本發(fā)明涉及二肽的結(jié)晶及其制備方法。

背景技術(shù)：
一般而言，要求藥品等被人體攝取的化合物盡可能去除雜質(zhì)，特別是去除非天然化合物。例如，日美EU三極藥品認(rèn)證審察調(diào)和國際會議(ICH)的醫(yī)藥品原藥指導(dǎo)手冊中記載了應(yīng)當(dāng)將雜質(zhì)控制在0.05重量％以下。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是可以在輸液成分等藥品原料和化妝品等中使用的二肽，在藥品原料等中使用時(shí)需要達(dá)到這種標(biāo)準(zhǔn)。作為通過化學(xué)合成法進(jìn)行的二肽的制備方法，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備方法，已知的有N-芐氧羰基丙氨酸與添加了保護(hù)基的谷氨酰胺相縮合，脫保護(hù)進(jìn)行合成的方法(非專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)2)、N-芐氧羰基丙氨酸與沒有保護(hù)基的谷氨酰胺相縮合，脫保護(hù)進(jìn)行合成的方法(專利文獻(xiàn)1)、通過使N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物與氨反應(yīng)進(jìn)行合成的方法(專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3)等。作為使用酶或微生物制備在構(gòu)成成分中不含D-氨基酸的二肽的方法，已知有使L-氨基酸酰胺水解酶作用于L-氨基酸酰胺和L-氨基酸的方法(專利文獻(xiàn)3)、使各種微生物作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法(專利文獻(xiàn)4)、使脯氨酸亞氨肽酶作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法(專利文獻(xiàn)5)、使來源于穩(wěn)桿菌屬(Empedobacter)或鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)細(xì)菌的酶作用于L-氨基酸酯或L-氨基酯酸酰胺和L-氨基酸的方法(專利文獻(xiàn)6)和采用具有由1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的方法(專利文獻(xiàn)7)等。這些方法中，化學(xué)合成法容易引起氨基的異構(gòu)化和三肽的副產(chǎn)品、例如、非專利文獻(xiàn)3中記載了通過重復(fù)再結(jié)晶獲得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶中殘留了0.19％的D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。而且，還提示在以氨基酸酯和氨基酸酰胺作為原料的酶合成法中可能生成由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽(專利文獻(xiàn)6)。因此，希望不含下述雜質(zhì)等的二肽的結(jié)晶及其制備方法，所述雜質(zhì)為以D-氨基酸作為構(gòu)成成分的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽。非專利文獻(xiàn)1：Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)非專利文獻(xiàn)2：Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962)非專利文獻(xiàn)3：Org.ProcessRes.Dev.，4，147(2000)專利文獻(xiàn)1：美國專利第5,032,675號專利文獻(xiàn)2：特開平6-234715號專利文獻(xiàn)3：國際公開號第03/010187號小冊子專利文獻(xiàn)4：國際公開號第03/010189號小冊子專利文獻(xiàn)5：國際公開號第03/010307號小冊子專利文獻(xiàn)6：國際公開號第2004/022733號小冊子專利文獻(xiàn)7：國際公開號第2004/058960號小冊子

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供下述二肽的結(jié)晶及其制備方法，所述二肽的結(jié)晶基本上不含構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽和三肽。用于解決問題的方法本發(fā)明涉及以下(1)～(11)：(1)二肽的結(jié)晶，其基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽。(2)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶，其基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽。(3)上述(2)的結(jié)晶，其中構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽是D-丙氨酰-L-谷氨酰胺，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽是丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺。(4)上述(1)～(3)中任一項(xiàng)的結(jié)晶，其基本上不含氨基酸酰胺。(5)上述(4)的結(jié)晶，其中氨基酸酰胺是丙氨酰胺。(6)上述(1)～(5)中任一項(xiàng)的結(jié)晶的制備方法，其包括下述步驟：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)下述微生物，使之在該培養(yǎng)基中生成、積累二肽，其中所述微生物具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力，以及具有生產(chǎn)下述蛋白質(zhì)的能力，所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸和甘氨酶的1種以上的氨基酸生成二肽的活性，(7)上述(6)的制備方法，其中具有由選自L-氨基酸和甘氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)是選自下述[1]～[4]的蛋白質(zhì)：具有序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；由與序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少65％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成的、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)；由在序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)；含有與序列號18所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、并且具有二肽的合成活性的蛋白質(zhì)；(8)上述(6)或(7)的制備方法，其中選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸是L-丙氨酸或L-谷氨酰胺，二肽是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。(9)上述(2)～(5)任一項(xiàng)的結(jié)晶的制備方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有下述能力的微生物，使之在培養(yǎng)物中生成、積累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后，進(jìn)行下述的[1]或[2]的步驟：對含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養(yǎng)物、或由該培養(yǎng)物制備的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液進(jìn)行加熱處理的步驟；由含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養(yǎng)物制備含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液，通過向該溶液中添加甲醇使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺析出結(jié)晶的步驟；其中，所述微生物具有生產(chǎn)L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力、以及具有生產(chǎn)下述蛋白質(zhì)的能力，所述蛋白質(zhì)具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性。(10)上述(2)～(5)任一項(xiàng)的結(jié)晶的制備方法，其特征在于，使用具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白質(zhì)、具有生產(chǎn)該蛋白質(zhì)能力的微生物的培養(yǎng)物、或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源、L-丙氨酸和L-谷氨酰胺共存于水性介質(zhì)中，在該水性介質(zhì)中生成、積累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，從該水性介質(zhì)制備含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液后，通過向該溶液中添加甲醇使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺析出結(jié)晶。(11)上述(10)的制備方法，具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白質(zhì)是選自下述的[1]～[4]的蛋白質(zhì)：具有序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；由與序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少65％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白質(zhì)；由在序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白質(zhì)；含有與序列號18所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，并且具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性的蛋白質(zhì)。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以制備下述二肽的結(jié)晶，其中基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽。具體實(shí)施方式1.本發(fā)明的二肽的結(jié)晶作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，其中基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，可以例舉下述二肽的結(jié)晶：其中基本上不含在構(gòu)成成分中含有1種或2種以上的構(gòu)成目的二肽結(jié)晶的氨基酸的D型氨基酸的二肽、和在構(gòu)成成分中含有構(gòu)成目的二肽結(jié)晶的氨基酸和/或該氨基酸的D型氨基酸的由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的1種或2種以上的多肽、優(yōu)選1種或2種以上的三肽。在本發(fā)明中作為在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例舉在構(gòu)成成分中含有選自下述氨基酸的二肽，所述氨基酸為：D-丙氨酸(D-Ala)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-纈氨酸(D-Val)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-異亮氨酸(D-Ile)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-色氨酸(D-Trp)、D-蛋氨酸(D-Met)、D-絲氨酸(D-Ser)、D-蘇氨酸(D-Thr)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-酪氨酸(D-Tyr)、D-賴氨酸(D-Lys)、D-精氨酸(D-Arg)、D-組胺酸(D-His)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-α-氨基丁酸(D-α-AB)、D-重氮絲氨酸(D-Azaserine)、D-茶氨酸(D-theanine)、4-羥基-D-脯氨酸(4-D-HYP)、3-羥基-D-脯氨酸(3-D-HYP)、D-鳥氨酸(D-Orn)、D-瓜氨酸(D-Cit)和6-重氮基-5-羰基-D-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-D-norleucine)等D-氨基酸。此外，在本發(fā)明中，作為由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，可以例舉由選自下述氨基酸等的3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，優(yōu)選三肽，所述氨基酸為：丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬氨酸(Asp)、α-氨基丁酸(α-AB)、重氮絲氨酸(Azaserine)、茶氨酸(theanine)、4-羥基脯氨酸(4-HYP)、3-羥基脯氨酸(3-HYP)、鳥氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、D-6-重氮基-5-羰基正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-norleucine)、甘氨酸(Gly)和β-丙氨酸(β-Ala)。作為本發(fā)明的基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶，只要是基本上不含上述構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶，可以是任何二肽的結(jié)晶，不過優(yōu)選可以例舉有由選自下述氨基酸中的1種或2種氨基酸構(gòu)成的二肽的結(jié)晶，所述氨基酸為：L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-纈氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-異亮氨酸(L-Ile)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-絲氨酸(L-Ser)、L-蘇氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-組胺酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α-氨基丁酸(L-α-AB)、L-重氮絲氨酸(L-Azaserine)、L-茶氨酸(L-theanine)、4-羥基-L-脯氨酸(4-L-HYP)、3-羥基-L-脯氨酸(3-L-HYP)、L-鳥氨酸(L-Orn)、L-瓜氨酸(L-Cit)、6-重氮基-5-羰基-L-正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、Gly和β-Ala。而且，作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，優(yōu)選基本上不含下述二肽或多肽，所述二肽為作為構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例舉有構(gòu)成成分中含有1種或2種以上的選自D-Ala、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Gln、D-Glu、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Pro、D-Phe、D-Trp、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-Asp、D-α-AB、4-D-HYP、3-D-HYP、D-Orn和D-Cit等的D-氨基酸的二肽，所述多肽作為3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，在構(gòu)成成分中含有選自Ala、Met、Ser、Thr、Gln、Glu、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Asn、Tyr、Lys、Arg、His、Asp、α-AB、4-HYP、3-HYP、Orn、Cit、Gly和β-Ala等的3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的1種或2種以上的多肽、優(yōu)選1種或2種以上的三肽，作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶可列舉式(I)表示的二肽的結(jié)晶：R1-R2(I)[其中，R1為L-Ala、L-Met、L-Ser、L-Thr或β-Ala，R2為L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit或Gly]，更優(yōu)選地，本發(fā)明的二肽的結(jié)晶基本上不含下述在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，其中，作為構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例舉有構(gòu)成成分中含有1種或2種以上選自D-Ala、D-Gln、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Phe、D-Trp、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-α-AB和D-Cit等的D-氨基酸的二肽；作為由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，可以例舉在構(gòu)成成分中含有選自Ala、Gln、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Ser、Thr、Cys、Asn、Tyr、Lys、Arg、His、α-AB、Cit、Gly和β-Ala等3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的1種或2種以上的多肽，優(yōu)選1種或2種以上的三肽，可以列舉有式(II)表示的二肽的結(jié)晶，R3-R4(II)[其中，R3為L-Ala時(shí)，R4為L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB或L-Cit，R3為Gly時(shí)，R4為L-Gln、Gly、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-α-AB或L-Cit，R3為L-Met時(shí)，R4為L-Phe、L-Met、L-Cys、L-Tyr、L-Lys或L-His，R3為L-Ser時(shí)，R4為L-Gln、Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His或L-α-AB，R3為L-Thr時(shí)，R4為L-Gln、L-Leu、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr或L-α-AB，R3為L-Gln時(shí)，R4為L-Phe或L-α-AB，R3為L-Phe時(shí)，R4為L-Gln，R3為L-Trp時(shí)，R4為Gly，R3為L-Cys時(shí)，R4為L-Ala、L-Gln、Gly或L-Met，R3為L-Lys時(shí)，R4為L-Ala、Gly或L-Met，R3為L-Arg時(shí)，R4為L-α-AB，R3為L-His時(shí)，R4為L-Met，R3為L-α-AB時(shí)，R4為L-Ala、L-Gln、Gly、L-Ser、L-Thr、L-Arg或L-α-AB，R3為β-Ala時(shí)，R4為L-His]。作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，更為優(yōu)選基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，其中，作為構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例舉有選自L-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB和L-Cit等的L-氨基酸的氨基與選自D-Ala、D-Gln、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Phe、D-Trp、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-α-AB和D-Cit等的D-氨基酸的羧基形成肽鍵的二肽，作為由3個(gè)以上氨基酸構(gòu)成的多肽，是在構(gòu)成成分中含有3個(gè)以上選自L-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB、L-Cit、Gly和β-Ala等的氨基酸構(gòu)成的1種或2種以上的多肽、優(yōu)選1種或2種以上的三肽，可列舉式(II)[其中，R3和R4均與上述意義相同]表示的二肽的結(jié)晶。