專利名稱：制備格拉太咪爾的方法
技術領域：
本發(fā)明提供了制備多肽或其可藥用鹽的方法。更具體地，本發(fā)明提供了制備乙酸格拉太咪爾的方法。
背景技術：
COPAXONE是乙酸格拉太咪爾(FDA批準的用于治療多發(fā)性硬化的藥物)的商品名。COPAXONE還已知為共聚物1(Copolymer-1)。COPAXONE商標公開了COPAXONE由合成多肽的乙酸鹽組成，并且平均分子量為4.7-11.0千道爾頓(KDa)，所述合成多肽包含四個天然存在的氨基酸L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-賴氨酸，它們的平均摩爾分數(shù)分別是0.141、0.427、0.095和0.338。COPAXONE包含具有不同分子量和序列的多肽的混合物。COPAXONE的結(jié)構式是(Glu，Ala，Lys，Tyr)x·xCH3COOH(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)x·xC2H4O2COPAXONE是包含20mg乙酸格拉太咪爾和40mg甘露糖醇的白色到灰白色、無菌、凍干的粉劑。它在單一用途的小瓶中提供以在用無菌水重構后用于皮下施用。
制備共聚物1或乙酸格拉太咪爾的方法已經(jīng)在美國專利號3,849,550；5,800,808；5,981,589；6,048,898；6,054,430；6,342,476；和6,362,161中描述。合成乙酸格拉太咪爾的方法是基于下列聚合反應在無水二烷中，在室溫下使用二乙胺作為引發(fā)劑聚合酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸γ-芐酯和Nε-三氟乙酰賴氨酸的N-甲酸酐(N-carboxyanhydride)以形成受保護的多肽。γ-芐基基團的解封閉(第一次去保護)是通過在室溫下在溴化氫/乙酸中攪拌受保護的多肽來實現(xiàn)的。這些條件也促進了共聚物的切割。下一步是通過用1M哌啶處理來移除共聚物的Nε-三氟乙?；鶊F(第二次去保護)。在最終步驟中，通過用透析純化共聚物、隨后用乙酸處理以形成乙酸鹽并且通過對水的透析進行另一次純化，得到乙酸格拉太咪爾。因此，這些現(xiàn)有技術方法包括四個N-甲酸酐的聚合反應、兩次去保護步驟、兩次純化步驟和一次乙酸鹽形成步驟。
美國專利號6,620,847描述了制備共聚物1的方法，其包括用哌啶水溶液處理三氟乙酰基共聚物1以形成共聚物1的溶液和純化共聚物1。
美國專利申請公開號2004/0091956描述了制備乙酸格拉太咪爾的三步方法。方法包括聚合L-丙氨酸、L-酪氨酸、受保護的L-谷氨酸和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物以得到受保護的多肽或其鹽；以及通過在氫氣壓力下的鈀催化的轉(zhuǎn)移氫化或鈀催化的氫化來將受保護的多肽或其鹽去保護。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(i)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐(N-carboxyanhydride)、L-丙氨酸的N-甲酸酐；受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐；和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧芐酯(γ-p-methoxybenzyl L-glutamate)、L-谷氨酸γ-芐酯(γ-benzyl L-glutamate)和其混合物；以及(ii)將酸加入到在步驟(i)中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。
本發(fā)明提供了制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括用堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物水溶液處理受保護的多肽以形成多肽或其可藥用鹽。
本發(fā)明提供了制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)2在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)2將酸與在步驟(a)2中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物；以及(c)2將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
本發(fā)明提供了制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)3在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)3將酸與在步驟(a)3中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物；以及(c)3將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)3中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法。多肽或其可藥用鹽優(yōu)選是乙酸格拉太咪爾。
I.酸水解方法在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(i)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(ii)將酸加入到在步驟(i)中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。
在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(b)將酸加入到在步驟(a)中形成的保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下；以及(c)用乙酸處理在步驟(b)中形成的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
在本發(fā)明方法的聚合步驟步驟(i)、步驟(a)、步驟(a)1、步驟(a)1’、步驟(a)2、步驟(a)2’、步驟(a)3和步驟(a)3’中，L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物優(yōu)選在約10℃到約40℃的溫度下聚合，更優(yōu)選在約20℃到約30℃下聚合。聚合反應優(yōu)選進行約2小時到約80小時的時間，更優(yōu)選是約20小時到約50小時。最優(yōu)選地，聚合反應在溫度為25℃下進行約24小時的時間。
極性非子溶劑優(yōu)選選自四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。最優(yōu)選地，極性非質(zhì)子溶劑是1，4-二烷。還可以使用極性非質(zhì)子溶劑的混合物。
用在本發(fā)明方法的步驟(i)、步驟(a)、步驟(a)1、步驟(a)1’、步驟(a)2、步驟(a)2’、步驟(a)3和步驟(a)3’中的引發(fā)劑可以是任何烷基胺引發(fā)劑，如二烷基胺或三烷基胺。每個烷基基團優(yōu)選具有1-6個碳原子。優(yōu)選的烷基胺引發(fā)劑是二乙胺。優(yōu)選地，二乙基胺以這樣的量存在，所述量占L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐混合物重量的約0.001重量百分數(shù)(wt.％)到約2wt.％，更優(yōu)選為從約0.01wt.％到約0.02wt.％。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在聚合后向聚合混合物加入水。水的加入使得受保護的多肽沉淀。通過真空過濾優(yōu)選地將水從包含水和受保護的多肽的混合物中移除，并且將回收的受保護的多肽干燥。干燥方法是本領域技術人員已知的，如真空干燥。
在本發(fā)明方法的去保護步驟步驟(ii)中，將酸加入到在步驟(i)中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽。酸將γ-對-甲氧基芐基基團或γ-芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。另外，酸裂解多肽或其可藥用鹽的酰胺鍵，形成異質(zhì)性多肽片段。
在本發(fā)明方法的去保護步驟步驟(b)中，將酸加入到在步驟(a)中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾。酸將γ-對-甲氧基芐基基團或γ-芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。另外，酸裂解格拉太咪爾的酰胺鍵，形成異質(zhì)性格拉太咪爾片段。
適當?shù)乃岚ǖ幌抻谝宜?、鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、磷酸、三氟乙酸和硫酸。還可以使用酸的混合物。優(yōu)選的酸選自三氟乙酸、乙酸和鹽酸的混合物、乙酸和氫溴酸的混合物以及乙酸和硫酸的混合物。酸可以以水溶液的形式加入。
