-Lysy，L-Tyrz]n(CH3C02H)，其中w、x、y、z介于0和1之間。優(yōu)選地，共聚物-1具有的L-Ala:L-Glu:L-Lys:L-Tyr的摩爾比近似為0.427:0.150:0.327:0.100，并且偏差可以變化約士10%。2.相關(guān)技術(shù)的描述共聚物-1在多發(fā)性硬化癥的免疫療法中使用。它是由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸構(gòu)成的合成多肽的混合物。已知一種制備共聚物-1的方法(美國(guó)專利3,849,550)，在該方法中，酪氨酸、丙氨酸、Y-芐基谷氨酸和s-N-三氟-乙?；嚢彼岬腘-羧酸酐與作為引發(fā)劑的二乙胺在無(wú)水二噁烷中聚合。谷氨酸的Y-羧基的解封閉是用在冰醋酸中的溴化氫進(jìn)行的，然后用1M哌啶從賴氨酸殘基上移除三氟乙?；?。根據(jù)已知的方法，將芐基酯和N-三氟乙?；Ｗo(hù)基團(tuán)移除需要兩個(gè)獨(dú)立的解封閉。共聚物-l通過(guò)冗長(zhǎng)的滲析法分離，以移除哌啶及其三氟乙?；苌?，并且將共聚物-1轉(zhuǎn)化成乙酸鹽。而且，在酪氨酸N-羧酸酐側(cè)鏈上的未保護(hù)酚基與胺引發(fā)劑反應(yīng)形成親核酚鹽陰離子，使得聚合變復(fù)雜。因此，為了更經(jīng)濟(jì)和更簡(jiǎn)單的商業(yè)合成，需要改進(jìn)現(xiàn)有的方法。3.發(fā)明概述本申請(qǐng)的方法描述了用于制備共聚物-1、具體地為具有所需氨基酸組成和分子量分布的共聚物-1的方法。通過(guò)這種新穎的方法，將現(xiàn)有技術(shù)中用于獲得未保護(hù)的共聚物-1的兩個(gè)獨(dú)立步驟減少為一個(gè)簡(jiǎn)單步驟。該方法包括丙氨酸(Ala-NCA)、y-芐基谷氨酸[Glu(OBzl)-NCA]、s-N-芐基氧羰基賴氨酸[Lys(Z)-NCA]和O-芐基酪氨酸[Tyr(Bzl)-NCA]的N-羧酸酐(NCA)與弓I發(fā)劑在惰性溶劑中的共聚合。Tyr(Bzl)-NCA的選擇提供了穩(wěn)定、結(jié)晶并且容易以高純度獲得的優(yōu)點(diǎn)。涉及四種氨基酸NCAs和二乙胺的共聚合提供了具有可復(fù)制的氨基酸組成和分子量分布的共聚物-1。完成聚合之后，向反應(yīng)混合物中添加水，以沉淀出完全保護(hù)的共聚物-1。在相應(yīng)的保護(hù)共聚物-1上的所有保護(hù)基都可以在唯一一個(gè)步驟中由在冰醋酸中的溴化氫移除。在完成脫保護(hù)時(shí)，移除過(guò)量的氫溴酸和乙酸，以得到氫溴酸鹽形式的粗共聚物-1。將粗共聚物-lHBr鹽溶解在1N乙酸中，并且通過(guò)塞法戴克斯(Sephadex)G25進(jìn)行純化，以移除小分子量物質(zhì)。純化的共聚物-1HBr鹽用碳酸鈉處理成pH8-9，然后用乙酸酸化到pH3-4，從而將HBr鹽轉(zhuǎn)化成共聚物-l乙酸鹽。共聚物-1乙酸鹽可以通過(guò)塞法戴克斯G50用1N乙酸洗脫進(jìn)一步進(jìn)行純化，收集到具有所需分子量范圍的共聚物-1乙酸鹽。以這樣的方式，可以獲得共聚物-1乙酸鹽的良好收率。還發(fā)現(xiàn)，保護(hù)基，在谷氨酸上的Y-芐基或在酪氨酸上的O-節(jié)基的移除，在通過(guò)在冰醋酸中的溴化氫移除時(shí)需要更長(zhǎng)的周期。開(kāi)發(fā)了另一種在溫和條件下，以更高效率并且使用一個(gè)步驟，由其保護(hù)前體獲得共聚物-1的方法。該方法包括丙氨酸(Ala-NCA)、y-叔丁基谷氨酸[Glu(OBut)-NCA]、s-N-叔丁基氧基羰基賴氨酸[Lys(Boc)-NCA]和0-叔丁基酪氨酸[Tyr(But)-NCA]的N-羧酸酐在惰性溶劑中與引發(fā)劑的共聚合。涉及四種氨基酸NCAs和二乙胺的共聚合提供具有可復(fù)制的氨基酸組成和分子量分布的共聚物-1。在聚合完成之后，向反應(yīng)混合物中添加水，以沉淀出完全保護(hù)的共聚物-1。在唯一的一個(gè)步驟中，在相應(yīng)的保護(hù)共聚物-1上的所有保護(hù)基都可以由在冰醋酸中的氯化氫移除。在脫保護(hù)完成后，將過(guò)量氫溴酸和乙酸移除，以產(chǎn)生鹽酸鹽形式的粗共聚物-1。將粗共聚物-1HC1鹽溶解在1N乙酸中，并且通過(guò)塞法戴克斯G25進(jìn)行純化，以移除小分子量物質(zhì)。純化的共聚物-1HC1鹽用碳酸鈉處理到pH8-9，然后用乙酸酸化到pH3-4，從而將HBr鹽轉(zhuǎn)化成共聚物-1乙酸鹽。共聚物-1乙酸鹽可以通過(guò)塞法戴克斯G50用1N乙酸洗脫進(jìn)一步純化，收集到所需分子量范圍的共聚物-1乙酸鹽。以這樣的方式可以獲得共聚物-1乙酸鹽的良好收率。在冰醋酸中的氯化氫可以用三氟乙酸、在二噁烷或乙酸乙酯中的氯化氫代替。所有的氨基酸NCAs都可以通過(guò)相應(yīng)的N-丁基氧基羰基-氨基酸與三光氣和三乙胺在溶劑介質(zhì)中的反應(yīng)進(jìn)行制備[有機(jī)化學(xué)(J.Org.Chem.)1992,57,2755-2756]。