作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，作為特別優(yōu)選，可以例舉下述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶，其中，其中基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽，和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，所述在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽是D-Ala-L-Gln，作為由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的二肽為丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Ala-Gln)。而且，作為本發(fā)明的基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶，除了上述的結(jié)晶之外，還可以例舉有基本上不含氨基酸酰胺的結(jié)晶。作為氨基酸酰胺，可以例舉有選自丙氨酰胺(AlaNH2)、甘氨酰胺和天冬氨-α-酰胺的氨基酸酰胺，優(yōu)選AlaNH2。作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，優(yōu)選這樣的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺結(jié)晶：其基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽如D-Ala-L-Gln、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽如Ala-Ala-Gln和氨基酸酰胺如AlaNH2。而且，本發(fā)明的二肽的結(jié)晶可以是任意一種晶形，例如，可以例舉有針狀結(jié)晶等。所謂基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，是指在本發(fā)明的二肽的結(jié)晶中的重量％為可以例舉：(a)構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.014重量％，優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.010重量％以下，更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.005重量％以下，更為優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.002重量％以下、或構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004重量％，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.032重量％，優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.003重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.020重量％以下，更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.010重量％以下，更為優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.005重量％以下，特別優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002重量％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.002重量％以下。所謂的基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、和氨基酸酰胺，可以例舉，在二肽的結(jié)晶中的重量％為：(b)在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004重量％，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.032重量％，并且氨基酸酰胺不到0.023重量％；優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.003重量％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.020重量％以下，并且氨基酸酰胺為0.015重量％以下；更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002重量％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.010重量％以下，并且氨基酸酰胺為0.012重量％以下；更為優(yōu)選、構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002重量％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.002重量％以下，并且氨基酸酰胺為0.009重量％以下。而且，所謂的基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、并且基本上不含由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，是指可以例舉，與用HPLC分析本發(fā)明的二肽的結(jié)晶時(shí)的本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的峰對應(yīng)的區(qū)域％為：(c)構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.018％；優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.013％以下；更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.006％以下；更為優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.05％以下，并且3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.003％以下，或構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.004％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.032％；優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.003％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.026％以下；更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.018％以下；更為優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002％以下，并且由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.013％以下。所謂基本上含構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、和氨基酸酰胺，是指可以例舉，與用HPLC分析本發(fā)明的二肽的結(jié)晶時(shí)的本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的峰對應(yīng)的區(qū)域％為：(d)構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004％，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽不到0.041％，并且氨基酸酰胺不到0.005％；優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.003％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.026％以下，并且氨基酸酰胺為0.003％以下；更優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.013％以下，并且氨基酸酰胺為0.003％以下；更為優(yōu)選構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽為0.002％以下，由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽為0.002％以下，并且氨基酸酰胺為0.002％以下。此外，作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶，可以列舉基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽，并且二肽占全部二肽結(jié)晶的區(qū)域％或重量％為優(yōu)選99.90％以上、更優(yōu)選99.91％以上、更為優(yōu)選99.92％以上的二肽的結(jié)晶；以及基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、和氨基酸酰胺，并且區(qū)域％或重量％為優(yōu)選99.90％以上、更優(yōu)選99.91％以上、更為優(yōu)選99.92％以上的二肽的結(jié)晶。作為本發(fā)明的二肽的結(jié)晶中的構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、氨基酸酰胺、和本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的重量％的測定法，只要是可以測定上述各成分的量的方法，可以是任意一種方法，例如適合使用用HPLC等分離本發(fā)明的二肽的結(jié)晶中所含的各種成分，基于參照標(biāo)準(zhǔn)的峰面積和量，根據(jù)其面積計(jì)算各成分的量的方法。而且，對應(yīng)于本發(fā)明的二肽的結(jié)晶中的構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、和氨基酸酰胺的本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的峰的區(qū)域％，可以通過用HPLC分離上述各成分，計(jì)算對應(yīng)于本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的峰面積的各成分的峰面積來測定。作為HPLC的分析條件，例如可以例舉下述分析條件：分析條件柱：InertsilODS-3V(GLscience公司制)柱溫度：30℃移動相：溶液A[0.01mol/l庚烷磺酸鈉、0.01mol/l磷酸二氫鉀(pH2.5)]∶甲醇＝99∶1流量：1.2ml/min檢測：UV210nm還可以列舉有可以根據(jù)提供給分析的二肽的試樣中所含的構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、和氨基酸酰胺的種類，適當(dāng)變更移動相的溶液組成，使用采用多種溶液的濃度調(diào)配溶液，變更檢測波長等，并用FMOC(fluorenylmethylchloroformate)等將試樣中的物質(zhì)衍生物化，檢測其發(fā)光的方法等。2.本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的制備方法本發(fā)明的結(jié)晶可以通過以下方法制備：使用具有由選自i)L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)、具有生產(chǎn)該蛋白質(zhì)能力的微生物的培養(yǎng)物、或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源以及選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸共存于水性介質(zhì)中，使之在該水性介質(zhì)中生成、積累二肽，從該水性介質(zhì)中獲取二肽的結(jié)晶的方法；ii)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有下述能力的微生物，所述微生物具有生成、積累選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力，以及生產(chǎn)具有可由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力，使該微生物在該培養(yǎng)基中生成、積累二肽，從該培養(yǎng)基獲取二肽的結(jié)晶的方法等。(1)本發(fā)明的制備方法中使用的蛋白質(zhì)(a)作為本發(fā)明的制備方法中使用的具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，只要是具有該活性的蛋白質(zhì)，就沒有特別的限定，例如，可以例舉有以下[1]～[4]中記載的蛋白質(zhì)：具有序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；由與序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少65％以上，優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)；由在序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)；含有與序列號18所示的氨基酸序列具有80％以上，優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的的同源性的氨基酸序列，并且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)。序列號18所示的氨基酸序列是具有序列號1～7所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)之間的保守區(qū)域，并且是各種微生物的具有Ala-Ala連接酶活性的蛋白質(zhì)的共有序列的對應(yīng)的區(qū)域。因此，含有與序列號18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)是還具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。為了使含有與序列號18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)是具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與序列號1～7任一項(xiàng)所示的氨基酸序列之間的同源性理想的是具有至少65％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的同源性。在上述內(nèi)容中，由缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)可以通過采用MolecularCloning，ALaboratoryManual，ThridEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)(以下、簡稱為分子克隆第3版)、CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下、簡稱為分子生物學(xué)現(xiàn)行操作規(guī)程)、NucleicAcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、NucleicAcidsResearch，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中記載的位點(diǎn)特異的變異導(dǎo)入法，在編碼例如由序列號1～8所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有二肽生成活性的蛋白質(zhì)的任一蛋白質(zhì)的DNA中導(dǎo)入位點(diǎn)特異的變異來獲得。缺失、取代或添加的氨基酸的數(shù)目只要是可以通過上述的位點(diǎn)特異的變異法等公知的方法進(jìn)行缺失、取代或添加的程度的數(shù)目，就沒有特別的限定，通常為1個(gè)至數(shù)十個(gè)、優(yōu)選1～20個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、更為優(yōu)選1～5個(gè)。所謂在由序列號1～8所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)中的任一個(gè)中缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸，是指也可以在同一序列中的任意位置中缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸。缺失、取代或添加可以同時(shí)發(fā)生，取代或添加的氨基酸可以是天然型或非天然型。作為天然型氨基酸，可以例舉有L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-組胺酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。以下，列出可以相互取代的氨基酸的例子。包含于同一組中的氨基酸可以相互取代。A組：亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組：天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組：天冬酰胺、谷氨酰胺D組：賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E組：脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組：絲氨酸、蘇氨酸、同型絲氨酸G組：苯丙氨酸、酪氨酸另外，導(dǎo)入缺失、取代或添加上述的1個(gè)以上的氨基酸的位置只要是使具有導(dǎo)入了該變異的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有二肽合成活性的位置，就沒有特別限定，例如可例舉與用公知的比對軟件比較序列號1～8所示的氨基酸序列時(shí)，在所有氨基酸序列中的1個(gè)以上氨基酸序列中不保守的氨基酸。作為公知的比對軟件，可以例舉有例如包含于基因分析軟件Genetyx(軟件開發(fā)株式會社)中的比對分析軟件?？梢允褂媚J(rèn)值作為該分析軟件的分析參數(shù)。此外，作為上述的缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，可以列舉，例如與序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的同源性為至少65％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的蛋白質(zhì)。在上述內(nèi)容中，氨基酸序列或堿基序列的同源性可以采用Karlin和Altschul提出的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或FASTA[MethodsEnzymol.，183，63(1990)]進(jìn)行測定?；谠揃LAST算法，已經(jīng)開發(fā)了一般稱為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。在基于BLAST以BLASTN分析堿基序列時(shí)，參數(shù)為例如Score＝100，wordlength＝12。而且，基于BLAST用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)為例如score＝50，wordlength＝3。在使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。(b)作為本發(fā)明的具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，只要是具有該活性的蛋白質(zhì)，就沒有特別的限定，例如，可以例舉有以下[5]～[8]中記載的蛋白質(zhì)：具有序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，由與序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少65％以上，優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，由在序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，含有與序列號18所示的氨基酸序列具有80％以上，優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的的同源性的氨基酸序列，并且具有合成二肽的活性的蛋白質(zhì)。序列號18所示的氨基酸序列為具有上述(a)特征的序列。因此，含有與序列號18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列的、并且具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)是還具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。為了含有與序列號18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)是具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與序列號1～7任一項(xiàng)所示的氨基酸序列之間的同源性理想的是具有至少65％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的同源性。在上述內(nèi)容中，由缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，與上述(a)同樣可以通過分子克隆第3版等中記載的方法獲得。缺失、取代或添加的氨基酸的數(shù)目與上述(a)相同。