酸優(yōu)選地以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約0.1wt.％到約100wt.％的量存在、更優(yōu)選地以約1wt.％到約10wt.％的量存在。最優(yōu)選地，酸以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約2wt.％到約6wt.％的量存在。
在酸加入過程中反應介質(zhì)溫度優(yōu)選從約10℃到約40℃，更優(yōu)選是從15℃到約30℃。酸優(yōu)選伴隨著攪拌在約1小時到約30小時的時間內(nèi)加入。最優(yōu)選地，在溫度為約25℃時伴隨著攪拌在約1小時到約8小時的時間內(nèi)將酸加入到受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾。
通過用氮氣清洗反應混合物、凍干或者通過在真空下的旋光式汽化器優(yōu)選地將過量的酸從反應混合物中移除以得到固體形式的去保護的多肽。但是，還可以使用本領域技術人員已知的其它分離技術。
將游離堿或酸加成鹽形式的去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾優(yōu)選地溶解在水或乙酸水溶液中。通過此類方法如透析或滲濾將不需要的低分子量的多肽或格拉太咪爾片段(即小于約2kDa)和高分子量的多肽或格拉太咪爾片段(即大于約40kDa)優(yōu)選地移除。優(yōu)選的膜包括Visking部分滲透的纖維素膜，如可以從Medicell International Ltd.獲得的具有分子量截留為12-14kDa的Size6膜；和切向流過濾(TFF)膜，如可從Millipore獲得的P ellicon XL PLCCC 10(50cm2)或PLCCC 5(50cm2)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾溶解在水中并且透析，隨后在乙酸水溶液中透析。
本發(fā)明已經(jīng)確定了所需分子量的多肽或其可藥用鹽可以通過稀釋、在步驟(ii)或步驟(b)中所加入酸的濃度，和/或時間來控制。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將水從去保護的多肽中移除。優(yōu)選的移除方法是凍干。在凍干中，將溶液冷凍并且放到真空下，從而使水(冰)在未融化下在真空中蒸發(fā)(升華)并且將非水成分(去保護的多肽和剩余鹽)以未被損害的狀態(tài)(即沒有化學分解)留下。凍干的干燥產(chǎn)物包含去保護的多肽和剩余的鹽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用冰乙酸處理去保護的多肽以形成格拉太咪爾乙酸鹽。優(yōu)選地通過凍干收集格拉太咪爾乙酸鹽以提供格拉太咪爾乙酸鹽產(chǎn)物。
II.相轉(zhuǎn)移方法在本發(fā)明的一個實施方案中，用于制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法包括用堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液處理受保護的多肽以形成多肽或其可藥用鹽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)1在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；以及(b)1將堿性或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1中形成的保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)1’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、L-谷氨酸γ-芐酯L-谷氨酸的N-甲酸酐和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾；(b)1’將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1’中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾；以及(c)1’用乙酸處理格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
在本發(fā)明方法的去保護步驟步驟(b)1和步驟(b)1’中，將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1中形成的保護的受多肽中或加入到在步驟(a)1’中形成受保護的格拉太咪爾中。在步驟(b)1和步驟(b)1’中，移除了在谷氨酸部分上的保護基(即γ-芐基基團)和在賴氨酸部分上的保護基(即Nε-三氟乙?；鶊F)。另外，堿金屬或堿土金屬氫氧化物裂解多肽或格拉太咪爾的酰胺鍵，形成異質(zhì)性多肽或格拉太咪爾片段。
盡管不希望被任何具體理論束縛，本發(fā)明人相信將保護基從受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾上移除使得去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾進行從有機相到水相的相轉(zhuǎn)移。
在步驟(b)1或步驟(b)1’中沒有緩沖液時，在加入堿金屬或堿土金屬氫氧化物的水溶液后，在步驟(b)1和步驟(b)1’過程中pH一般是約13到約14。在步驟(b)1或步驟(b)1’中存在緩沖液時，pH一般是約8到約12。緩沖液可以是加入的或在原位形成的。優(yōu)選的緩沖液是乙酸鹽緩沖液如乙酸鈉。
堿金屬或堿土金屬氫氧化物優(yōu)選選自氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鉀和氫氧化鈉。更優(yōu)選地，堿金屬或堿土金屬氫氧化物是氫氧化鈉。還可以使用堿金屬或堿土金屬氫氧化物的組合。
堿金屬或堿土金屬氫氧化物優(yōu)選地以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約0.1wt.％到約400wt.％的量存在，更優(yōu)選以占約10wt.％到約300wt.％的量存在。最優(yōu)選地，堿金屬或堿土金屬氫氧化物以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約140wt.％到約260wt.％的量存在。
優(yōu)選在從約-78℃到約40℃，更優(yōu)選從-25℃到約30℃的溫度下，將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾中，優(yōu)選進行約1小時到約30小時的時間。最優(yōu)選地，在從約-10℃到約10℃(例如0℃)的溫度下，將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾中，進行約1小時到約8小時的時間，伴隨著攪拌。堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液的加入導致了相的分離，其中形成了有機相和水相。
有機相大體上包含極性非質(zhì)子溶劑和受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾。水相大體上包含水、堿金屬或堿土金屬氫氧化物，以及游離堿形式的去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。通過使用離心和潷析有機相優(yōu)選地將水相和有機相分離。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)勢是堿金屬或堿土金屬氫氧化物的加入引起了受保護的多肽去保護以形成去保護的多肽，或引起受保護的格拉太咪爾去保護以形成去保護的格拉太咪爾。另外，堿金屬或堿土金屬氫氧化物引起在去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾中酰胺鍵的斷裂而形成多肽或格拉太咪爾片段。
用有機酸或無機酸優(yōu)選地處理水相以實現(xiàn)約7到約8的pH。調(diào)節(jié)pH的此類有機酸或無機酸是本領域技術人員已知的并且包括但不限于，乙酸、甲酸、乙二酸和鹽酸。稀釋的鹽酸是優(yōu)選的。使用的有機酸或無機酸的量優(yōu)選是基于在步驟(b)1或步驟(b)1’過程中加入的堿金屬或堿土金屬氫氧化物量的當量，它足夠產(chǎn)生約7到約8的pH。
通過此類方法如透析或滲濾，優(yōu)選地移除不需要的低分子量多肽或格拉太咪爾片段(即小于約2kDa)和高分子量多肽或格拉太咪爾片段(即大于約40kDa)。優(yōu)選的膜包括Visking部分滲透的纖維素膜，如可以從MedicellInternational Ltd.獲得的具有分子量截留為12-14kDa的Size6膜；和切向流過濾(TFF)膜，如可從Millipore獲得的Pellicon XL PLCCC 10(50cm2)或PLCCC 5(50cm2)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾在水中透析，隨后在乙酸水溶液中透析。