Ala-NCA、Glu(OBzl)-NCA、]Lys(Z)-NCA和Tyr(Bzl)-NCA還可以通過(guò)相應(yīng)的N-未保護(hù)的氨基酸與光氣、雙光氣或三光氣的反應(yīng)進(jìn)行制備[四面體快報(bào)(TetrahedronLetters)1988,29,5859-5862]。實(shí)際上，氨基酸NCAs合成的反應(yīng)條件類似。為了降低共聚物-l的生產(chǎn)成本，可以使用丙氨酸、Y-芐基谷氨酸、s-N-節(jié)基氧基羰基賴氨酸和O-芐基酪氨酸的混合物作為起始化合物代替氨基酸NCAs。在一個(gè)反應(yīng)器中，通過(guò)相同的反應(yīng)，可以將氨基酸混合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的氨基酸NCAs混合物。在隨后的共聚合中，可以將氨基酸NCAs轉(zhuǎn)化成共聚物-l。以同樣的方式，還可以將丙氨酸、Y-叔丁基谷氨酸、s-N叔丁基氧基羰基賴氨酸和O-叔丁基酪氨酸的混合物直接用作起始化合物。NCAs的聚合可以通過(guò)上述四種NCAs在溶劑中的簡(jiǎn)單混合而進(jìn)行，所述溶劑比如二噁烷、四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、環(huán)丁砜、硝基苯、四甲基脲、二甲砜或其它能夠溶解NCAs并且產(chǎn)生均相反應(yīng)的惰性溶劑。反應(yīng)通過(guò)添加引發(fā)劑溶液而引發(fā)。有機(jī)胺是優(yōu)選的引發(fā)劑。引發(fā)劑與所使用的總NCA的摩爾比在0.7%至5%的范圍內(nèi)。反應(yīng)可以在任何適宜的溫度進(jìn)行，但是在0-50。C之間的溫度是優(yōu)選的。其它引發(fā)劑包括甲醇鈉、叔丁醇鈉、己胺、苯乙胺或過(guò)渡金屬引發(fā)劑比如bbyNi(COD)、(Pme3)4Co。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示己經(jīng)通過(guò)塞法戴克斯G25柱的共聚物-1HBr的洗脫圖。圖2顯示己經(jīng)通過(guò)塞法戴克斯G-50柱的共聚物-1乙酸鹽的洗脫圖。下面的非限制性實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的其它目的和特征將從下面結(jié)合附圖考慮的詳細(xì)描述中變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，附圖只為說(shuō)明目的而設(shè)計(jì)，并不作為本發(fā)明的范圍的限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)由后附權(quán)利要求限定。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步明白的是，附圖不是必須按比例繪制的，除非另有說(shuō)明，否則它們只是想從概念上說(shuō)明此處描述的結(jié)構(gòu)和程序。下列非限制性實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1用于N-羧酸酐的制備和純化的一般步驟在室溫，將氨基酸和三光氣懸浮在無(wú)水乙酸乙酯或四氫呋喃中。將所得混合物在50-60。C攪拌，直到獲得均勻的溶液。向反應(yīng)混合物中添加正己烷，以沉淀出所需的N-羧酸酐。將粗N-羧酸酐溶解在乙酸乙酯中，并且通過(guò)過(guò)濾移除所有未溶解的物質(zhì)。向NCA乙酸乙酯溶液中添加正己烷，以進(jìn)行NCA的緩慢結(jié)晶。重復(fù)結(jié)晶，以得到具有恒定熔點(diǎn)并且可水解氯的量低于0.05重量％的樣品。實(shí)施例2完全保護(hù)的共聚物-1的制備將0.870g的Ala-NCA、0.596g的Glu(OBzl)-NCA、1.620g的Lys(Z)-NCA和0.450g的Tyr(Bzl)-NCA溶解在40ml二噁烷中，并且向其中添加17ml在二噁烷中的二乙胺(5xl0^g/ml)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。在良好攪拌下，將反應(yīng)混合物傾倒在800ml水中。將白色沉淀物過(guò)濾，并且隨后用水和丙酮洗滌。在真空干燥之后，獲得2.56g(91.3%收率)的完全保護(hù)的共聚物-l。實(shí)施例3共聚物-1HBr的制備將1.5g的被保護(hù)共聚物-1溶解在15ml的40%HBr/HOAc中，并且在30。C攪拌16小時(shí)。將所得反應(yīng)混合物在真空下蒸餾，以移除HBr和乙酸。殘留物用二氯甲烷洗滌5次(每次10ml)，然后用乙醚洗滌3次(每次10ml)，在真空干燥之后得到1.4g淺黃色粉末形式的粗共聚物-lHBr鹽。