所謂在由序列號1～8所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)任一個(gè)中缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸與上述(a)相同。缺失、取代或添加可以同時(shí)發(fā)生，取代或添加的氨基酸與上述(a)相同。另外，導(dǎo)入缺失、取代或添加上述的1個(gè)以上氨基酸的位置只要是使導(dǎo)入該變異的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有二肽合成活性的位置，就沒有特別限定，例如可例舉與上述(a)相同的位置。此外，作為上述缺失、取代或添加了1個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)并且具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，可以列舉與上述(a)相同的蛋白質(zhì)。在上述內(nèi)容中，氨基酸序列或堿基序列的同源性可以采BLAST或FASTA測定。(2)本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的制備中使用的微生物(a)作為本發(fā)明的具有生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)能力的微生物，只要是具有生產(chǎn)上述(1)的(a)的蛋白質(zhì)的能力的微生物，就沒有特別的限定，但可以列舉，例如具有生產(chǎn)上述(1)的(a)的[1]～[4]中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)能力的微生物。作為選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸，優(yōu)選可以列舉選自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、L-Azaserine、L-theanine、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit、L-6-diazo-5-oxo-L-norleucine、Gly和β-Ala中的1種以上的氨基酸，更優(yōu)選選自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit、Gly和β-Ala中的2種氨基酸，更為優(yōu)選L-Ala和L-Gln。作為上述具有生產(chǎn)(1)的(a)的[1]～[4]任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)能力的微生物，可以列舉，例如記載于WO2004/058960號中的具有桿菌溶素合成酶基因的屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物、優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、更優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168株(ATCC23857)、枯草芽孢桿菌ATCC15245、枯草芽孢桿菌ATCC6633、枯草芽孢桿菌IAM1213、枯草芽孢桿菌IAM1107、枯草芽孢桿菌IAM1214、枯草芽孢桿菌ATCC9466、枯草芽孢桿菌IAM1033、枯草芽孢桿菌ATCC21555、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)IFO3022和經(jīng)編碼上述(1)的[1]～[4]任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物。作為編碼上述(1)的[1]～[4]的蛋白質(zhì)的DNA，可以列舉：具有序列號9～17任一項(xiàng)所示的堿基序列的DNA，與具有與序列號9～17任一項(xiàng)所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并且編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA、和包括與序列號19表示的堿基序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的堿基序列、并且編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。這里所稱“雜交”是DNA與具有特定堿基序列的DNA或該DNA的一部分雜交的步驟。因此，該具有特定堿基序列的DNA或該DNA的一部分的堿基序列可用作Northern或Southern分析的探針，或者也可以是可用作PCR分析的寡核苷酸引物使用的長度的DNA。作為探針使用的DNA，可以列舉至少100堿基以上、優(yōu)選200堿基以上、更優(yōu)選500堿基以上的DNA，但也可以是至少10堿基以上、優(yōu)選15堿基以上的DNA。DNA的雜交實(shí)驗(yàn)方法是公知的，例如，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以按照本申請說明書確定雜交的條件。該雜交的條件可以按照分子克隆第2版、第3版(2001年)、MethodsforGeneralandMolecularBacteriolgy，ASMPress(1994)、Immunologymethodsmanual，Academicpress(Molecular)中記載以及其它多種標(biāo)準(zhǔn)的教科書進(jìn)行。上述的“嚴(yán)格條件”，是指可以采用例如在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化鈉、75mM的檸檬酸鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％的硫酸葡聚糖、和20μg/l變性的鮭魚精子DNA的溶液中將固定了DNA的濾膜與探針DNA于42℃溫育一晚后，例如在約65℃的0.2×SSC溶液中清洗該濾膜的條件，但也可以使用更低的嚴(yán)格條件。嚴(yán)格條件的變化可以通過調(diào)整甲酰胺的濃度(甲酰胺的濃度降得越低，嚴(yán)格度越低)、改變鹽濃度和溫度條件進(jìn)行。作為低嚴(yán)格條件，可以列舉，例如在含有6×SSCE(20×SSCE為3mol/l的氯化鈉、0.2mol/l的磷酸二水素鈉、0.02mol/l的EDTA、pH7.4)、0.5％的SDS、30％的甲酰胺、100μg/l的變性的鮭魚精子DNA的溶液中，于37℃溫育一晚后，用50℃的1×SSC、0.1％SDS溶液清洗的條件。而且，作為更低嚴(yán)格條件，可以列舉在上述低嚴(yán)格條件中，用高鹽濃度(例如5×SSC)的溶液進(jìn)行雜交后，再清洗的條件。上述各種條件，還可以通過添加、或改變用于抑制雜交實(shí)驗(yàn)的背景的封閉試劑來設(shè)定。上述封閉試劑的添加可以伴隨雜交條件的改變以使之適應(yīng)條件。作為可以在上述嚴(yán)格條件下雜交的DNA，可以列舉，例如，用上述BLAST和FASTA等程序，基于上述參數(shù)計(jì)算時(shí)，與上述任一DNA的堿基序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的DNA。堿基序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序測定。可以通過制作表達(dá)該DNA的重組DNA，使用將該重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得的微生物作為酶源，使該酶源和選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸共存于水性介質(zhì)中，通過HPLC等分析是否在該水性介質(zhì)中生成積累二肽的方法來確認(rèn)與上述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。(b)作為可以在本發(fā)明的制備方法中使用的具有生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)能力以及具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力的微生物，只要是具有該能力的微生物，就沒有特別的限定，但是，可以列舉，例如具有生產(chǎn)上述(1)的(b)的[5]～[8]中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)能力的微生物，并且具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力的微生物。作為選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸，可以列舉優(yōu)選L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit和Gly的1種以上的氨基酸、更優(yōu)選選自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB和Gly的2種氨基酸、更為優(yōu)選L-Ala和L-Gln。作為具有生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)能力、和具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力的微生物，可以列舉具有生產(chǎn)上述(1)的(b)的蛋白質(zhì)能力、和具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力的微生物。作為該微生物，可以列舉被編碼上述(1)的(b)的[5]～[8]的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物，并且強(qiáng)化了生產(chǎn)、蓄積選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物。作為編碼(1)的(b)的[5]～[8]的蛋白質(zhì)的DNA，可以列舉[12]具有序列號9～17任一項(xiàng)所示的堿基序列的DNA、與具有與序列號9～17任一項(xiàng)所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并且編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA、和包括與序列號19表示的堿基序列具有至少80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的堿基序列、并且編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。所謂上述“雜交”與上述(a)意義相同。通過制備表達(dá)該DNA的重組DNA，使用通過在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入該重組DNA獲得的微生物作為酶源，使該酶源、選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸共存于水性介質(zhì)中，通過HPLC等分析該水性介質(zhì)中是否生成、積累二肽的方法，可以確認(rèn)與上述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是編碼具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。(c)本發(fā)明的制備方法中使用的生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物、以及具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力和由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生產(chǎn)二肽能力的微生物是上述(a)或(b)的微生物，同時(shí)1)具有1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)(以下、簡稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì))的活性降低或喪失的微生物、或2)3種以上的肽酶的活性降低或喪失的微生物。1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物，可以列舉，只要該微生物能正常生長，降低或喪失任意1種以上的肽酶和任意1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性的微生物；優(yōu)選1種以上9種以下、更優(yōu)選1種以上7種以下、更為優(yōu)選1種以上4種以下的肽酶的活性降低或喪失，并且優(yōu)選1種以上5種以下、更優(yōu)選1種以上3種以下、更為優(yōu)選1種以上2種以下、尤為優(yōu)選1種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物。作為這種該微生物，更具體的是，存在于該微生物的基因組DNA的編碼肽酶的基因(以下、簡稱為肽酶基因)和編碼肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因(以下、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因)中，1種以上的肽酶基因的堿基序列和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因的堿基序列中，由于缺失該堿基序列的全部或一部分，或該堿基序列中存在堿基的取代或添加，而導(dǎo)致該肽酶和該肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物。所謂肽酶的活性降低，是指與上述堿基沒有發(fā)生缺失、取代或添加的肽酶相比，肽分解活性最好不降低，優(yōu)選與由沒有發(fā)生上述堿基的缺失、取代或添加的野生型基因編碼的肽酶相比，肽酶活性降低了至少20％以上、更優(yōu)選50％以上、更為優(yōu)選80％以上、特別優(yōu)選90％以上。微生物的肽分解活性可以通過以下方法測定：使作為基質(zhì)的肽與微生物菌體共存于水性介質(zhì)中，進(jìn)行肽分解反應(yīng)后，用公知的方法例如采用HPLC的分析法等定量殘存的肽量。作為上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白質(zhì)可以是任意一種，可以列舉，優(yōu)選二肽分解活性高的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選二肽酶。作為更具體的肽酶，可以列舉，例如存在于大腸桿菌的具有序列號20所示的氨基酸序列的PepA、具有序列號21所示的氨基酸序列的PepB、具有序列號22所示的氨基酸序列的PepD、具有序列號23所示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank登記號(以下、簡稱為GenBank)AAC75946]、PepQ(GenBankAAC76850)、PepE(GenBankAAC76991)、PepT(GenBankAAC74211)、Dcp(GenBankAAC74611)和IadA(GenBankAAC77284)等、存在于枯草芽孢桿菌中的AmpS(GenBankAF012285)、PepT(GenBankX99339)、YbaC(GenBankZ99104)、YcdD(GenBankZ99105)、YjbG(GenBankZ99110)、YkvY(GenBankZ99111)、YqjE(GenBankZ99116)、YwaD(GenBankZ99123)等、存在于谷氨酸棒桿菌的具有BAB97732、BAB97858、BAB98080、BAB98880、BAB98892、BAB99013、BAB99598和BAB99819(均為日本DNA數(shù)據(jù)庫的登錄號)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等、存在于釀酒酵母的OCT1(GenBankNC_001143)、SPC2(GenBankNC_003143)、SPY2[Saccharomycesgenomedatabase(http://www.yeastgenome.org/)登記號L0002875]和YIM1(GenBankNC_001145)等，作為二肽酶，可以列舉具有序列號20～23所示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、和PepQ、PepE、IadA。而且，可以列舉于序列號20～23任一項(xiàng)的氨基酸序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性并且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)作為二肽分解活性高的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序進(jìn)行測定。而且，所謂肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(peptideincorporatingprotein)的活性降低，是指與上述堿基沒有發(fā)生缺失、取代或添加的DNA編碼的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)相比，肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性最好不降低，優(yōu)選與由沒有發(fā)生上述堿基的缺失、取代或添加的野生型基因編碼的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)相比，肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)活性降低了至少20％以上、更優(yōu)選50％以上、更為優(yōu)選80％以上、特別優(yōu)選90％以上。微生物的肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性可以通過以下方法測定：使作為基質(zhì)的肽與微生物菌體共存于水性介質(zhì)中，進(jìn)行肽轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)后，用公知的方法例如采用HPLC的分析法等定量水性介質(zhì)中殘存的肽量。作為上述肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，只要是染色體DNA上形成操縱子的基因所編碼的蛋白質(zhì)、通過在細(xì)胞膜上形成復(fù)合體表達(dá)二肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)、和作為單獨(dú)的蛋白質(zhì)具有肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)等與微生物的肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以是任意一種，優(yōu)選可以列舉肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性高的蛋白質(zhì)。作為更具體的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，例如存在于大腸桿菌的具有序列號24所示的氨基酸序列的DppA、具有序列號25所示的氨基酸序列的DppB、具有序列號26所示的氨基酸序列的DppC、具有序列號27所示的氨基酸序列的DppD、具有序列號28所示的氨基酸序列的DppF、OppA(GenBankAAC76569)、OppB(GenBankAAC76568)、OppC(GenBankAAC76567)、OppD(GenBankAAC76566)、OppF(GenBankAAC76565)、YddO(GenBankAAC74556)、YddP(GenBankAAC74557)、YddQ(GenBankAAC74558)、YddR(GenBankAAC74559)、YddS(GenBankAAC74560)、YbiK(GenBankAAC73915)、MppA(GenBankAAC74411)、SapA(GenBankAAC74376)、SapB(GenBankAAC74375)、SapC(GenBankAAC74374)、SapD(GenBankAAC74373)、和SapF(GenBankAAC74372)等、存在于枯草芽孢桿菌的DppA(GenBankCAA40002)、DppB(GenBankCAA40003)、DppC(GenBankCAA40004)、DppD(GenBankCAA40005)、DppE(GenBankCAA40006)、OppA(GenBankCAA39787)、OppB(GenBankCAA39788)、OppC(GenBankCAA39789)、OppD(GenBankCAA39790)、OppF(GenBankCAA39791)、AppA(GenBankCAA62358)、AppB(GenBankCAA62359)、AppC(GenBankCAA62360)、AppD(GenBankCAA62356)、AppF(GenBankCAA62357)、YclF(GenBankCAB12175)和YkfD(GenBankCAB13157)等、存在于谷氨酸棒桿菌的具有BAB99048、BAB99383、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832(均為日本DNA數(shù)據(jù)庫的登錄號)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等、存在于釀酒酵母的OPT1(GenBankNP_012323)、OPT2(GenBankNP_015520)和PTR2(GenBankCAA82172)等，而且，作為肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性高的蛋白質(zhì)，可以例舉有具有序列號24～28所示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和與它們的氨基酸序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序進(jìn)行測定。作為3種以上的肽酶的活性降低或喪失的微生物，可以列舉只要該微生物能正常地生長，任意3種以上的肽酶的活性降低或喪失的微生物，優(yōu)選，可以列舉3種以上9種以下、更優(yōu)選3種以上6種以下、更為優(yōu)選3種或4種的肽酶的活性降低或喪失的微生物。