III.使用胺或氨的方法在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)2在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)2將酸與在步驟(a)2中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物，優(yōu)選地，將酸與包含受保護的多肽和溶劑的溶液或混懸液混合；以及(c)2將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)2’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中所述受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；(b)2’將酸與在步驟(a)2’中形成的保護的格拉太咪爾和溶劑混合以形成產(chǎn)物；(c)2’將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的格拉太咪爾；以及
(d)2’用乙酸處理在步驟(c)2’中形成的去保護的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
在本發(fā)明方法的第一個去保護步驟步驟(b)2和步驟(b)2’中，將酸與在步驟(a)2中形成的受保護的多肽或在步驟(a)2’中形成的受保護的格拉太咪爾，和溶劑混合以形成產(chǎn)物。優(yōu)選地，將酸加入到混合物(即包含受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾和溶劑的溶液或混懸液)中。在(b)2和步驟(b)2’中，移除了在谷氨酸部分上的保護基(即γ-對-甲氧基芐基和/或γ-芐基基團)。盡管不希望被任何具體理論束縛，本發(fā)明人相信酸還裂解了受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾的酰胺鍵，形成異質(zhì)性多肽或格拉太咪爾片段。
適當?shù)乃岚ǖ幌抻谝宜?、鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、磷酸、三氟乙酸和硫酸。還可以使用酸的混合物。優(yōu)選的酸選自三氟乙酸、乙酸和鹽酸的混合物、乙酸和氫溴酸的混合物以及乙酸和硫酸的混合物。酸可以以水溶液的形式加入。
酸優(yōu)選地以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約0.1wt.％到約100wt.％的量存在、更優(yōu)選地以約1wt.％到約10wt.％的量存在。最優(yōu)選地，酸以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約2wt.％到約6wt.％的量存在。
在酸加入過程中反應介質(zhì)溫度優(yōu)選從約10℃到約40℃，更優(yōu)選是從15℃到約30℃。優(yōu)選地，酸加入(伴隨著攪拌)進行約1小時到約30小時的時間。最優(yōu)選地，在溫度為約25℃時將酸加入到受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾中(伴隨著攪拌)，進行約1小時到約8小時的時間。
用在第一個去保護步驟步驟(b)2和步驟(b)2’中的溶劑選自極性質(zhì)子溶劑和極性非質(zhì)子溶劑。優(yōu)選地，用在步驟(b)2和步驟(b)2’中的溶劑選自乙酸、四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、1，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。還可以使用溶劑的混合物。最優(yōu)選地，用在步驟(b)2和步驟(b)2’中的溶劑是四氫呋喃或乙酸。
在步驟(b)2和步驟(b)2’中使用的溶劑的量優(yōu)選地是在步驟(b)2或步驟(b)2’中所使用受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt.)，更優(yōu)選地，是約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。
在本發(fā)明方法的第二個去保護步驟步驟(c)2和步驟(c)2’中，將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2或步驟(b)2’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。
優(yōu)選地，將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)加入到混合物(即包含在步驟(b)2或步驟(b)2’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液)中。氨是NH3(含水的)或NH3(氣體)的形式。優(yōu)選地，使用具有pH為約7到約14的氨的水溶液。將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)加入到在步驟(b)2或步驟(b)2’中形成的產(chǎn)物中優(yōu)選地移除了保護基，如賴氨酸部分的Nε-三氟乙?；鶊F。優(yōu)選地去保護的多肽是游離堿形式的去保護的格拉太咪爾。
選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)優(yōu)選地以這樣的量存在，即所述量是在步驟(c)2或步驟(c)2’中使用的步驟(b)2或步驟(b)2’的產(chǎn)物總重量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt.)，更優(yōu)選地是約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。最優(yōu)選地，選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)以約50倍(wt.)到約150倍(wt.)的量存在。
在約10℃到約60℃、更優(yōu)選是約15℃到約40℃的溫度下，優(yōu)選地將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)2或步驟(b)2’中所形成產(chǎn)物以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液混合，優(yōu)選進行從約1分鐘到約60小時的時間，以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。適當?shù)娜軇┌ǖ幌抻谒臍溥秽?、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺?，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。優(yōu)選的溶劑是四氫呋喃。
更優(yōu)選地，在約20℃到約30℃的溫度下，將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)2或步驟(b)2’中所形成產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液混合，進行約1小時到約30小時的時間，以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。優(yōu)選地通過蒸發(fā)或真空蒸餾將未反應的二異丙胺或氨或任何溶劑或水移除。
優(yōu)選地通過如透析或滲濾的方法移除不需要的低分子量多肽或格拉太咪爾片段(即小于約2kDa)和高分子量多肽或格拉太咪爾片段(即大于約40kDa)。優(yōu)選的膜包括Visking部分滲透的纖維素膜，如可以從MedicellInternational Ltd.獲得的具有分子量截留為12-14kDa的Size6膜；和TFF膜，如可從Millipore獲得的Pellicon XL PLCCC 10(50cm2)或PLCCC 5(50cm2)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾在水中透析，隨后在乙酸水溶液中透析。