將200mg粗共聚物-1HBr溶解在4ml的IN乙酸中，將所得溶液裝載在塞法戴克斯G25(04.2x48cm)柱上，所述柱用1N乙酸平衡。收集到介于243429ml的洗脫液(參見(jiàn)圖1)，并且將其凍干，得到149mg的共聚物-1HBr。實(shí)施例4共聚物-1HOAc溶液的制備將150mg共聚物-lHBr溶解在3ml水中，并且在冰浴上冷卻。向該溶液中，添加0.15ml的10%Na2C03溶液(pH89)，然后通過(guò)添加0.2ml乙酸將溶液的pH調(diào)節(jié)到pH34，得到共聚物-1HOAc溶液。實(shí)施例5共聚物-1乙酸鹽的純化將3ml的共聚物HOAc溶液(50mg/ml，在INHOAc中)裝載在塞法戴克斯G50(02.3xl59cm)柱上，所述柱用1N乙酸平衡。收集到介于290~490ml(參見(jiàn)圖2)之間的洗脫液，并且將其凍干，以41%的收率得到61.5mg的具有所需分子量分布的共聚物-1乙酸鹽(共聚物-l編號(hào)200503A)。產(chǎn)物分析共聚物-l編號(hào)200503A6.1氨基酸組成分析在110°C，將0.1mg共聚物-1(編號(hào)200503A)在2ml含苯酚的6NHC1中水解18小時(shí)。所得溶液用日立835氨基酸分析儀(HITACHI835AminoAcidAnalyzer)分析。氨基酸摩爾比顯示在表1中。將名為Copaxone的商購(gòu)共聚物-l用作對(duì)照。表l:共聚物-1的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>共聚物-1(編號(hào)200503A)的分子量分布用Superdex75HR10/30進(jìn)行分析，并且使用蛋白質(zhì)作為Mw標(biāo)記進(jìn)行計(jì)算。流動(dòng)相為含有0.15MNaCl的0.05MPBS，pH為7.0，在230nm處檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示在表2中。將名為Copaxone的商購(gòu)共聚物-1用作對(duì)照。表2:共聚物-1(編號(hào)200503A)通過(guò)Superdex75的GPC分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>因此，盡管已經(jīng)顯示、描述并指出了本發(fā)明的基本的新特征，如應(yīng)用于其優(yōu)選實(shí)施方案的，但是應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在所說(shuō)明的設(shè)計(jì)(device)的形式和細(xì)節(jié)上以及在它們的操作上進(jìn)行各種省略、代替和變化。例如，它確切意圖是，以基本相同的方式發(fā)揮基本相同的功能從而實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果的這些要素和/或方法步驟的所有組合都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。而且，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，與本發(fā)明的任何公開(kāi)的形式或?qū)嵤┓桨附Y(jié)合顯示和/或描述的結(jié)構(gòu)和/或要素和/或方法步驟都可以作為設(shè)計(jì)選擇的一般素材結(jié)合在任何其它公開(kāi)或描述或建議的形式或?qū)嵤┓桨钢?。因此，如所指出的，本發(fā)明只由后附權(quán)利要求的范圍進(jìn)行限制。權(quán)利要求1.一種用于制備共聚物-1的方法，所述方法包括將丙氨酸、ε-N-R1-賴氨酸、O-R2-酪氨酸和γ-R3-谷氨酸的N-羧酸酐與引發(fā)劑在溶劑介質(zhì)中反應(yīng)，以制備出被保護(hù)共聚物-1；以及將所述被保護(hù)共聚物-1脫保護(hù)以制備出共聚物-1，其中所述保護(hù)基R1、R2R3為可以通過(guò)堿分裂、酸解、硫解、氫化或酶催化水解除去的有機(jī)基團(tuán)。2.權(quán)利要求1的方法，其中R,、R2、R3為多于3個(gè)碳原子的垸基和/或芳族基團(tuán)。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述保護(hù)基^選自芐基氧基羰基、4-甲氧基節(jié)基氧基羰基、a,a-二甲基3，5-二甲氧基節(jié)基氧基、2-(4-聯(lián)苯基)異丙氧基羰基、叔丁基氧基羰基、2，2,2-三氯乙氧基羰基、叔戊基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基、烯丙基氧基羰基、鄰-硝基苯基亞磺?；?、三苯甲基、9-芴基甲基氧基羰基、苯基乙?；徒构劝滨；?。