作為具體的肽酶，可以列舉存在于上述大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母中的肽酶和二肽酶。而且，可以列舉與序列號20～23任一項(xiàng)的氨基酸序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成的、并且具有肽酶活性的蛋白質(zhì)作為二肽分解活性高的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序進(jìn)行測定。(3)在本發(fā)明的制備方法中使用的微生物的制備方法(a)具有生產(chǎn)下述蛋白質(zhì)的能力的微生物的制備方法，所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性WO2004/058960號中記載的具有桿菌溶素合成酶基因的枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、具體的是枯草芽孢桿菌ATCC23857、枯草芽孢桿菌ATCC15245、枯草芽孢桿菌ATCC6633、枯草芽孢桿菌IAM1213、枯草芽孢桿菌IAM1107、枯草芽孢桿菌IAM1214、枯草芽孢桿菌ATCC9466、枯草芽孢桿菌IAM1033、枯草芽孢桿菌ATCC21555、淀粉液化芽孢桿菌IFO3022由于具有生產(chǎn)下述蛋白質(zhì)的能力，所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力，因此所述微生物可以用于本發(fā)明的制備方法。而且，具有生產(chǎn)下述蛋白質(zhì)能力的微生物還可以通過用編碼該蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化宿主微生物來獲得，其中所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性。編碼下述蛋白質(zhì)的DNA的制備方法，所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的DNA可以通過WO2004/058960號記載的方法進(jìn)行制備，例如，使用可以基于序列號9～17表示的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的探針，使用基于與微生物、優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA文庫Southern雜交、或序列號9～17表示的堿基序列設(shè)計(jì)的引物DNA，以微生物、優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬的微生物的染色體DNA作為模板的PCR[PCRProtocols，AcademicPress(1990)]、以及，對于各種的基因序列數(shù)據(jù)庫，檢索與編碼序列號1～8任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的DNA的堿基序列具有75％以上、優(yōu)選85％以上、更優(yōu)選90％以上、更為優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上、最優(yōu)選99％以上的同源性的序列，基于由該檢索獲得的堿基序列，通過上述方法從具有該堿基序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫等中獲得編碼具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。將獲得的DNA照原樣，或用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶等切斷，通過常規(guī)方法整合到載體中，將獲得的重組DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞后、通過常用的堿基序列分析方法、例如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或使用373A.DNA測序儀(Perkin-Elmer公司制)等的堿基序列分析裝置進(jìn)行分析，可以測定該DNA的堿基序列。測定堿基序列的結(jié)果是，獲得的DNA為部分長度時(shí)，通過使用該部分長度DNA作為探針、針對染色體DNA文庫的Southern雜交法等，可以獲得全長DNA。進(jìn)而，還可以基于測定的DNA的堿基序列，通過使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成裝置等進(jìn)行化學(xué)合成來獲得目的DNA。作為如上述方式獲得的DNA，可以列舉，例如、具有序列號9～17表示的堿基序列的DNA。作為整合了上述的DNA的載體，可以列舉pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司制)、pDIRECT[NucleicAcidsRes.，18，6069(1990)]、pCR-ScriptAmpSK(+)(Stratagene公司制)、pT7Blue(Novagen公司制)、pCRII(Invitrogen公司制)和pCR-TRAP(Genhunter公司制)等。作為大腸桿菌，例如可舉大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌ATCC12435、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、大腸桿菌ME8415等。作為重組體DNA的導(dǎo)入方法，只要是向上述宿主細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法可以使用任一種方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)、電穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。被編碼具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物的制備方法以由上述[1]的方法獲得的DNA為基礎(chǔ)，根據(jù)需要，制備含有編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA的部分的適當(dāng)長度的DNA片段。而且，為了使編碼該蛋白質(zhì)的部分的堿基序列成為宿主的表達(dá)中最適的密碼子，通過取代堿基可以使該蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率提高。通過將該DNA片段插入到適當(dāng)表達(dá)載體的啟動子的下游，制作重組體DNA。通過將該重組體DNA導(dǎo)入到適合該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可以得到生產(chǎn)具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。作為宿主細(xì)胞，可以使用細(xì)菌和酵母等，只要是可以表達(dá)目的基因的微生物都可以使用。作為表達(dá)載體，可以使用可在上述宿主細(xì)胞自我復(fù)制或可整合到染色體中，在可轉(zhuǎn)錄編碼具有生成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA的位置含有啟動子的載體。使用細(xì)菌等原核生物作為宿主細(xì)胞時(shí)，具有編碼具有生成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA的重組體DNA優(yōu)選在原核生物中可自我復(fù)制的同時(shí)，由啟動子、核糖體結(jié)合序列、編碼具有生成二肽活性的蛋白質(zhì)的DNA，由轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組體DNA。也可以含有控制啟動子的基因。作為表達(dá)載體，例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(都是BoehringerMannheim公司制)、pHelixl(RocheDiagnostics公司制)、pKK233-2(AmershamPharmaciaBiotech公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIIKS(-)(Stratagene公司制)、pTrS30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制備]、pTrS32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制備]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(寶酒造公司制)、pUC118(寶酒造公司制)、pPA1(特開昭63-233798)等。作為啟動子，只要是在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中可發(fā)揮作用的，無論什么樣的啟動子都可以。例如可例舉trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子、PSE啟動子等來自大腸桿菌和噬菌體等的啟動子、SPO1啟動子、SPO2啟動子、penP啟動子等。也可以使用使兩個(gè)Ptrp串聯(lián)(直列)的啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、letI啟動子那樣人為設(shè)計(jì)改變的啟動子等。作為啟動子，也可以使用用于在芽孢桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的xylA啟動子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，35，594-599(1991)]和用于在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的P54-6啟動子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679(2000)]等。優(yōu)選使用將作為核糖體結(jié)合序列的S-D(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子的間距調(diào)節(jié)到適當(dāng)距離(例如6～18核酸)的質(zhì)粒。在使編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合于表達(dá)載體的重組體DNA中，不一定需要轉(zhuǎn)錄終止序列，但最好是緊接在結(jié)構(gòu)基因的下面配置終止序列。作為這樣的重組體DNA，可以列舉記載于WO2004/058960中的pPE43。作為宿主細(xì)胞使用的原核生物，如使用屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、或棒桿菌屬等的微生物、例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM101、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、枯草芽孢桿菌ATCC33712、巨大芽孢桿菌、球形芽孢桿菌FERMBP-6030、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14297等。作為導(dǎo)入重組體DNA的方法，只要是向上述宿主細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法，可以使用任一個(gè)方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)、電穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。使用屬于酵母屬的菌株作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作為啟動子，只要是在屬于酵母屬的菌株中發(fā)揮作用的，可以使用任一個(gè)，例如PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克多肽啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。作為宿主細(xì)胞，可以列舉如屬于酵母屬等的菌株，具體來說，可以列舉釀酒酵母等。作為重組體DNA的導(dǎo)入方法，只要是可向酵母導(dǎo)入DNA的方法都可以使用，例如電穿孔法[MethodsEnzymol.，194，182(1990)]、spheroplast法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889(1984)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的制備方法具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)可以通過以下方式制備：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以通過用可以用上述[1]的方法制備的編碼該蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中分離、純化該蛋白質(zhì)。作為宿主細(xì)胞，只要是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等、植物細(xì)胞等可以表達(dá)編碼該蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞，可以使用任意一種，優(yōu)選，可以列舉細(xì)菌、更優(yōu)選原核生物、更為優(yōu)選屬于埃希氏桿菌屬的原核生物。作為在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的方法、和從培養(yǎng)物中分離純化該蛋白質(zhì)的方法，可以列舉公知方法、例如WO2004/058960號中記載的方法。(b)具有下述能力的微生物的制備方法，所述能力為生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力和生產(chǎn)由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力本發(fā)明的制備方法中使用的具有下述能力的微生物，所述微生物具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力和具有生產(chǎn)由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力，在微生物原來具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力時(shí)，還可以通過用編碼具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的方法獲得該微生物，例如可以通過以下方法獲得：(i)通過公知的方法人為強(qiáng)化下述能力的微生物的生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的方法，所述微生物具有生產(chǎn)由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力、(ii)通過用編碼下述蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力被強(qiáng)化的微生物株的方法等，所述蛋白質(zhì)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性。具有生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力的微生物可以用與上述(a)的具有生產(chǎn)由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)能力的微生物的制備方法相同的方法制備。具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物、以及用公知的方法強(qiáng)化了生產(chǎn)該氨基酸的能力的微生物可以是用公知的方法被人為改變成生產(chǎn)、蓄積該氨基酸的微生物，作為該公知的方法，可以例舉有：緩和或解除至少一種控制選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的生物合成的機(jī)制中的方法、表達(dá)強(qiáng)化至少一種與該氨基酸的生物合成相關(guān)的酶的方法、使至少一種與該氨基酸的生物合成相關(guān)的酶基因的拷貝數(shù)增加的方法、從該氨基酸的生物合成途徑中弱化或阻斷至少一種分支到該氨基酸的其它的代謝產(chǎn)物的代謝途徑的方法、和選擇與野生型株相比，對該氨基酸的類似物抗性度高的細(xì)胞株的方法等，上述公知的方法可以單獨(dú)或組合使用。上述[1]的具體的方法記載于Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)、J.Bacteriol.，110，761-763(1972)和Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)等中。上述[2]的具體方法記載于Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)和J.Bacteriol.，110，761-763(1972)等中。上述[3]的具體的方法記載于Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)和Agric.Biol.Chem.，39，371-377(1987)等中。上述[4]的具體的方法記載于Appl.Environ.Micribiol.，38，181-190(1979)和Agric.Biol.Chem.，42，1773-1778(1978)等中。上述[5]的具體的方法記載于Agric.Biol.Chem.，36，1675-1684(1972)、Agric.Biol.Chem.，41，109-116(1977)、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)和Agric.Biol.Chem.，51，2089-2094(1987)等中?？梢詤⒖忌鲜鑫墨I(xiàn)等制備具有生產(chǎn)、積累各種氨基酸的能力的微生物。進(jìn)而，通過上述[1]～[5]任一項(xiàng)或它們的組合的方法制備具有生產(chǎn)、積累氨基酸的能力的微生物的制備方法，在Biotechnology2nded.，Vol.6，ProductsofPrimaryMetabolism(VCHVerlagsgesellschaftmbH，Weinheim，1996)section14a，14b和AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology79，1-35(2003)、氨基酸發(fā)酵、學(xué)會出版中心、相田浩等人(1986)中記載了許多實(shí)例，而且除上述以外，具體的制備具有生產(chǎn)、積累氨基酸能力的微生物的制備方法已有特開2003-164297、Agric.Biol.Chem.，39，153-160(1975)、Agric.Biol.Chem.，39，1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，4，272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092和特表2003-511086等多報(bào)道，通過參照上述文獻(xiàn)等可以制備具有生產(chǎn)、蓄積選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物。作為可以由上述方法制備的具有生產(chǎn)氨基酸能力的微生物，可以列舉，例如作為L-谷氨酰胺生產(chǎn)菌的缺失了glnE基因和/或glnB基因的微生物、作為L-丙氨酸生產(chǎn)菌的丙氨酸脫氫酶基因(ald基因)的表達(dá)被強(qiáng)化的微生物、作為L-脯氨酸生產(chǎn)微生物的表達(dá)苯丙氨酸的脫敏作用型pheA基因和/或酪氨酸的脫敏作用型aroF基因的微生物等。作為具有生產(chǎn)上述氨基酸能力的微生物，如果是可以應(yīng)用上述[1]～[5]的方法的微生物或具有上述遺傳特征的微生物，可以是任意一種，優(yōu)選可以列舉原核生物、更優(yōu)選細(xì)菌。作為原核生物，可以列舉屬于埃希氏菌(Escherichia)屬，沙雷氏菌屬(Serratia)，芽孢桿菌屬，短桿菌屬(Brevibacterium)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，微桿菌屬(Microbacterium)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)，魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)，アナシステイス(Anacystis)屬、節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬、固氮桿菌屬(Azotobacter)，著色菌屬(Chromatium)，歐文氏菌屬(Erwinia)，甲基桿菌屬(Methylobacterium)，席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium)，紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)，紅甲單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，紅螺菌屬(Rhodospirillum)，柵藻屬(Scenedesmus)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechoccus)和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的微生物。