IV.使用堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽的方法在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)3在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)3將酸與在步驟(a)3中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物，優(yōu)選地，將酸與包含受保護的多肽和溶劑的溶液或混懸液混合；以及(c)3將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)3中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，方法包括(a)3’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中所述受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；(b)3’將酸與包含在步驟(a)3.中形成的受保護的格拉太咪爾和溶劑的混合物混合以形成產(chǎn)物；(c)3’將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)3’中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物的混合物混合，以形成去保護的格拉太咪爾；以及(d)3’用乙酸處理在步驟(c)3’中形成的去保護的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
在本發(fā)明方法的第一個去保護步驟步驟(b)3和步驟(b)3’中，將酸與在步驟(a)3中形成的保護的受多肽或在步驟(a)3’中形成的受保護的格拉太咪爾，以及溶劑混合以形成產(chǎn)物。優(yōu)選地，將酸加入到混合物(即包含受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾和溶劑的溶液或混懸液)中。在(b)3和步驟(b)3’中，移除了在谷氨酸部分的保護基(即γ-對-甲氧基芐基和/或γ-芐基基團)。盡管不希望被任何具體理論束縛，本發(fā)明人相信酸還裂解受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾的酰胺鍵，形成異質(zhì)性多肽片段。
適當?shù)乃岚ǖ幌抻谝宜?、鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、磷酸、三氟乙酸和硫酸。還可以使用酸的混合物。優(yōu)選的酸選自三氟乙酸、乙酸和鹽酸的混合物、乙酸和氫溴酸的混合物以及乙酸和硫酸的混合物。酸可以以水溶液的形式加入。
酸優(yōu)選地以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約0.1wt.％到約100wt.％的量存在、更優(yōu)選地以約1wt.％到約10wt.％的量存在。最優(yōu)選地，酸以占受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾重量的約2wt.％到約6wt.％的量存在。
在酸加入過程中反應介質(zhì)溫度優(yōu)選從約10℃到約40℃，更優(yōu)選是從15℃到約30℃。優(yōu)選地，酸加入(伴隨著攪拌)進行約1小時到約30小時的時間。最優(yōu)選地，在溫度為約25℃時將酸加入到受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾中(伴隨著攪拌)，進行約1小時到約8小時的時間。
用在第一個去保護步驟步驟(b)3和步驟(b)3’中的溶劑選自極性質(zhì)子溶劑和極性非質(zhì)子溶劑。優(yōu)選地，用在步驟(b)3和步驟(b)3’中的溶劑選自乙酸、四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、1，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。還可以使用溶劑的混合物。最優(yōu)選地，用在步驟(b)3和步驟(b)3’中的溶劑是四氫呋喃或乙酸。
在步驟(b)3和步驟(b)3’中使用的溶劑的量優(yōu)選地是在步驟(b)3或步驟(b)3’中所使用受保護的多肽或受保護的格拉太咪爾量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt.)，更優(yōu)選地，是約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。
在本發(fā)明方法的第二個去保護步驟步驟(c)3和步驟(c)3’中，將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)3或步驟(b)3’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。
優(yōu)選的，將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)加入到混合物(即包含在步驟(b)3或步驟(b)3’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液)中。將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)加入到在步驟(b)3或步驟(b)3’中形成的產(chǎn)物中優(yōu)選地移除了賴氨酸部分的Nε-三氟乙?；鶊F。優(yōu)選地去保護的多肽是游離堿形式的去保護的格拉太咪爾。
物質(zhì)選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽，并且包括氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鉀、氫氧化鋇、氫氧化鈉、碳酸鈣、碳酸鋰、碳酸鎂、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈣、碳酸氫鋰、碳酸氫鎂、碳酸氫鉀和碳酸氫鈉。更優(yōu)選地，在步驟(c)3或(c)3’中使用的物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鋰和氫氧化鉀。
選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)優(yōu)選地以這樣的量存在，即所述量是在步驟(c)3或步驟(c)3’中使用的步驟(b)3或步驟(b)3’的產(chǎn)物總重量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt.)，更優(yōu)選地是約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。最優(yōu)選地，選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)以約50倍(wt.)到約150倍(wt.)的量存在。
在約10℃到約60℃、更優(yōu)選是約15℃到約40℃的溫度下，優(yōu)選地將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)3或步驟(b)3’中所形成產(chǎn)物、以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液混合，進行優(yōu)選從約1分鐘到約60小時的時間，以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。適當?shù)娜軇┌ǖ幌抻谒臍溥秽?、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺?，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。優(yōu)選的溶劑是四氫呋喃。
更優(yōu)選地，在約20℃到約30℃的溫度下，將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)3或步驟(b)3’中所形成產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物的溶液或混懸液混合，進行約1小時到約30小時的時間，以形成去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾。優(yōu)選地通過蒸發(fā)或真空蒸餾移除未反應的堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或任何溶劑或水。
在步驟(c)3或步驟(c)3’中使用的溶劑或溶劑和水的混合物的量優(yōu)選地是在步驟(c)3或步驟(c)3’中所使用的步驟(b)3或步驟(b)3’產(chǎn)物總重量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt.)，更優(yōu)選地，是約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。
在第二個去保護步驟步驟(c)3和步驟(c)3’后，優(yōu)選在分液漏斗中分離任一層，或優(yōu)選地通過蒸發(fā)或真空蒸餾移除溶劑。去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾優(yōu)選地作為水中的溶液得到。