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述保護(hù)基R2選自芐基、2,6-二氯芐基、2-溴節(jié)基氧基羰基、叔丁基和2,4-二硝基苯基。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述保護(hù)基R3選自環(huán)己基酯、芐基酯、叔丁基酯、烯丙基酯、金剛垸基、9-芴基甲基。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述共聚物-1是由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸以L-Ala:L-Glu:L-Lys:L-Tyr的摩爾比近似為0.427:0.150:0.327:0.100構(gòu)成的多肽的混合物，并且偏差可以變化約士10%。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述引發(fā)劑為甲醇鈉或叔丁醇鈉。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述引發(fā)劑為胺引發(fā)劑。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述胺引發(fā)劑選自二乙胺、己胺和苯乙胺。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述引發(fā)劑為過(guò)渡金屬引發(fā)劑。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述過(guò)渡金屬引發(fā)劑為bbyNi(COD)或(Pme3)4Co。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑選自醚、二噁烷、四氫呋喃、二氯甲垸、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、環(huán)丁砜、硝基苯、四甲基脲和二甲砜。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1由O-芐基-酪氨酸、丙氨酸、Y-芐基-谷氨酸和e-N-芐基氧基羰基-賴氨酸的N-羧酸酐制備。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1由O-叔丁基-酪氨酸、丙氨酸、Y-叔丁基-谷氨酸和s-N-叔丁基氧基羰基-賴氨酸的N-羧酸酐制備。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1是使用三光氣、光氣或雙光氣和引發(fā)劑，由O-芐基-酪氨酸、丙氨酸、Y-芐基-谷氨酸和s-N-芐基氧基羰基-賴氨酸的混合物進(jìn)行制備的。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1是使用三乙胺/三光氣、光氣或雙光氣和引發(fā)劑，由N-叔丁基氧基羰基保護(hù)的O-叔丁基-酪氨酸、丙氨酸、丫-叔丁基-谷氨酸和s-N-叔丁基氧基羰基-賴氨酸的混合物進(jìn)行制備的。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1的脫保護(hù)是通過(guò)與在冰醋酸中的溴化氫反應(yīng)進(jìn)行的。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述被保護(hù)共聚物-1的脫保護(hù)是通過(guò)在乙酸、二噁烷或乙酸乙酯的溶劑介質(zhì)中與三氟乙酸或氯化氫反應(yīng)進(jìn)行的。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶劑介質(zhì)為醚，而所述引發(fā)劑為二乙胺。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述共聚物-1通過(guò)塞法戴克斯G25或塞法戴克斯G50進(jìn)行純化。全文摘要共聚物-1是由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸構(gòu)成的合成多肽的混合物。本發(fā)明涉及用于制備共聚物-1的改進(jìn)方法，其特征在于被保護(hù)共聚物-1的解封閉，所述解封閉是在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行的。本發(fā)明的方法具有高收率和容易制備的優(yōu)點(diǎn)。共聚物-1是治療多發(fā)性硬化癥的有用藥物。文檔編號(hào)C08F283/00GK101243113SQ200680029859公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日發(fā)明者丁進(jìn)國(guó),劇才鍔,吉明方,徐萊根,王浩悅,石家豪,陳偉宏申請(qǐng)人:陳偉宏