例如、可以列舉大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、未成熟短桿菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短桿菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、產(chǎn)乳酸短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)、無花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、假單胞菌·エルギノ一サ(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)、懸鉤子土壤桿菌(Agrobacteriumrubi)、柱孢魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenacylindrica)、桶形魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenadoliolum)、水華魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenaflos-aquae)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacteraurescens)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobactercitreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobformis)，Arthrobacterhydrocarbonglutamicus，邁索爾節(jié)桿菌(Arthrobactermysorens)，煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotianae)，石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus)，原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)，玫瑰色石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterroseoparaffinus)，硫磺節(jié)桿菌(Arthrobactersulfureus)，產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)，巴氏著色菌(Chromatiumbuderi)，微溫著色菌(Chromatiumtepidum)，酒色著色菌(Chromatiumvinosum)，沃氏著色菌(Chromatiumwarmingii)，Chromatiumfluviatile，噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)，胡蘿卜軟腐歐文氏菌(erwiniacarotovora)，菠蘿歐文氏菌(Erwiniaananas)，草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)，Erwiniapunctata，Erwiniaterreus，羅得西亞甲基桿菌(Methylobacteriumrhodesianum)，扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)，席藍(lán)細(xì)菌屬種(Phormidiumsp.)ATCC29409，莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)，類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)，生芽紅假單胞菌(Rhodopseudomonasblastica)，海紅菌(Rhodopseudomonasmarina)，血色紅假單孢菌(Rhodopseudomonaspalustris)，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)，需鹽紅螺菌(Rhodospirllumsalexigens)，鹽場紅螺菌(Rhodospirillumsalinarum)，產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)，金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)，金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)，殺真菌素鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus)，灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)，灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)，淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)，橄欖灰鏈霉菌(Streptomycesolivogriseus)，枝鏈霉菌(Streptomycesrameus)，田無鏈霉菌(Streptomycestanashiensis)，酒紅鏈霉菌(Streptomycesvinaceus)和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)等，作為優(yōu)選原核生物，可以列舉屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬或鏈霉菌屬等的細(xì)菌、例如，屬于上述埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬或鏈霉菌屬等的種，作為更優(yōu)選的細(xì)菌，可以列舉大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、產(chǎn)乳酸棒桿菌、黃色棒桿菌、棒桿菌·エフイカシス、枯草芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、惡臭假單胞菌、Pseudomonasaeruginosa、Streptomycesセリカラ一或淺青紫鏈霉菌，特別優(yōu)選大腸桿菌。作為具有生產(chǎn)L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力的微生物的具體例子，可以列舉作為L-谷氨酰胺生產(chǎn)株的后述大腸桿菌JGLE1和大腸桿菌JGLBE1等、作為L-丙氨酸生產(chǎn)株的攜帶ald基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌JM101株等、作為L-谷氨酰胺和L-丙氨酸生產(chǎn)株的攜帶ald基因表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌JGLE1和大腸桿菌JGLBE1等。作為具有生產(chǎn)、蓄積選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物的具體的例子，可以例舉有作為L-谷氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-5807和ATCC13032等、作為L-谷氨酰胺生產(chǎn)株的FERMP-4806和ATCC14751等、作為L-蘇氨酸生產(chǎn)株的ATCC21148、ATCC21277和ATCC21650等、作為L-賴氨酸生產(chǎn)株的FERMP-5084和ATCC13286等、作為L-蛋氨酸生產(chǎn)株的FERMP-5479、VKPMB-2175和ATCC21608等、作為L-異亮氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-3757和ATCC14310等、作為L-纈氨酸生產(chǎn)株的ATCC13005和ATCC19561等、作為L-亮氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-4704和ATCC21302等、作為L-丙氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-4121和ATCC15108等、作為L-絲氨酸生產(chǎn)株的ATCC21523和FERMBP-6576等、作為L-脯氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-2807和ATCC19224等、作為L-精氨酸生產(chǎn)株的FERMP-5616和ATCC21831等、作為L-鳥氨酸生產(chǎn)株的ATCC13232等、作為L-組胺酸生產(chǎn)株的FERMBP-6674和ATCC21607等、作為L-色氨酸生產(chǎn)株的DSM10118、DSM10121、DSM10123和FERMBP-1777等、作為L-苯丙氨酸生產(chǎn)株的ATCC13281和ATCC21669等、作為L-酪氨酸生產(chǎn)株的ATCC21652等、作為L-半胱氨酸生產(chǎn)株的W3110/pHC34(特表2003-511086記載)等、作為L-4-羥基脯氨酸生產(chǎn)株的WO96/27669記載的大腸桿菌SOLR/pRH71等、作為L-3-羥基脯氨酸生產(chǎn)株的FERMBP-5026和FERMBP-5409等、作為L-瓜氨酸生產(chǎn)株的FERMP-5643和FERMP-1645等。而且，上述FERM編號表示的菌株可以從獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本)獲得、ATCC編號表示的菌株可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(美國)獲得、VKPM編號表示的菌株可以從RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(俄羅斯)獲得、DSM編號表示的菌株可以從DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(德國)獲得。通過采用可以通過上述(a)的[1]的方法獲得的DNA，用上述(a)的[2]的方法轉(zhuǎn)化上述代表具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物株，可以制備本發(fā)明的制備方法中使用的微生物。(c)具有肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)的活性降低或喪失的微生物的制備方法作為在本發(fā)明的制備方法中使用的微生物，可以列舉在通過上述(a)或(b)的方法制備的微生物中，具有1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)(以下、簡稱為肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì))的活性降低或喪失的微生物、或3種以上的肽酶的活性降低或喪失微生物。該微生物可以通過以下方法獲得：如(i)通過上述(a)的方法給予1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的功能降低或喪失了的微生物、或3種以上的肽酶的功能降低或喪失了的微生物生產(chǎn)具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力的方法、(ii)使可以通過上述(a)的方法制備的具有生產(chǎn)生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力的微生物的、a)1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、或b)3種以上的肽酶、的功能降低或喪失的方法、(iii)通過上述(b)的方法給予1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的功能降低或喪失了的微生物、或由3種以上的肽酶的功能降低或喪失了的微生物生產(chǎn)具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力、和具有生成積累選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的方法、以及(iv)使可以通過上述(b)的方法制備的具有生產(chǎn)具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力、和具有生產(chǎn)、蓄積選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力的微生物的a)1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、或b)3種以上的肽酶的功能降低或喪失方法等。肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失了的微生物只要是可以獲得該微生物的方法，其獲得方法就沒有限制，但是，可以通過例如在以下所示的微生物的染色體DNA的肽酶基因和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因中導(dǎo)入堿基的缺失、取代或添加的方法來獲得。作為在微生物的染色體DNA的基因中導(dǎo)入堿基的缺失、取代或添加的方法，可以列舉利用同源重組的方法。作為一般的利用同源重組的方法，可以列舉采用可以通過將導(dǎo)入了堿基的缺失、取代或添加的變異基因與帶有在要導(dǎo)入堿基的缺失等的宿主細(xì)胞內(nèi)無法自我復(fù)制的抗藥性基因的質(zhì)粒DNA連接進(jìn)行制備的同源重組用質(zhì)粒的方法。將該同源重組用質(zhì)粒通過常用方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，以抗藥性作為指標(biāo)，選擇通過同源重組在染色體DNA上整合了該同源重組用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。將得到的轉(zhuǎn)化株在不含有該藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)～1天培養(yǎng)后，涂布于含有該藥物瓊脂培養(yǎng)基和不含有該藥物的瓊脂培養(yǎng)基上，通過選擇在前者培養(yǎng)基中不生長，而在后者培養(yǎng)基中可以生長的菌株，可以獲得在染色體DNA上出現(xiàn)第2次同源重組的菌株。通過對染色體DNA上導(dǎo)入了缺失等的基因存在的區(qū)域的堿基序列進(jìn)行測定，能夠確認(rèn)染色體DNA上的目的基因中導(dǎo)入堿基的缺失、取代或添加。作為通過上述方法，可以在染色體DNA上的目的基因中導(dǎo)入堿基缺失、取代或添加的微生物，可以列舉，例如屬于埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬的微生物。另外，作為利用對多個(gè)基因有效導(dǎo)入堿基缺失、取代或添加的同源重組的方法，可以列舉如使用直鏈DNA的方法。具體來說，是使含有要導(dǎo)入的堿基的缺失、取代或添加的基因的直鏈DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在染色體DNA與導(dǎo)入了的直鏈DNA之間發(fā)生同源重組的方法。本方法只要是可有效整合直鏈DNA的微生物，可運(yùn)用任一種微生物，作為優(yōu)選的微生物，可以列舉，例如用埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬的微生物、更優(yōu)選大腸桿菌、特別優(yōu)選表達(dá)來自λ噬菌體的重組蛋白質(zhì)組(Red重組系統(tǒng))的大腸桿菌。作為表達(dá)λRed重組系統(tǒng)的大腸桿菌，如帶有作為含有λRed重組系統(tǒng)基因的質(zhì)粒DNA的pKD46[從大腸桿菌基因貯存中心(美國耶魯大學(xué))可獲得]的大腸桿菌JM101株等。作為在同源重組中使用的DNA，可以列舉：在抗藥性基因的兩端具有存在于作為堿基缺失、取代或添加導(dǎo)入對象的染色體DNA上區(qū)域的兩外側(cè)的DNA或具有與該DNA有同源性的DNA的直鏈DNA、直接連接了存在于作為堿基缺失、取代或添加導(dǎo)入對象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、在抗藥性基因和陰性篩選中能夠使用的基因的兩端具有存在于作為堿基缺失、取代或添加導(dǎo)入對象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA具有同源性的DNA的直鏈DNA、在上述[1]的直鏈DNA，在存在于抗藥性基因和染色體DNA上的區(qū)域的兩外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA之間，以及具有來自酵母的Flp重組酶[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，5875(1985)]識別的堿基序列的DNA。作為抗藥性基因，只要是對于宿主微生物表現(xiàn)出敏感性的藥物賦予抗藥性的抗藥性基因，可以使用任一種抗藥性基因。宿主微生物使用大腸桿菌時(shí)，作為抗藥性基因，可以列舉，例如卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因等。所謂陰性篩選中可使用的基因指的是使該基因在宿主微生物表達(dá)時(shí)，在一定培養(yǎng)條件下，導(dǎo)致該微生物致死的基因，作為該基因，可以列舉，例如來自屬于芽孢桿菌屬的微生物的sacB基因[Appl.Environ.Microbiol.，59，1361-1366(1993)]和來自屬于埃希氏菌屬的微生物的rpsL基因[Genomics，72，99-104(2001)]等。存在于上述直鏈DNA的兩末端的位于成為染色體DNA上取代或缺失導(dǎo)入對象的區(qū)域兩端外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA在直鏈DNA中在與染色體DNA上方向相同方向上配置，其長度優(yōu)選10bp～100bp左右，更優(yōu)選20bp～50bp左右，再優(yōu)選30～40bp左右。所謂來自酵母的Flp重組酶識別的堿基序列只要是該蛋白質(zhì)識別、催化同源重組的堿基序列，沒有特別限定，優(yōu)選具有序列編號38表示的堿基序列的DNA和具有在該DNA中缺失、取代或添加了1個(gè)～數(shù)個(gè)堿基的堿基序列，而且具有來自酵母的Flp重組酶識別的、催化同源重組的堿基序列的DNA。所謂具有同源性的DNA，上述直鏈DNA是在染色體DNA上的目的區(qū)域中，同源重組發(fā)生程度具有同一性的DNA，作為具體的同源性，可以列舉，例如具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、、更為優(yōu)選98％以上、特別優(yōu)選99％以上、最優(yōu)選100％同源性的DNA。上述堿基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序測定。上述直鏈DNA片段可以通過PCR制作。另外，還可以在將含有上述直鏈DNA的DNA在質(zhì)粒上構(gòu)建后，通過限制性內(nèi)切酶處理獲得目的直鏈DNA。作為向微生物的染色體DNA導(dǎo)入堿基缺失、取代或添加的方法，可以列舉例如以下的方法1～4：方法1：將上述[1]或[2]的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，通過以抗藥性為指標(biāo)選擇該直鏈DNA通過同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株的方法。方法2：向通過上述方法1得到的轉(zhuǎn)化株導(dǎo)入直接連接了存在于作為堿基的缺失、取代或添加的導(dǎo)入對象的染色體DNA上區(qū)域兩外側(cè)的DNA或與該DNA有同源性的DNA的DNA，通過消除利用該方法插入到染色體DNA上的藥物基因，使微生物的染色體DNA上的區(qū)域取代或缺失的方法。方法3：a)將上述[3]的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，以抗藥性為指標(biāo)選擇該直鏈DNA通過同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株，b)合成在與染色體DNA上的方向同一方向上連接了與位于染色體DNA上的取代或缺失對象區(qū)域兩端外側(cè)的DNA有同源性的DNA的DNA，導(dǎo)入到上述a)得到的轉(zhuǎn)化株，c)在陰性篩選中可以使用的基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)進(jìn)行了上述b)操作的轉(zhuǎn)化株，作為在抗藥性基因和陰性篩選中能夠使用的基因從染色體DNA上被刪除的菌株，選擇在該培養(yǎng)中可生長的菌株的方法。方法4：a)將上述[4]的直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物，以抗藥性為指標(biāo)，選擇該直鏈DNA通過同源重組插入到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株，b)將Flp重組酶基因表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到上述a)得到的轉(zhuǎn)化株中，使該基因表達(dá)后，獲得對上述a)使用的藥物具有敏感性的菌株的方法。作為在上述方法中使用的將直鏈DNA導(dǎo)入宿主微生物的方法，只要是向該微生物導(dǎo)入DNA的方法，可以使用任一個(gè)方法，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)、電穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等?？稍诜椒?或方法3b)使用的DNA中，通過使用在該DNA的中央部附近整合要插入到染色體DNA上的任意基因的DNA，在消除抗藥性基因等的同時(shí)，可以將任意基因插入到染色體DNA上。上述方法2～4中，由于是在最終得到的轉(zhuǎn)化株的染色體DNA上不留下在抗藥性基因和陰性篩選中可以使用的基因等外源基因的方法，所以通過使用該方法，使用在同一的抗藥性基因和陰性篩選中使用的基因，通過反復(fù)進(jìn)行上述操作、能夠制造在染色體DNA上位置不同的2個(gè)以上區(qū)域具有堿基缺失、取代或添加的微生物。