通過此類方法如透析或滲濾，優(yōu)選地移除不需要的低分子量多肽或格拉太咪爾片段(即小于約2kDa)和高分子量多肽或格拉太咪爾片段(即大于約40kDa)。優(yōu)選的膜包括Visking部分滲透的纖維素膜，如可以從MedicellInternational Ltd.獲得的具有分子量截留為12-14kDa的Size6膜；和TFF膜，如可從Millipore獲得的Pellicon XL PLCCC 10(50cm2)或PLCCC 5(50cm2)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將去保護的多肽或去保護的格拉太咪爾在水中透析，隨后在乙酸水溶液中透析。
根據(jù)本發(fā)明方法制備的多肽或其可藥用鹽的重量平均分子量優(yōu)選從約2kDa到約30kDa，更優(yōu)選從約4.7kDa到約11kDa，并且最優(yōu)選是從約7kDa到約10kDa，如通過氣體透過色譜(GPC)測定。優(yōu)選地，多肽或其可藥用鹽基本上沒有分子量大于約40kDa的多肽片段。優(yōu)選地，多肽或其可藥用鹽基本上沒有分子量小于約2kDa的多肽片段。如本文用到的，“基本沒有”意思是少于根據(jù)本發(fā)明方法制備的多肽重量的約5％、更優(yōu)選是少于根據(jù)本發(fā)明方法制備的多肽重量的約2.5％。
根據(jù)本發(fā)明方法制備的多肽或其可藥用鹽(優(yōu)選乙酸格拉太咪爾)可以通過本領域已知的常規(guī)方法配制。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將通過本發(fā)明方法制備的多肽或其可藥用鹽溶解或混懸在可藥用的液體載體如水中，并且將溶液或混懸液注射到體內(nèi)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將格拉太咪爾乙酸鹽溶解在包含水和甘露糖醇的混合物中，并且將溶液注射到體內(nèi)。
通常，將多肽或其可藥用鹽每天施用給患有多發(fā)性硬化的患者，例如以20mg乙酸格拉太咪爾的劑量。
下列非限制性實施例闡明了本發(fā)明的其他方面。
實施例1-7涉及制備乙酸格拉太咪爾的酸水解方法。
實施例1受保護的多肽的制備將L-丙氨酸的N-甲酸酐(860mg，7.5mmol)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(600mg，2.3mmol)、N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐(1410mg，5.2mmol)和L-酪氨酸的N-甲酸酐(300mg，1.4mmol)放在三頸燒瓶中。加入經(jīng)蒸餾的無水二烷(57ml)。加入二乙胺(3.4μl)。將得到的混合物在約22-25℃的溫度下機械攪拌24小時。將混合物緩慢的倒入100毫升去離子水中并且在真空下過濾。將固體在真空下保持12小時。
實施例2受保護的多肽的制備將L-丙氨酸的N-甲酸酐(430mg，3.75mmol)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(300mg，1.15mmol)、N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐(705mg，2.6mmol)和L-酪氨酸的N-甲酸酐(150mg，0.7mmol)放在三頸燒瓶中。加入經(jīng)蒸餾的無水二烷(28.5ml)。加入二乙胺(1.7μl)。將得到的混合物在約22-25℃的溫度下機械攪拌24小時。將混合物緩慢的倒入100毫升去離子水中并且在真空下過濾。將固體在真空下保持12小時。
實施例3用HBr/乙酸去保護在實施例1中制備的受保護的多肽將在實施例1中制備的受保護的多肽(200mg)混懸在7mL33％的溶于乙酸的氫溴酸中。原材料緩慢溶解形成紅棕色溶液。在約22℃的溫度下將混合物攪拌17小時。使用旋轉(zhuǎn)式汽化器在降低的壓力下將HBr/乙酸溶液蒸發(fā)到干燥。向此剩余物中加入100mL的水來溶解固體。將溶液放在管形(Size6)的Visking部分滲透的纖維素膜中，該膜具有分子量截留12-14kDa。Size6管直徑為27/32英寸、21.5mm，以及寬為32-34mm。該管可以從Medicell International Ltd獲得。將含有溶液的管在有水燒杯中攪動。通過滲透作用從透析管移除具有分子量小于約2kDa的多肽片段。將管從水中取出并且在含有0.3％的溶于水的乙酸的燒杯中攪動。將得到的產(chǎn)物從管中移除并且凍干以得到作為純白色固體的乙酸格拉太咪爾。
實施例4用HCl/乙酸去保護在實施例1中制備的受保護的多肽將在實施例1中制備的受保護的多肽(200mg)混懸在20mL混合物(用冰乙酸將9.4ml濃鹽酸調(diào)節(jié)到20mL來制備)中。原材料緩慢溶解形成略微混濁的溶液。在約22℃的溫度下將混合物攪拌17小時。使用旋轉(zhuǎn)式汽化器在降低的壓力下將HCl/乙酸溶液蒸發(fā)到干燥。向此剩余物中加入100mL的水來溶解固體。將溶液放在管形(Size6)的Visking部分滲透的纖維素膜中，該膜具有分子量截留12-14kDa。Size6管具有直徑27/32英寸、21.5mm，以及寬為32-34mm。該管可以從MedicellInternational Ltd獲得。將含有溶液的管在有水燒杯中攪動。通過滲透作用從透析管移除分子量小于約2kDa的多肽片段。將管從水中取出并且在含有0.3％的溶于水的乙酸的燒杯中攪動。將得到的產(chǎn)物從管中移除并且凍干以得到作為純白色固體的乙酸格拉太咪爾。
實施例5
用HCl/乙酸去保護在實施例2中制備的受保護的多肽將在實施例2中制備的受保護的多肽(200mg)混懸在20mL混合物(用冰乙酸將9.4ml濃鹽酸調(diào)節(jié)到20mL來制備)中。原材料緩慢溶解形成略微混濁的溶液。在約22℃的溫度下將混合物攪拌17小時。使用旋轉(zhuǎn)式汽化器在降低的壓力下將HCl/乙酸溶液蒸發(fā)到干燥。向此剩余物中加入100mL的水來溶解固體。將溶液放在管形(Size6)的Visking部分滲透的纖維素膜中，該膜具有分子量截留12-14kDa。Size6管具有直徑27/32英寸、21.5mm，以及寬為32-34mm。該管可以從MedicellInternational Ltd獲得。將含有溶液的管在有水燒杯中攪動。通過滲透作用從透析管移除分子量小于約2kDa的多肽片段。將管從水中取出并且在含有0.3％的溶于水的乙酸的燒杯中攪動。將得到的產(chǎn)物從管中移除并且凍干以得到作為純白色固體的乙酸格拉太咪爾。
實施例6使用UV檢測器通過GPC確定相對分子量GPC-UV檢測器條件洗脫液 磷酸鹽緩沖液0.05M，pH 7.4，5.6g Na2HPO4，116gNaCl/4L水柱 PSS Suprema，10μm，100A，8×300mm.
溫度23℃泵 TSP AS 3000自動取樣器注射體積50μL濃度約2.0mg/mL檢測器 在276nm下TSP UV2000GPC-軟件PSS WinGPC版本7.2
樣品COPAXONE(Lot#5308036)其中甘露糖醇已經(jīng)通過透析移除COPAXONE(Lot#8040341)其中甘露糖醇已經(jīng)通過透析移除樣品A是根據(jù)本發(fā)明方法在實施例4中制備的乙酸格拉太咪爾樣品B是根據(jù)本發(fā)明方法在實施例5中制備的乙酸格拉太咪爾樣品制備將稱重的樣品分散在洗脫液中并且允許在室溫下進行完全水合約12小時。將樣品溶液穿過1.0過濾裝置(Schleicher & Schuell)過濾將GPC的測試結(jié)果總結(jié)在表I中。
表I
在表I中的測試結(jié)果清楚說明用本發(fā)明方法制備的乙酸格拉太咪爾樣品A和樣品B的重量平均分子量分別是8.551kDa和7.689kDa，并且COPAXONE的重量平均分子量是7.923kDa和9.524kDa，取決于批號。
實施例7使用折射率檢測器通過凝膠滲透層析(GPC)確定相對分子量GPC-RI檢測器條件洗脫液磷酸鹽緩沖液0.05M，pH 7.4，5.6g Na2HPO4，116g
NaCl/4L水柱 PSS Suprema，10μm，100A，8×300mm溫度23℃泵 TSP AS 3000自動取樣器注射體積50μL濃度約2.0mg/mL檢測器 Shodex RI 71GPC-軟件PSS WinGPC版本7.2樣品COPAXONE(Lot#5308036)其中甘露糖醇已經(jīng)通過透析移除COPAXONE(Lot#8040341)其中甘露糖醇已經(jīng)通過透析移除樣品A是根據(jù)本發(fā)明方法在實施例4中制備的乙酸格拉太咪爾樣品B是根據(jù)本發(fā)明方法在實施例5中制備的乙酸格拉太咪爾樣品制備將稱重的樣品分散在洗脫液中并且允許在室溫下進行完全水合約12小時。將樣品溶液穿過1.0過濾裝置(Schleicher & Schuell)過濾使用RI檢測器的GPC的測試結(jié)果總結(jié)在表II中。
表II
在表II中的測試結(jié)果清楚說明用本發(fā)明方法制備的乙酸格拉太咪爾樣品A和樣品B的重量平均分子量分別是9.581kDa和8.224kDa，并且COPAXONE的重量平均分子量是8.663kDa和9.641kDa，取決于批號。
實施例8-17涉及用于制備乙酸格拉太咪爾的相轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明人已經(jīng)建立了1(低)到5(高)的等級以量化堿性化合物(氫氧化鈉)對格拉太咪爾形成的影響。測試結(jié)果總結(jié)在表III中。
表III.
在表III中的結(jié)果清楚說明0.1-1.0N氫氧化鈉溶液可以用來制備本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽產(chǎn)物。在表III中的結(jié)果還說明優(yōu)選使用濃度至少為0.25N的氫氧化鈉來促進有機相和水相的相分離。
實施例8
聚合步驟(a)將酪氨酸的N-甲酸酐(30mg，0.010mm)、丙氨酸的N-甲酸酐(62mg，0.054mm)、谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(42mg，0.016mm)和E-N-三氟乙酰賴氨酸的N-甲酸酐(100mg，0.037mm)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶中。向此混合物中加入20mL的無水四氫呋喃。得到澄清的溶液。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物攪拌48小時。通過蒸發(fā)移除四氫呋喃。將水(150mL)加入到剩余物中并且持續(xù)攪拌。得到白色固體。將固體過濾并且在真空下干燥器中干燥。
確定產(chǎn)量為154mg。
實施例9去保護步驟(b)將在實施例8中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將四氫呋喃(15mL)加入到燒瓶中并且攪拌。得到澄清的溶液。加入0.5N的氫氧化鈉水溶液(8mL)。氫氧化鈉溶液的加入使混合物變得混濁。將混合物在24-26℃下攪拌1小時。觀察到兩相的形成。將底層分離并且用稀釋的1N HCl水溶液酸化到pH＝6.0(伴隨著攪拌)。使用尼龍濾器(0.2微米Nylon Acrodisk)過濾粗格拉太咪爾游離堿溶液。
實施例10將在實施例8中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將四氫呋喃(15mL)加入到燒瓶中并且攪拌。得到澄清的溶液。加入0.25N的氫氧化鈉水溶液(10mL)。氫氧化鈉溶液的加入使混合物變得混濁。將混合物在25-26℃下攪拌16小時。將反應混合物離心15分鐘。觀察到兩相的形成。將底層分離并且用稀釋的HCl水溶液酸化到pH＝7-7.5(伴隨著攪拌)。繼續(xù)攪拌另外30分鐘并且測定pH為pH＝8.0。將粗格拉太咪爾游離堿溶液過濾。
實施例11聚合步驟。
將酪氨酸的N-甲酸酐(30mg，0.010mm)、丙氨酸的N-甲酸酐(62mg，0.054mm)、谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(42mg，0.016mm)和E-N-三氟乙酰賴氨酸的N-甲酸酐(100mg，0.037mm)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶中。向此混合物中加入20mL的無水二烷。得到澄清的溶液。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物攪拌48小時。向其中緩慢加入水(150mL)，伴隨著攪拌。得到白色固體。將固體過濾并且在真空下干燥器中干燥。
確定產(chǎn)量為170mg。
實施例12去保護步驟將在實施例11中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將二烷(15mL)加入到燒瓶中并且攪拌。得到澄清的溶液。加入0.5N的氫氧化鈉水溶液(10mL)。氫氧化鈉溶液的加入使混合物變得混濁。將混合物在25-26℃下攪拌16小時。將反應混合物離心15分鐘。觀察到兩相的形成。將底層分離并且用稀釋的HCl水溶液酸化到pH＝7-7.5(伴隨著攪拌)。繼續(xù)攪拌另外30分鐘并且測定pH為pH＝8.0。將粗格拉太咪爾游離堿溶液過濾。
實施例13在更低溫下進行去保護步驟將在實施例12中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將四氫呋喃(15mL)加入到燒瓶中并且將溶液溫度降低到0℃。將0.5N的氫氧化鈉水溶液(10mL)加入到溶液中，同時保持溫度為0℃。氫氧化鈉的加入使溶液變得混濁。溶液在0℃下攪拌3小時。觀察到兩相的形成。在0℃下將底層分離并且用稀釋的HCl水溶液酸化到pH＝7-7.5(伴隨著攪拌)。繼續(xù)攪拌另外30分鐘并且測定pH為約pH＝8.0。將粗格拉太咪爾游離堿溶液過濾。
實施例14用乙酸鹽溶液的去保護步驟將在實施例12中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將四氫呋喃(15mL)加入到燒瓶中并且將溶液溫度降低到0℃。將0.5N的氫氧化鈉水溶液(10mL)和乙酸(2mL)加入到溶液中，同時保持溫度為0℃并且pH＝12。氫氧化鈉和乙酸的加入使溶液變得混濁。溶液在0℃下攪拌3小時。觀察到兩相的形成。在0℃下將底層分離并且用稀釋的HCl水溶液酸化到pH＝7-7.5(伴隨著攪拌)。繼續(xù)攪拌另外30分鐘并且測定pH為約pH＝8.0。將粗格拉太咪爾游離堿溶液過濾。
實施例15將在實施例8中制備的受保護的乙酸格拉太咪爾75mg轉(zhuǎn)移到提供了磁力攪拌器的單頸燒瓶中。將二烷(15mL)加入到燒瓶中并且攪拌。得到澄清的溶液。加入0.25N的氫氧化鈉水溶液(10mL)。氫氧化鈉溶液的加入使混合物變得混濁。將混合物在25-26℃下攪拌16小時。將反應混合物離心15分鐘。觀察到兩相的形成。將底層分離并且用稀釋的HCl水溶液酸化到pH＝7-7.5(伴隨著攪拌)。繼續(xù)攪拌另外30分鐘并且測定pH為pH＝8.0。將粗格拉太咪爾游離堿溶液過濾。
實施例16滲濾(切向流過濾)將在實施例9中制備的粗格拉太咪爾游離堿溶液用水稀釋到120。將稀釋溶液首先過濾通過10K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC10(50cm2)，并且之后過濾通過10K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC5(50cm2)。將得到的濃縮液凍干。得到白色粉末。
實施例17乙酸格拉太咪爾純化的層析方法使在實施例9中制備的粗格拉太咪爾游離堿溶液經(jīng)過層析分離。根據(jù)制造商的說明，在Superformance 26 Merck柱體中制備用于凝膠過濾的柱子FRACTOGEL TSK HW55(600×26mm)。將柱子用0.2M乙酸銨緩沖液(pH＝5.0)平衡，將30mL格拉太咪爾游離堿溶液樣品(20mg/mL，溶于0.2M乙酸銨(pH 5.0))裝填到柱子上并且每10分鐘收集級分。分離具有平均分子量為7-8KDa的級分。
實施例18-25涉及使用堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽制備乙酸格拉太咪爾的方法。
實施例18受保護的多肽的制備將L-酪氨酸的N-甲酸酐(207.19mg，1.0mM)、L-丙氨酸的N-甲酸酐(620mg，5.4mM)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(430mg，1.6mM)和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐(1.01g，3.73mM)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶(100mL)中。向此混合物中加入40mL的四氫呋喃。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物在約25℃的溫度下攪拌24小時。將混合物緩慢倒入100mL水中，同時攪拌。將固體沉淀。在攪拌2小時后過濾固體并且用水洗滌。將固體重懸在100mL水中并且過濾。固體在真空下保持約12小時。