(4)本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的制備方法(a)可以通過以下方法制備本發(fā)明的二肽的結(jié)晶：使用具有由選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)、具有生產(chǎn)該蛋白質(zhì)能力的微生物的培養(yǎng)物、或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使該酶源以及選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1種以上的氨基酸共存于水性介質(zhì)中，使之在該水性介質(zhì)中生成積累二肽，從該水性介質(zhì)中收集二肽的結(jié)晶。該微生物的培養(yǎng)物可以通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物獲得，培養(yǎng)方法可以按照在微生物的培養(yǎng)中常規(guī)的方法進(jìn)行。也就是說，如果是含有該微生物可以同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等，能夠有效進(jìn)行該微生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任意一種。作為碳源，可以是該微生物可以同化的碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些物質(zhì)的糖蜜、淀粉或淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、正丙醇等醇類等。作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、豆餅和豆餅水解產(chǎn)物、各種發(fā)酵菌體、和其消化物等。作為無機(jī)鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。通常在振蕩培養(yǎng)或在深度通氣攪拌培養(yǎng)等需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為15～40℃，培養(yǎng)時(shí)間通常是5小時(shí)至7天。在培養(yǎng)過程中，將pH維持在3.0～9.0。使用有機(jī)酸或無機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。而且，培養(yǎng)中可以根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素和四環(huán)素等抗生素。當(dāng)培養(yǎng)經(jīng)采用誘導(dǎo)性啟動子作為啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，根據(jù)需要，還可以向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，在培養(yǎng)經(jīng)采用lac啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可以向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等；在培養(yǎng)經(jīng)采用trp啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可以向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸等。在上述制備方法中，使用具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)作為酶源時(shí)，作為底物使用的每1mg氨基酸添加0.01～100mg該酶源、優(yōu)選0.1mg～10mg，根據(jù)需要可以在反應(yīng)液中添加0.5mmol～10mol/L濃度的ATP。在上述制備方法中，在水性介質(zhì)中在一開始或反應(yīng)途中添加終濃度為0.1～500g/L、優(yōu)選0.2～200g/L的作為底物使用的氨基酸。作為可以在上述制備方法中使用的水性介質(zhì)，只要不抑制二肽的生成反應(yīng)，任意成分、組成的水性介質(zhì)都可以，例如、可以列舉水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液等。而且，還可以含有甲醇、乙醇等醇類、醋酸乙酯等酯類、丙酮等甲酮類、乙酰胺基等酰胺基類。而且，使用微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源時(shí)，除上述水性介質(zhì)外，還可以使用作為酶源使用的微生物的培養(yǎng)液作為水性介質(zhì)，作為ATP的供給源，可以在水性介質(zhì)中添加通過微生物代謝可以生產(chǎn)ATP化合物、例如葡萄糖等糖類、乙醇等醇類、醋酸等有機(jī)酸類等。進(jìn)而，根據(jù)需要，還可以在水性介質(zhì)中添加表面活性劑或有機(jī)溶劑。作為表面活性劑，如果是聚氧乙烯十八烷基胺(例如NymeenS-215，日本油脂公司制)等非離子表面活性劑，例如溴化十六烷基三甲銨和烷基二甲基芐基氯化銨(例如cationF2-40E，日本油脂公司制)等陽離子表面活性劑，例如月桂酰肌氨酸鹽等陰離子表面活性劑，和例如烷基二甲胺(例如叔胺FB，日本油脂公司制)等叔胺等促進(jìn)二肽的生成的物質(zhì)可以是任意一種，它們可以單獨(dú)使用或者也可以組合使用。表面活性劑通常以0.1至50g/l的濃度使用。作為有機(jī)溶劑，可例舉有二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、醋酸乙酯等，通常以0.1至50m/l的濃度使用。使用培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源時(shí)，該酶源的量根據(jù)當(dāng)該酶源的比活性等而不同，例如、每1mg作為底物使用的氨基酸添加5～1000mg、優(yōu)選10～400mg的濕菌體重量。作為在本發(fā)明的制備方法中使用的微生物的培養(yǎng)物的處理物，可以列舉通過培養(yǎng)上述(2)的微生物的培養(yǎng)物的濃縮物、該培養(yǎng)物的干燥物、通過對該培養(yǎng)物離心分離、或過濾等獲得的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械的磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、和含有作為該菌體的固定化物等的酶源的與該微生物具有相同功能的活菌體的培養(yǎng)物的處理物。二肽的生成反應(yīng)在水性介質(zhì)中、以pH5～11、優(yōu)選pH6～10、20～65℃、優(yōu)選25～55℃、更優(yōu)選30～45℃的條件通常進(jìn)行1分鐘～150小時(shí)、優(yōu)選3分鐘～120小時(shí)、更優(yōu)選30分鐘～100小時(shí)。作為收集在水性介質(zhì)中生成、積累的本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的方法，只要是可以獲得構(gòu)成成分中基本上不含含有D-氨基酸的二肽和3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶、或可以獲得基本上不含氨基酸酰胺的二肽的結(jié)晶，沒有特別的限制，例如，可以列舉使用蛋白質(zhì)作為酶源時(shí)，照原樣使用、使用培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源時(shí)，通過離心分離或過濾除去菌體后、通過用于分離夾雜的氨基酸和多肽的合成吸附劑、陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂等離子交換樹脂、活性碳對含有本發(fā)明的二肽的溶液進(jìn)行處理、結(jié)晶處理，并且根據(jù)需要單獨(dú)或組合進(jìn)行用于除去特定的夾雜物的處理后、結(jié)晶目的二肽的方法。沒有特別的限定，例如，可以列舉非極性的多孔的吸附樹脂，具體可以列舉HP10、HP20等DiaionHP系列(三菱化學(xué)公司制)、SP800、SP825等DiaionSP800系列(三菱化學(xué)公司制)、SP205、SP207、SP207S等DiaionSP200系列(三菱化學(xué)公司制)、和XAD4、XAD1600等離子交換樹脂XAD系列(RohmandHaas公司制)等。作為陽離子交換樹脂，只要是可以分離目的二肽和夾雜物的，沒有特別的限制，作為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，可以列舉124Na、252Na等離子交換樹脂IR系列(Organo公司制)、MarathonC、XUS-40232.01等Dowex(Dow化學(xué)公司制)等、作為弱酸性陽離子交換樹脂，可以列舉IRC50、IRC70等離子交換樹脂IRC系列(Rohm&Haas公司制)、WK40等WK系列(三菱化學(xué)公司制)等。作為陰離子交換樹脂，只要是可以分離目的二肽和夾雜物的，沒有特別的限制，作為強(qiáng)堿基性陰離子交換樹脂，可以列舉PA306、PA312、PA412等DiaionPA系列(三菱化學(xué)公司制)等、作為弱堿基性陰離子交換樹脂，可以列舉WA10、WA20、WA30等DiaionWA系列(三菱化學(xué)公司制)等。作為收集L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶的方法，可以列舉，例如，使用通過以下方法獲得的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺結(jié)晶的方法：反應(yīng)終止后、反應(yīng)液中含有菌體時(shí)，通過離心分離或過濾等除去菌體后，用含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、例如MarathonC中，獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的洗脫級分后，將該洗脫級分通過弱酸性陽離子、例如IRC50上，獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的洗脫級分，然后將該洗脫級分裝到強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(例如PA412)上。作為用于除去特定的夾雜物的處理，可以列舉例如，水性介質(zhì)中殘留作為底物使用的選自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的氨基酸時(shí)，用于除去這種殘留的氨基酸的處理。作為該處理，如果是例如殘留L-谷氨酰胺時(shí)，可以除去L-谷氨酰胺的處理，可以是任意一種處理，但是優(yōu)選樹脂處理、加熱處理、酸或堿基處理等可以分解除去L-谷氨酰L-谷氨酰胺的處理、更優(yōu)選加熱處理。作為具體的熱處理方法，可以列舉使用L-丙氨酸和L-谷氨酰胺作為底物，使之在水性介質(zhì)中生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、在55℃～120℃處理該水性介質(zhì)5分鐘～24小時(shí)、優(yōu)選于70℃～100℃處理15分鐘～6小時(shí)的方法。作為使二肽結(jié)晶的方法，只要是可以結(jié)晶目的二肽的方法，沒有特別的限定，但可以列舉在含有二肽的水溶液中添加甲醇、乙醇和正丙醇等低級醇、丙酮等甲酮類、和四氫呋喃等溶劑的方法。結(jié)晶條件，只要是可以使結(jié)結(jié)晶出的條件就沒有特別的限定，但可以列舉在20～70℃下、添加含有二肽的水溶液的2～5倍體積的結(jié)晶用溶劑，如果需要再將溶液冷卻至10～30℃的條件。例如、作為結(jié)晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，可以列舉在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中，于20～70℃、優(yōu)選50～70℃的溫度下添加該水溶液的約2～5倍體積、優(yōu)選3～4倍體積的甲醇后、冷卻至10～30℃、優(yōu)選15～25℃的方法。而且結(jié)晶時(shí)，可以在含有作為晶種的二肽的溶液中加入目的二肽的結(jié)晶，例如在結(jié)晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺時(shí)，在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中添加該水溶液的0.3～0.5倍體積的甲醇后、添加該水溶液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的1～5重量％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶，然后再添加甲醇至總體積為原水溶液的4倍體積的方法。(b)通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有下述能力的微生物，所述微生物具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸能力、和生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力，使微生物在該培養(yǎng)基中生成積累二肽后、從該培養(yǎng)基中收集二肽的結(jié)晶，可以獲得本發(fā)明的二肽的結(jié)晶。作為培養(yǎng)該微生物的方法，可以列舉上述(a)的方法。但是，在該微生物的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基中，不必含有構(gòu)成目的二肽的氨基酸，但存在著天然培養(yǎng)基、或用于培養(yǎng)氨基酸要求性株的培養(yǎng)基中含有該氨基酸的情況。在本發(fā)明的制備方法中使用的培養(yǎng)基中可以含有本發(fā)明中可使用的微生物、其成長所需要的量的氨基酸。也就是說，常規(guī)的培養(yǎng)基中所含的氨基酸的量，由于與可以使用的微生物所生成積累的該氨基酸的量相比，非常少，因此常規(guī)培養(yǎng)基中所含的該氨基酸的量，由于本發(fā)明制備的二肽的生產(chǎn)量基本上不受該氨基酸的有無而改變，故在本發(fā)明的制備方法中使用的培養(yǎng)基中可以含有這種程度的該氨基酸。作為可以在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基中所含的氨基酸量，例如，如果是天然培養(yǎng)基，通?？梢院胁坏?.5g/L、優(yōu)選0.5g/L以下、更優(yōu)選0.1g/L以下、更為優(yōu)選20mg/L以下的該氨基酸、如果是合成培養(yǎng)基，通常可含有1g/l以下、優(yōu)選50mg/L以下、更優(yōu)選1mg/L以下、更為優(yōu)選0.5mg/L以下的該氨基酸。但是，在用本發(fā)明的制備方法制備2種不同的氨基酸構(gòu)成的二肽時(shí)，所使用的微生物只有生產(chǎn)構(gòu)成該二肽的氨基酸中的1種氨基酸的能力時(shí)，本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基中可以添加該微生物無法生成、積累的殘留的1種氨基酸。此時(shí)添加的氨基酸的量通常為0.5g/L～100g/L、優(yōu)選2g/L～50g/L。作為收集培養(yǎng)基中生成、積累的本發(fā)明的二肽的結(jié)晶的方法，可以列舉上述(a)的方法。具體可以列舉，通過離心分離或過濾培養(yǎng)物等從培養(yǎng)基除去菌體后，用與上述(a)相同的方法結(jié)晶二肽的方法。而且，培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力，和由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的能力的微生物，使之在培養(yǎng)基中生成積累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺時(shí)，作為除去作為殘留在培養(yǎng)基中的夾雜物的L-谷氨酰胺的方法，可以列舉與上述(a)的水性介質(zhì)同樣處理該培養(yǎng)基的方法、優(yōu)選加熱處理的方法。作為具體的加熱處理方法，可以列舉使培養(yǎng)基中生成積累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、于55℃～120℃處理該培養(yǎng)基5分鐘～24小時(shí)、優(yōu)選于70℃～100℃處理15分鐘～6小時(shí)處理的方法。作為結(jié)晶二肽的方法，可以列舉與上述(a)相同的方法。具體而言，作為結(jié)晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，可以列舉在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中，于20～70℃、優(yōu)選50～70℃的溫度下添加該水溶液的約2～5倍體積、優(yōu)選3～4倍容量的甲醇后、冷卻至10～30℃、優(yōu)選15～25℃的方法。而且，結(jié)晶時(shí)，可以在含有作為晶種的二肽溶液中添加目的二肽的結(jié)晶，例如上述方法中結(jié)晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺時(shí)，在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中添加該水溶液的0.3～0.5培養(yǎng)量的甲醇后，添加該水溶液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的1～5重量％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶，然后添加甲醇至總體積為原水溶液的4倍體積的方法。以下，以參考例表示對市售的丙氨酰谷氨酰胺的結(jié)晶中所含的物質(zhì)進(jìn)行分析的結(jié)果。參考例市售的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺結(jié)晶的分析下表1表示了在以下條件下對各市售藥進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果，上行表示用HPLC分析時(shí)的區(qū)域％、下行表示根據(jù)該區(qū)域％計(jì)算出的重量％。分析條件柱：InertsilODS-3V(GLscience公司制)溫度：30℃移動相：溶液A[0.01mol/l庚烷磺酸鈉、0.01mol/l磷酸二氫鉀(pH2.5)]∶甲醇＝99∶1流量：1.2ml/min檢測：UV210nm表1：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺試劑所含物質(zhì)的分析結(jié)果表中，ND表示檢測界限(區(qū)域％：0.002％)以下，DL體表示D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。任意-種試劑基本含有選自DL體、丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺和丙氨酰胺的1以上的物質(zhì)。以下公開了下述微生物的制備方法的實(shí)驗(yàn)例，但是該微生物的制備方法并不限于該實(shí)驗(yàn)例，所述微生物具有生產(chǎn)選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸的能力以及生產(chǎn)具有由選自L-氨基酸和甘氨酸的1種以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力，并且1種以上的肽酶和1種以上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性降低或喪失、或3種以上的肽酶的活性降低或喪失。實(shí)驗(yàn)例1pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操縱子缺陷株的制備按照利用λ噬菌體的同源重組系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，66441-6645(2000)]制備了大腸桿菌染色體DNA上的特定基因發(fā)生缺失的菌株。以下中記載的質(zhì)粒pKD46、pKD3和pCP20由大腸桿菌GeneticStockCenter(美國耶魯大學(xué))獲得攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌株，使用從該大腸桿菌提取的質(zhì)粒。(1)基因缺失用DNA片段的克隆以使存在于大腸桿菌K12株的染色體DNA上的具有序列號29表示的堿基序列的pepD基因、具有序列號30表示的堿基序列的pepN基因、具有序列號31表示的堿基序列的pepB基因、具有序列號32表示的堿基序列的pepA基因和具有序列號33表示的堿基序列的dppA基因、具有序列號34表示的堿基序列的dppB基因、具有序列號35表示的堿基序列的dppC基因、具有序列號36表示的堿基序列的dppD基因和具有序列號37表示的堿基序列的dppF基因缺失為目的，用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成機(jī)，合成與大腸桿菌K12株的染色體DNA上的位于各個(gè)缺失目的基因的上游和下游的36bp構(gòu)成的堿基序列相同的堿基序列、和具有序列號38表示的酵母來源Flp重組酶識別的堿基序列的DNA。但是，由于dppA基因、dppB基因、dppC基因、dppD基因和dppF基因形成操縱子，因此合成具有與位于該操縱子的上游和下游的堿基序列相同的堿基序列的DNA。也就是說，分別合成作為pepD基因缺失用DNA片段擴(kuò)增用引物組的序列號39和40、作為pepN基因缺失用DNA片段擴(kuò)增用引物組的序列號41和42、作為pepA基因缺失用DNA片段擴(kuò)增用引物組的序列號43和44、作為pepB基因缺失用DNA片段擴(kuò)增用引物組的序列號45和46、作為dpp操縱子缺失用DNA片段擴(kuò)增用引物組的序列號47和48表示的堿基序列構(gòu)成的DNA。接著，使用上述合成的DNA作為引物組，以pKD3DNA作為模板進(jìn)行PCR。