實施例19受保護的多肽的制備將L-酪氨酸的N-甲酸酐(207.19mg，1.0mM)、L-丙氨酸的N-甲酸酐(620mg，5.4mM)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(430mg，1.6mM)和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐(1.01g，3.73mM)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶(100mL)中。向此混合物中加入40mL的二烷。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物在約25℃的溫度下攪拌48小時。將混合物緩慢倒入100mL水中，同時攪拌。將固體沉淀。過濾固體并且用水洗滌。將固體重懸在100mL水中并且過濾。將固體在真空下保持約12小時。
實施例20從在實施例2中制備的多肽上切割γ-芐基部分將在實施例19中制備的受保護的多肽100mg混懸在四氫呋喃(20mL)中并且在冰水浴中冷凍。加入4mL濃硫酸。將得到的澄清溶液在約25℃的溫度下攪拌20小時。通過在25℃下蒸發(fā)移除溶劑四氫呋喃，以形成粘性液體。將50mL水加入到粘性液體中，伴隨著攪拌。形成白色沉淀物，將其在真空下過濾并且在黑暗中在25℃真空下用五氧化二磷干燥約12小時。得到白色固體。將固體過濾并且在真空下在干燥器中干燥。確定產(chǎn)量為75mg。
實施例21從在實施例20中制備的多肽上切割Nε-三氟乙酰基部分。
將在實施例20中制備的受保護的多肽75mg分散在12mL四氫呋喃中，加入4mL的0.5M氫氧化鈉水溶液，伴隨著攪拌。將混合物在環(huán)境溫度(約22℃)下攪拌3小時。將較低的水層分離并且用乙酸酸化到pH＝6.0。
實施例22從在實施例19中制備的多肽上切割γ-芐基部分。
將在實施例19中制備的受保護的多肽1g混懸在50mL混合物(用冰乙酸將47mL濃縮的HCl調(diào)節(jié)到100mL來制備)中。原材料緩慢溶解形成略微混濁的溶液。將混合物在約22℃的溫度下攪拌18小時。將溶液倒入1000mL攪拌的水中。形成白色沉淀物。將混懸液攪拌另外3小時并且之后過濾。將產(chǎn)物用水洗滌并且在50℃真空下干燥約17小時。
實施例23從在實施例22中制備的多肽上切割Nε-三氟乙?；糠帧?br> 將在實施例22中制備的受保護的多肽300mg分散在45mL四氫呋喃中，加入25mL的0.5M氫氧化鈉水溶液，伴隨著攪拌。將混合物在環(huán)境溫度(約22℃)下攪拌3小時。形成澄清的兩相液體系統(tǒng)。將較低的水層分離并且用乙酸酸化到pH＝6.0。將澄清無色的溶液裝滿透析袋并且在環(huán)境溫度下對0.3％乙酸水溶液透析1次，并且之后對水透析，直到達到pH5.5。將溶液過濾并且凍干以提供作為白色固體的乙酸格拉太咪爾。
實施例24滲濾(切向流過濾)將在實施例21中制備的乙酸格拉太咪爾溶液用水調(diào)節(jié)到120mL，以提供0.5-0.6mg/mL濃度的乙酸格拉太咪爾。將稀釋溶液首先過濾通過30K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC10(50cm2)，并且之后過濾通過3K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC5(50cm2)。將得到的濃縮的溶液凍干以提供固體形式的乙酸格拉太咪爾。
實施例25乙酸格拉太咪爾純化的層析方法使在實施例23中制備作為pH＝6的萃取物的格拉太咪爾在真空中濃縮至干燥并且進行層析分離。根據(jù)制造商的說明，在Superformance 26Merck柱體中制備用于凝膠過濾的柱子FRACTOGEL TSK HW55(600×26mm)。將柱子用0.2M乙酸銨緩沖液(pH＝5.0)平衡，將30mL格拉太咪爾游離堿溶液樣品(20mg/mL，溶于0.2M乙酸銨(pH 5.0))裝填到柱子上并且收集級分。分離平均分子量為7-10kDa的級分。
實施例26-33涉及使用胺或氨制備乙酸格拉太咪爾的方法。
實施例26受保護的多肽的制備將L-酪氨酸的N-甲酸酐(207.19mg，1.0mM)、L-丙氨酸的N-甲酸酐(620mg，5.4mM)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(430mg，1.6mM)和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐(1.01g，3.73mM)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶(100mL)中。向此混合物中加入40mL的四氫呋喃。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物在約25℃的溫度下攪拌24小時。將混合物緩慢倒入100mL水中，同時攪拌。將固體沉淀。在攪拌2小時后過濾固體并且用水洗滌。將固體重懸在100mL水中并且過濾。固體在真空下保持約12小時。
實施例27受保護的多肽的制備將L-酪氨酸的N-甲酸酐(207.19mg，1.0mM)、L-丙氨酸的N-甲酸酐(620mg，5.4mM)、L-谷氨酸γ-芐酯的N-甲酸酐(430mg，1.6mM)和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐(1.01g，3.73mM)放在具有磁力攪拌器的單頸燒瓶(100mL)中。向此混合物中加入40mL的二烷。加入二乙胺(10μL)。將得到的混合物在約25℃的溫度下攪拌48小時。將混合物緩慢倒入100mL水中，同時攪拌。將固體沉淀。過濾固體并且用水洗滌。將固體重懸在100mL水中并且過濾。將固體在真空下保持約12小時。
實施例28從在實施例27中制備的多肽上切割γ-芐基部分將在實施例27中制備的受保護的多肽100mg混懸在四氫呋喃(20mL)中并且在冰水浴中冷凍。加入4mL濃硫酸。將得到的澄清溶液在約25℃的溫度下攪拌20小時。通過在25℃下蒸發(fā)移除溶劑四氫呋喃，以形成粘性液體。將50mL水加入到粘性液體中，伴隨著攪拌。形成白色沉淀物，將其在真空下過濾并且在黑暗中在25℃真空下用五氧化二磷干燥約12小時。得到白色固體。將固體過濾并且在真空下在干燥器中干燥。確定產(chǎn)量為75mg。
實施例29從在實施例27中制備的多肽切割γ-芐基部分將在實施例27中制備的受保護的多肽1g混懸在50mL的混合物(用冰乙酸將47mL濃HCl調(diào)節(jié)到100mL來制備)中。原材料緩慢溶解形成略微混濁的溶液。將混合物在約22℃的溫度下攪拌18小時。將溶液倒入1000mL攪拌的水中。形成白色沉淀物。將混懸液攪拌另外3小時并且之后過濾。將產(chǎn)物用水洗滌并且在50℃真空下干燥約17小時。
實施例30對將用來從在實施例28中制備的多肽上切割Nε-三氟乙?；糠值陌返脑u估將在實施例28中制備的多肽75mg混懸在15mL水中。將7mL胺加入到混懸液中以提供3M濃度的胺。在表IV中提供了胺的列表。由于去保護的多肽在水中可溶，反應通過溶液透明度來監(jiān)控。在表IV中總結(jié)了每種胺的結(jié)果。
表IV