使用含有10ng的質(zhì)粒DNA、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶(Stratagene公司制)、4μl的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液(Stratagene公司制)、200μmol/l的各deoxyNTP(dATP、dGTP、dCTP和TTP)的40μl反應(yīng)液，重復(fù)30次于94℃1分鐘、于55℃2分鐘、于72℃3分鐘的步驟進(jìn)行PCR。對各個(gè)反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后，添加與殘留的反應(yīng)液等量的TE〔10mmol/lTris-HC1(pH8.0)、1mmol/lEDTA〕飽和苯酚/氯仿(1vol/1vol)，進(jìn)行混合。離心分離該混合液后，在獲得的上層加入2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃放置30分鐘。離心分離該溶液，獲得含有pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操縱子缺失用氯霉素抗性基因DNA片段。(2)pepD基因缺失大腸桿菌JM101的制備用pKD46轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101株，通過涂布于含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)進(jìn)行選擇。將λRed重組酶基因插入于質(zhì)粒pKD46上，并且設(shè)計(jì)成其表達(dá)由L-阿拉伯糖所誘導(dǎo)。因此，如果使用支鏈DNA轉(zhuǎn)化在L-阿拉伯糖存在下生長的大腸桿菌，就會以高頻率發(fā)生同源重組。而且，由于pKD46具有溫度敏感性的復(fù)制起點(diǎn)，通過使之在42℃下生長，可以使質(zhì)粒容易脫落。用電脈沖法在通過添加10mmol/lL-阿拉伯糖和50μg/ml氨芐青霉素進(jìn)行培養(yǎng)獲得的大腸桿菌JM101/pKD46中導(dǎo)入由上述方式獲得的pepD基因缺失用氯霉素抗性基因含有DNA片段，pepD基因缺失用氯霉素抗性基因含有DNA片段通過同源重組整合到大腸桿菌JM101的染色體DNA上，通過將轉(zhuǎn)化株涂布于含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨、5g/l細(xì)菌用酵母提取物、5g/l氯化鈉、15g/l瓊脂)中，于30℃培養(yǎng)進(jìn)行選擇。將選擇出的氯霉素抗性株接種于含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，于42℃培養(yǎng)14小時(shí)后，分離單菌落。獲得的各菌落在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基和含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)制，于37℃培養(yǎng)，通過選擇顯示出氯霉素抗性和氨芐青霉素敏感性的菌落，獲得pKD46脫落株。然后，用pCP20轉(zhuǎn)化上述獲得的pKD46脫落株，通過在含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，獲得了帶有pCP20的pKD46脫落株。將酵母來源的Flp重組酶基因插入質(zhì)粒pCP20，設(shè)計(jì)成基因的表達(dá)在42℃被誘導(dǎo)。而且，由于含有上述制備的PepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操縱子缺失用氯霉素抗性基因DNA片段的、Flp重組酶識別的堿基序列存在于氯霉素抗性基因的兩端，因此通過Flp重組酶催化的同源重組可以使該抗性基因容易地脫落。而且，由于pCP20具有溫度敏感性的復(fù)制起點(diǎn)，通過使pCP20保持株在42℃生長，可以同時(shí)誘導(dǎo)Flp重組酶的表達(dá)和pCP20的脫落。將上述獲得的帶有pCP20的pKD46脫落株接種于不添加藥劑的LB瓊脂培養(yǎng)基，于42℃培養(yǎng)14小時(shí)后、分離單菌落。獲得的各菌落在不添加藥劑的LB瓊脂培養(yǎng)基、含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基和含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)制，于30℃培養(yǎng)，選擇顯示出氯霉素敏感性和氨芐青霉素敏感性的菌落。按照常規(guī)方法從上述選擇出的各株中分別制備染色體DNA(生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)害、日本生物工學(xué)會編97～98頁、培風(fēng)館、1992年)。使用基于缺失的目的基因pepD基因的內(nèi)部堿基序列設(shè)計(jì)的具有序列號49和50表示的堿基序列的DNA作為引物組，以染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。使用含有0.1μg染色體DNA、0.5μmol/l各引物、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μlPfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l各deoxyNTP的40μl反應(yīng)液，通過重復(fù)30次的94℃下1分鐘、55℃下2分鐘、72℃下3分鐘構(gòu)成的步驟進(jìn)行PCR。在上述PCR中，沒有檢測出擴(kuò)增DNA片段的菌株為pepD基因缺失株，命名為大腸桿菌JPD1株。(3)大腸桿菌JM101的染色體DNA上的pepD基因和pepN基因ガ發(fā)生缺失的菌株的制備用pKD46轉(zhuǎn)化上述(2)獲得的大腸桿菌JPD1株，通過涂布于含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)進(jìn)行選擇。通過電脈沖法將含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段導(dǎo)入獲得的轉(zhuǎn)化株(大腸桿菌JPD1/pKD46)，獲得了含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段通過同源重組被整合到大腸桿菌JPD1/pKD46的染色體DNA上的轉(zhuǎn)化株。接著，通過進(jìn)行與上述(2)相同的操作，獲得氯霉素抗性基因從染色體DNA上缺失的菌株，將該菌株命名為大腸桿菌JPDN2。(4)大腸桿菌JM101的染色體DNA上的pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操縱子發(fā)生缺失的菌株、和多重基因缺失株的制備使用上述(1)制備的含有各基因或操縱子缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段，通過與上述(2)相同的方法制備pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操縱子的缺失株。使用具有基于各個(gè)缺失基因的內(nèi)部堿基序列設(shè)計(jì)合成的序列號51～58表示的堿基序列的DNA作為引物組，通過與上述(2)相同的PCR確認(rèn)由上述方法獲得的各個(gè)基因缺失株。其中，序列號51和52表示的堿基序列構(gòu)成的DNA為pepN基因缺失確認(rèn)用引物組、序列號53和54表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是pepA基因缺失確認(rèn)用引物組、序列號55和56表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是pepB基因缺失確認(rèn)用引物組、序列號57和58表示的堿基序列構(gòu)成的DNA是dpp操縱子缺失確認(rèn)用引物組。將上述方法獲得的dpp操縱子缺失株命名為大腸桿菌JDPP1株、將pepN基因缺失株命名為大腸桿菌JPN1株、將pepA基因缺失株命名為大腸桿菌JPA1株、將pepB基因缺失株命名為大腸桿菌JPB7株。而且，按照上述(3)的方法，制備選自pepD基因、pepN基因、pepA基因、pepB基因和dpp操縱子構(gòu)成的組的2以上的基因或操縱子的多重缺失株。可以獲得多重缺失株的確認(rèn)通過與上述(2)相同的PCR進(jìn)行確認(rèn)。將由前述方法獲得的pepD基因和dpp操縱子發(fā)生缺失的二重基因缺失株命名為大腸桿菌JPDP49株，將pepB基因、pepD基因和pepN基因發(fā)生缺失的三重基因缺失株命名為大腸桿菌JPDNB43株，將pepD基因、pepN基因和dpp操縱子發(fā)生缺失的三重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDDP36株，將pepA基因、pepD基因、pepN基因和dpp操縱子發(fā)生缺失的四重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDAP5株，將pepB基因、pepD基因、pepN基因和dpp操縱子發(fā)生缺失的四重基因缺失株命名為大腸桿菌JPNDBP7株。表2表示各基因缺失株中的缺失基因名。表2基因缺陷株和缺失基因?qū)嶒?yàn)例2具有生成并積累氨基酸的能力、并且二肽酶和二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生缺失的微生物的制備按照利用λ噬菌體的同源重組系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97，6641-6645(2000)]進(jìn)行大腸桿菌的染色體DNA上的特定基因的缺失。(1)基因缺失用抗藥性基因片段的克隆與大腸桿菌K12株的L-谷氨酰胺的生物合成調(diào)節(jié)相關(guān)的glnE基因和glnB基因的堿基序列已經(jīng)是否清楚[Science，5331，1453-1474(1997)]?；谝呀?jīng)報(bào)道的堿基序列，使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成機(jī)，合成序列號59和60表示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為glnE基因缺失用的引物DNA，合成序列號61和62表示的堿基序列構(gòu)成的DNA作為glnB基因缺失用的引物DNA?；谖挥诟鱾€(gè)缺失的目的基因的上游和下游的36bp構(gòu)成的堿基序列設(shè)計(jì)合成的引物DNA。使用上述合成的DNA作為各個(gè)引物組，以pKD3DNA作為模板進(jìn)行PCR。使用含有10ng質(zhì)粒DNA、引物各0.5mol/L、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μLPfuDNA聚合酶用10緩沖液、deoxyNTP各200μmol/L的40μL反應(yīng)液，通過重復(fù)30次的94℃下1分鐘、55℃下2分鐘、72℃下3分鐘構(gòu)成的步驟進(jìn)行PCR。對反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后、添加與殘留的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿，進(jìn)行混合。離心分離該混合液后，在獲得的上層加入2倍體積的冷乙醇并混合，于-80℃放置30分鐘。通過離心分離該溶液DNA使之沉淀后，將該DNA溶解于20μL的TE中。通過上述操作，獲得glnE基因、glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段。(2)染色體DNA上的glnE基因發(fā)生缺失的大腸桿菌JPNDDP36株的制備用pKD46轉(zhuǎn)化上述(1)獲得的大腸桿菌JPNDDP36株后、選擇在含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上帶有pKD46的大腸桿菌JPNDDP36株(以下、稱為大腸桿菌JPNDDP36/pKD46)。通過電脈沖法用glnE基因缺失用氯霉素抗性基因片段轉(zhuǎn)化在10mmol/LL-阿拉伯糖和50μg/ml氨芐青霉素存在下培養(yǎng)的大腸桿菌JPNDDP36/pKD46，在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇氯霉素抗性基因插入于JPNDDP36株的染色體DNA上的glnE基因中，glnE結(jié)構(gòu)基因缺失的重組株。獲得的氯霉素抗性株在含有25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)制，在42℃保溫的狀態(tài)下實(shí)施單菌落分離。獲得的各菌落在含有25mg/L的氯霉素和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)制，選擇顯示出氯霉素抗性和氨芐青霉素敏感性的菌落。接著，用pCP20轉(zhuǎn)化該pKD46脫落株，涂布于含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)一夜。慢慢生長的氨芐青霉素抗性株在不添加藥劑的LB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)制，在42℃保溫的狀態(tài)下實(shí)施單菌落分離。獲得的各菌落在不添加藥劑的、和含有25mg/L氯霉素和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上分別復(fù)制，選擇顯示出氯霉素敏感性和氨芐青霉素敏感性的菌落。其中，按照常規(guī)方法(生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書、日本生物工學(xué)會編97～98頁、培風(fēng)館、1992年)由獲得的各菌株制備各個(gè)染色體DNA。使用以作為缺失的目的的glnE基因的內(nèi)部序列作為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的序列號63和64表示的堿基序列構(gòu)成的引物DNA，進(jìn)行菌落PCR。使用含有通過使200μl移液管接觸菌落獲得的量的菌體、0.5μmol/l各引物、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μlPfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l各deoxyNTP的40μl反應(yīng)液，通過重復(fù)30次的94℃下1分鐘、55℃下2分鐘、72℃下3分鐘構(gòu)成的步驟進(jìn)行菌落PCR。提供給PCR的菌株中沒有發(fā)現(xiàn)基因擴(kuò)增的菌株，確認(rèn)其為glnE基因缺失株，命名為大腸桿菌JPNDDPGLE1。(3)染色體DNA上的glnE基因和glnB基因發(fā)生缺失的大腸桿菌JPNDDP36株的制備用pKD46轉(zhuǎn)化上述(2)獲得的大腸桿菌JPNDDPGLE1株后，涂布于含有100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，通過于30℃培養(yǎng)一夜，獲得帶有pKD46的大腸桿菌JPNDDPGLE1株(以下、稱為大腸桿菌JPNDDPGLE1/pKD46)。用glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段通過電脈沖法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JPNDDPGLE1/pKD46，獲得了氯霉素抗性基因插入于染色體DNA上的glnB基因的glnB結(jié)構(gòu)基因缺失了的重組株。使用基于glnB基因的內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的序列號65和66表示的堿基序列構(gòu)成的引物DNA，進(jìn)行上述(2)的條件下的菌落PCR。通過該P(yáng)CR確認(rèn)沒有發(fā)現(xiàn)基因擴(kuò)增的菌株是glnB基因缺失株，命名為大腸桿菌JPNDDPGBE1。實(shí)驗(yàn)例4表達(dá)具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA的制備用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成機(jī)，合成具有序列號67～70中記載的序列的DNA(以下、分別稱為引物A、引物B、引物C、引物D)。序列號67的序列是在用WO2004/058960號中記載的方法制備的質(zhì)粒pQE60ywfE的ywfE基因的含有核糖體結(jié)合序列-Shine-Dalgarno序列的區(qū)域的5′添加了含有XhoI識別序列的序列。序列號68的序列是在與含有ywfE基因的終止密碼子的序列的互補(bǔ)序列的5′添加了含有BamHI識別序列的序列。而序列編號69的序列是在含有trp啟動子的表達(dá)載體pTrS30的trp啟動子區(qū)域序列的5′端附加了含有EcoRI識別序列的序列。序列編號70的序列是在與含有trp啟動子的表達(dá)載體pTrS30的trp啟動子區(qū)域序列互補(bǔ)的序列的5′附加了含有XhoI識別序列的序列。以質(zhì)粒pQE60ywfE作為模板，在ywfE片段的擴(kuò)增中，作為引物組使用上述的引物A和引物B，在trp啟動子區(qū)域片段的擴(kuò)增中使用引物C和引物D分別作為引物組進(jìn)行PCR。通過制備含有10ng的pQE60ywfE、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μl的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l的各dNTP的40μl的反應(yīng)液，反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)在使用引物A和引物B的PCR中，相當(dāng)于ywfE基因片段的約1.4kb擴(kuò)增，在使用引物C和引物D的反應(yīng)中相當(dāng)于trp啟動子區(qū)域的片段的約0.3kb片段擴(kuò)增后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃撊芤弘x心分離后得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液離心分離后得到的DNA溶解于20μl的TE中。將使用上述得到的各DNA溶液5μl通過引物A和引物B擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI切斷，另外就將通過引物C和引物D擴(kuò)增的DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI切斷，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，通過GENECLEANII試劑盒分別回收含有ywfE基因的1.4kb和含有trp啟動子區(qū)域的0.3kbDNA片段。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI切斷0.2μg的含有trp啟動子的表達(dá)載體pTrS30后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣回收4.5kb的DNA片段。使用連接試劑盒對上述得到的含有ywfE基因的1.4kb片段、含有trp啟動子區(qū)域的0.3kb片段以及4.5kb片段于16℃下進(jìn)行16小時(shí)連接反應(yīng)。使用該反應(yīng)液按照使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸菌NM522株后，將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，于30℃下培養(yǎng)過夜。按照眾所周知的方法從逐漸生長的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒。通過限制性內(nèi)切酶消化確認(rèn)了該質(zhì)粒是在trp啟動子下游含有ywfE基因的表達(dá)載體，命名為pPE56?；诒磉_(dá)質(zhì)粒pPE56，按照以下方法構(gòu)建同時(shí)組成型表達(dá)枯草芽孢桿菌來源的丙氨酸脫氫酶基因(ald基因)的表達(dá)質(zhì)粒。使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成機(jī)，合成具有序列號71和序列號72表示的堿基序列的DNA(以下、分別稱為引物E、引物F)。序列號71表示的堿基序列是在ald基因的含有核糖體結(jié)合序列-Shine-Dalgarno序列的區(qū)域的5′添加了含有BamHI識別序列的堿基序列的序列。序列號72表示的堿基序列是在ald基因的含有與終止密碼子的序列相互補(bǔ)的序列的5′添加了含有BamHI識別序列的序列的序列。以枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，使用上述引物E和引物F作為引物組進(jìn)行PCR。通過制備含有0.1μg的染色體DNA、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μl的PfuDNA聚合酶用×10緩沖液、200μmol/l的各dNTP的40μl的反應(yīng)液，反復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)步驟進(jìn)行PCR。將該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增了相當(dāng)于ald基因片段的約1.2kb的片段后，添加與余下的反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液，并混合。向?qū)⒃撊芤弘x心分離后得到的上層加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分鐘。將該溶液離心分離獲得的DNA的沉淀，溶解于20μl的TE中。使用5μL該溶解液，用限制性內(nèi)切酶BamHI切斷擴(kuò)增的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后，通過GENECLEANIIKit回收含有ald基因的1.2kb的DNA片段。用限制性內(nèi)切酶BamHI切斷pPE56(0.2μg)后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用與上述相同的方法回收6.3kb的DNA片段。通過在60℃下、堿性磷酸酶(E.coliC75、takarabio公司制)處30分鐘進(jìn)行該6.3kb的DNA片段的末端脫磷酸化。添加與反應(yīng)液等量的TE飽和苯酚/氯仿溶液、并混合，然后離心分離后，在獲得的上層中加入2倍容量的冷乙醇、于-80℃下放置30分鐘。將該溶液離心分離獲得的DNA的沉淀，溶解于20μl的TE中。用連接試劑盒于16℃，使上述獲得的含有ald基因的1.2kb的DNA片段與經(jīng)堿性磷酸酶處理的6.3kb的DNA片段進(jìn)行16小時(shí)連接反應(yīng)。使用該反應(yīng)液按照使用鈣離子的方法轉(zhuǎn)化大腸菌NM522株后，將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，于30℃下培養(yǎng)過夜。按照眾所周知的方法從逐漸生長的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒。通過限制性內(nèi)切酶消化確認(rèn)了獲得了ald基因與ywfE基因同向插入的質(zhì)粒，將其命名為pPE86。實(shí)驗(yàn)例5具有生產(chǎn)具有生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的能力、和生成L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的能力，并且二肽酶和二肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因發(fā)生缺失的微生物的制備用上述實(shí)驗(yàn)例4制備的pPE86轉(zhuǎn)化上述實(shí)驗(yàn)例2中獲得的大腸桿菌JPNDDPGBE1株，獲得攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌JPNDDPGBE1/pPE86。以下公開實(shí)施例，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)將上述實(shí)驗(yàn)例5中獲得的大腸桿菌JPNDDPGBE1/pPE86接種于含有含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l氯化鈉)的試管中，于28℃培養(yǎng)17小時(shí)。在含有氨芐青霉素100μg/ml的TF培養(yǎng)基(16g/l磷酸氫二鈉、14g/l磷酸二氫鉀、5g/l硫酸銨、1g/l檸檬酸、0.5g/l酪蛋白氨基酸、1g/l脯氨酸、2.5g/l丙氨酸、2.5g/l谷氨酰胺、10mg/l維生素B1、25mg/l硫酸鎂、50mg/l硫酸鐵、10g/l葡萄糖)中按1％添加獲得的培養(yǎng)液，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。用F-moc化法將培養(yǎng)終止后的培養(yǎng)上清衍生物化后，用HPLC分析。在使用HPLC進(jìn)行的分析中，使用ODS-HG5(野村化學(xué)公司制)作為分離柱，使用A液(用6ml/l醋酸、20％(v/v)乙腈、三乙胺，調(diào)整到pH4.8)和B液(用6ml/l醋酸、70％(v/v)乙腈、三乙胺，調(diào)整到pH4.8)作為洗脫液，在到分析開始5分鐘，A液∶B液＝8∶2、到5分鐘～20分鐘，到20分鐘時(shí)A液∶B液＝1∶1那樣進(jìn)行線性梯度洗脫的條件下進(jìn)行分析。其結(jié)果，確認(rèn)了在培養(yǎng)上清中積累了1g/l的丙氨酰谷氨酰胺。實(shí)施例2L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶的制備將大腸桿菌JPNDDPGBE1/pPE86接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)。在含有1.95L的JF培養(yǎng)基(6g/l磷酸氫二鈉、3g/l磷酸二氫鉀、5g/l氯化鈉、5g/l酵母提取物、2g/l硫酸鎂、0.2g/l硫酸亞鐵、0.01g/l硫酸錳、1g/l氯化銨、0.2g/l脯氨酸、0.01g/l硫胺鹽酸鹽、10g/l葡萄糖)的溶劑為6L的罐中添加50ml獲得的培養(yǎng)液、一邊通氣攪拌一邊于32℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)中，除了添加適當(dāng)?shù)钠咸烟恰-谷氨酰胺和L-丙氨酸外，用氨水將pH維持在6.6-7.0，培養(yǎng)60小時(shí)，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在培養(yǎng)液中積累。在上述獲得的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養(yǎng)液中加入鹽酸使pH為pH3，于80℃加熱1小時(shí)，分解殘留的谷氨酰胺。冷卻至室溫后、通過離心分離除去菌體后、以1.6ml上清/ml樹脂的負(fù)載量將上清上柱于填充了強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂-MarathonC(Dow化學(xué)公司制)的柱中，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺吸附于該樹脂。充分水洗后、用0.7mol/l的水酸化鈉洗脫L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，分離獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的級分。將該級分以10ml級分液/ml樹脂的負(fù)載量上柱于填充了弱酸性陽離子交換樹脂IRC50(Rohm&Haas公司制)的柱中，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后，用水通柱，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺洗脫，分離獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的級分。以23ml級分液/ml樹脂的負(fù)載量將該級分上柱于填充了強(qiáng)堿基性陰離子交換樹脂PA412(三菱化學(xué)公司制)的柱，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、用水通柱，分離獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的級分。減壓濃縮該級分，獲得了濃度為約450g/l的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的濃縮液。用鹽酸將pH調(diào)整成5.7后、于60℃一邊緩慢攪拌一邊添加甲醇。甲醇的濃度達(dá)到約33％時(shí)，以濃縮液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的2.5重量％量添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶作為晶種后、再添加甲醇直至其濃度達(dá)到80％。該甲醇溶液冷卻至20℃后，通過過濾分離產(chǎn)生的結(jié)晶，獲得粗結(jié)晶。然后，將該粗結(jié)晶溶解于水中，以2800ml溶解液/ml樹脂的負(fù)載量上柱于填充了弱堿基性陰離子交換樹脂WA30(三菱化學(xué)公司制)的柱中，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、用水上柱使之洗脫L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，分離獲得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的級分。與上述同樣方式濃縮后，添加甲醇使結(jié)晶析出。過濾獲得的結(jié)晶后進(jìn)行干燥，獲得針狀結(jié)晶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的純化樣本。下面列出了結(jié)晶的分析結(jié)果。并且，旋光度的測定中，用HORIBASEPA-200(堀埸制作所公司制)、粉末X射線衍射中使用RAD-X(理學(xué)電機(jī)公司制)，按照各機(jī)器的使用說明書進(jìn)行測定。純化樣本的旋光度(20℃)：+9.7°粉末X射線衍射[衍射角(2θ°)、()內(nèi)表示相對強(qiáng)度比(表示I/I0)]：6.80(4)，11.10(2)，13.70(100)，18.60(4)，19.55(5)，20.65(75)，21.36(17)，21.60(9)，22.45(14)，23.25(8)，24.05(4)，24.75(3)，25.45(12)，26.00(2)，27.55(6)，29.85(3)，30.45(2)，32.40(2)，32.95(2)，33.95(2)，34.80(25)，35.15(3)，36.45(7)，36.80(3)，42.55(2)，43.40(2)以與參考例相同的方法分析上述獲得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶中所含的雜質(zhì)。結(jié)果示于表3。表3L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶中所含物質(zhì)的分析結(jié)果表中ND表示檢測限(區(qū)域％：0.002％)以下，DL體表示D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。如表3所示，清楚了本發(fā)明的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶不含DL-體、丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺和丙氨酰胺。也就是說，獲得了基本上不含在構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶。實(shí)施例3甲醇的結(jié)晶效果以與實(shí)施例2相同的方式將實(shí)施例2中獲得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的粗結(jié)晶(含0.111％丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺)溶解于水后、使用WA30樹脂進(jìn)行分餾，然后進(jìn)行濃縮。將獲得的濃縮液分成兩份。另一方面，以與實(shí)施例2相同，添加甲醇，另一方面，除了使用乙醇代替甲醇，添加乙醇直至其濃度達(dá)到75％之外，用與實(shí)施例2相同的方法使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶析出。干燥獲得的結(jié)晶后、用與參考例相同的方法測定丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺的量。結(jié)果示于表4。表4甲醇和乙醇的結(jié)晶效果表中的結(jié)晶率表示用[(溶劑添加前的溶液中的L-Ala-L-Gln量)-(殘留于結(jié)晶后的上清中的L-Ala-L-Gln量)]/(溶劑添加前的溶液中的L-Ala-L-Gln量)×100計(jì)算的值。如表4所示，清楚了通過使用甲醇結(jié)晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，可以從L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的結(jié)晶中有效除去丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供構(gòu)成成分中含有D-氨基酸的二肽、且基本上不含3個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽的二肽的結(jié)晶。序列表序列號38-人工序列的說明：合成的DNA序列號39-人工序列的說明：合成的DNA序列號40-人工序列的說明：合成的DNA序列號41-人工序列的說明：合成的DNA序列號42-人工序列的說明：合成的DNA序列號43-人工序列的說明：合成的DNA序列號44-人工序列的說明：合成的DNA序列號45-人工序列的說明：合成的DNA序列號46-人工序列的說明：合成的DNA序列號47-人工序列的說明：合成的DNA序列號48-人工序列的說明：合成的DNA序列號49-人工序列的說明：合成的DNA序列號50-人工序列的說明：合成的DNA序列號51-人工序列的說明：合成的DNA序列號52-人工序列的說明：合成的DNA序列號53-人工序列的說明：合成的DNA序列號54-人工序列的說明：合成的DNA序列號55-人工序列的說明：合成的DNA序列號56-人工序列的說明：合成的DNA序列號57-人工序列的說明：合成的DNA序列號58-人工序列的說明：合成的DNA序列號59-人工序列的說明：合成的DNA序列號60-人工序列的說明：合成的DNA序列號61-人工序列的說明：合成的DNA序列號62-人工序列的說明：合成的DNA序列號63-人工序列的說明：合成的DNA序列號64-人工序列的說明：合成的DNA序列號65-人工序列的說明：合成的DNA序列號66-人工序列的說明：合成的DNA序列號67-人工序列的說明：合成的DNA序列號68-人工序列的說明：合成的DNA序列號69-人工序列的說明：合成的DNA序列號70-人工序列的說明：合成的DNA序列號71-人工序列的說明：合成的DNA序列號72-人工序列的說明：合成的DNA<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社<120>二肽的結(jié)晶及其制備方法<130>11761<150>JP2005-95103<151>2005-03-29<160>72<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌168(Bacillussubt訃is168)<400>1MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheLysSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAsnLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GluMetPheGlyAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluIleLysLeuMetLysAsnArgGluPro305310315320GlyLeuIleGluSerAlaAlaArgPheAlaGlyTrpAsnMetIlePro325330335AsnIleLysLysValPheGlyLeuAspMetAlaGlnLeuLeuLeuAsp340345350ValLeuCysPheGlyLysAspAlaAspLeuProAspGlyLeuLeuAsp355360365GlnGluProTyrTyrValAlaAspCysHisLeuTyrProGlnHisPhe370375380LysGlnAsnGlyGlnIleProGluThrAlaGluAspLeuValIleGlu385390395400AlaIleAspIleProAspGlyLeuLeuLysGlyAspThrGluIleVal405410415SerPheSerAlaAlaAlaProGlyThrSerValAspLeuThrLeuPhe420425430GluAlaPheAsnSerIleAlaAlaPheGluLeuLysGlySerAsnSer435440445GlnAspValAlaGluSerIleArgGlnIleGlnGlnHisAlaLysLeu450455460ThrAlaLysTyrValLeuProVal465470<210>2<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌ATCC6633<400>2MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheGlnSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAspLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GlnMetPheGluAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluIleLysLeuMetLysAsnArgGluPro305310315320GlyLeuIleGluSerAlaAlaArgPheAlaGlyTrpAsnMetIlePro325330335AsnIleLysLysValPheGlyLeuAspMetAlaGlnLeuLeuLeuAsp340345350ValLeuCysPheGlyLysAspAlaAspLeuProAspGlyLeuLeuAsp355360365GlnGluProTyrTyrValAlaAspCysHisLeuTyrProGlnHisPhe370375380LysGlnAsnGlyGlnIleProGluThrAlaGluAspLeuValIleGlu385390395400AlaIleAspIleProAspGlyLeuLeuLysGlyAspThrGluIleVal405410415ThrPheSerAlaAlaAlaProGlyThrSerValAspLeuThrLeuPhe420425430GluAlaPheAsnSerIleAlaAlaPheGluLeuLysGlySerAsnSer435440445GlnAspValAlaGluSerIleArgGlnIleGlnGlnHisAlaLysLeu450455460ThrAlaLysTyrValLeuProVal465470<210>3<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌IAM1213<400>3MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheLysSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAsnLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GluMetPheGlyAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluIleLysLeuMetLysAsnArgGluPro305310315320GlyLeuIleGluSerAlaAlaArgPheAlaGlyTrpAsnMetIlePro325330335AsnIleLysLysValPheGlyLeuAspMetAlaGlnLeuLeuLeuAsp340345350ValLeuCysPheGlyLysAspAlaAspLeuProAspGlyLeuLeuAsp355360365GlnGluProTyrTyrValAlaAspCysHisLeuTyrProGlnHisPhe370375380LysGlnAsnGlyGlnIleProGluThrAlaGluAspLeuValIleGlu385390395400AlaIleAspLeuProAspGlyLeuLeuLysGlyAspThrGluIleVal405410415SerPheSerAlaAlaAlaProGlyThrSerValAspLeuThrLeuPhe420425430GluAlaPheAsnSerIleAlaAlaPheGluLeuLysGlySerAsnSer435440445GlnAspValAlaGluSerIleArgGlnIleGlnGlnHisAlaLysLeu450455460ThrAlaLysTyrValLeuProVal465470<210>4<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌IAM1107<400>4MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValValLysAspLysAspTyrPheLysSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAsnLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GluMetPheGlyAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluValLysLeuMetLysAsnArgGluPro305310315320GlyLeuIleGluSerAlaAlaArgPheAlaGlyTrpAsnMetIlePro325330335AsnIleLysLysValPheGlyLeuAspMetAlaGlnLeuLeuLeuAsp340345350ValLeuCysPheGlyLysAspAlaAspLeuProAspGlyLeuLeuAsp355360365GlnGluProTyrTyrValAlaAspCysHisLeuTyrProGlnHisPhe370375380LysGlnAsnGlyGlnIleProGluThrAlaGluAspLeuValIleGlu385390395400AlaIleAspIleProAspGlyLeuLeuLysGlyAspThrGluIlePhe405410415SerPheSerAlaAlaAlaProGlyThrSerValAspLeuThrLeuPhe420425430GluAlaPheAsnSerIleAlaAlaPheGluLeuLysGlySerAsnSer435440445GlnAspValAlaGluSerIleArgGlnIleGlnGlnHisAlaLysLeu450455460ThrAlaLysTyrValLeuProVal465470<210>5<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌IAM1214<400>5MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheGlnSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAspLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GlnMetPheGluAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuG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