在表IV中的結(jié)果清楚表明在實施例28中制備的多肽的游離堿形式只有在加入二異丙胺或異丙胺時形成。在表I中的結(jié)果還表明二丙胺、嗎啉、N-甲基-哌嗪、二環(huán)己基胺、二仲丁基胺、吡咯烷和甲胺不能產(chǎn)生多肽的游離堿形式。
因此，申請人出乎意料地確定在本發(fā)明方法的第二個去保護步驟步驟(b)中，二異丙胺和異丙胺是僅有的能夠成功移除賴氨酸部分的Nε-三氟乙?；鶊F的胺。
實施例31從在實施例28中制備的多肽上切割Nε-三氟乙?；糠謱⒃趯嵤├?8中制備的多肽75mg混懸在15mL水中。將二異丙胺7mL加入到混懸液中以提供3M濃度的胺。在約1小時內(nèi)乳白色溶液變澄清并且將澄清的溶液在25℃下攪拌20小時。將反應混合物在約25℃下蒸發(fā)以形成粘性液體形式的粗格拉太咪爾游離堿。將百分之五十(50％)的乙酸(15mL)加入到混合物中并且攪拌30分鐘以形成乙酸格拉太咪爾溶液。
實施例32滲濾(切向流過濾)將在實施例31中制備的乙酸格拉太咪爾溶液用水稀釋到120mL。將稀釋溶液首先過濾通過30K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC10(50cm2)，并且之后過濾通過3K滲濾膜，即從Millipore可得的Pellicon XL，PLCCC5(50cm2)。將得到的濃縮溶液凍干以提供固體形式的乙酸格拉太咪爾。
實施例33乙酸格拉太咪爾純化的層析方法使在實施例31中制備的乙酸格拉太咪爾溶液在真空中濃縮以干燥并且進行層析分離。根據(jù)制造商的說明，在Superformance 26 Merck柱體中制備用于凝膠過濾的柱子FRACTOGEL TSK HW55(600×26mm)。將柱子用0.2M乙酸銨緩沖液(pH＝5.0)平衡，將30mL格拉太咪爾游離堿溶液樣品(20mg/mL，溶于0.2M乙酸銨(pH 5.0))加到柱子上并且收集級分。分離平均分子量為7-10kDa的級分。
盡管已經(jīng)具體參考其某些實施方案來描述本發(fā)明，但是要理解的是技術人員在下列權利要求的范圍和精神內(nèi)可以做出改變和修飾。
權利要求
1.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(i)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(ii)將酸加入到在步驟(i)中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。
2.制備乙酸格拉太咪爾的方法，其包括(a)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(b)將酸加入到在步驟(a)中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下；以及(c)用乙酸處理在步驟(b)中形成的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述酸選自乙酸、鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、磷酸、三氟乙酸、硫酸和其混合物。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述酸是乙酸和鹽酸的混合物。
5.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述酸是乙酸和氫溴酸的混合物。
6.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述酸是乙酸和硫酸的混合物。
7.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
8.根據(jù)權利要求2的方法，其中乙酸格拉太咪爾具有約2kDa到約30kDa的重量平均分子量。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中乙酸格拉太咪爾具有約4.7kDa到約11kDa的重量平均分子量。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中乙酸格拉太咪爾具有約7kDa到約10kDa的重量平均分子量。
11.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述多肽基本沒有分子量大于約40kDa的多肽片段。
12.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述多肽基本上沒有分子量小于約2kDa的多肽片段。
13.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(ii)在約10℃到約40℃的溫度下進行。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中步驟(ii)在約15℃到約30℃的溫度下進行。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中步驟(ii)在約22℃到約25℃的溫度下進行。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中引發(fā)劑是二乙胺。
17.根據(jù)權利要求1的方法，其中極性非質(zhì)子溶劑選自四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、1，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜、二氯甲烷和其混合物。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中極性非質(zhì)子溶劑是1，4-二烷。
19.根據(jù)權利要求17的方法，其中極性非質(zhì)子溶劑是四氫呋喃。
20.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述酸以占多肽或其可藥用鹽總重量的約0.1重量百分數(shù)(wt.％)到約100wt.％的量存在。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述酸以占多肽或其可藥用鹽總重量的約1wt.％到約10wt.％的量存在。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中所述酸以占多肽或其可藥用鹽總重量的約2wt.％到約6wt.％的量存在。
23.通過一種方法制備的多肽或其可藥用鹽，所述方法包括(i)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(ii)將酸加入到在步驟(i)中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下。
24.通過一種方法制備的乙酸格拉太咪爾，所述方法包括(a)在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和N-叔-丁氧基羰基L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；以及(b)將酸加入到在步驟(a)中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾，其中所述酸將γ-對-甲氧基芐基基團從谷氨酸部分切下并且將N-叔-丁氧基羰基基團從賴氨酸部分切下；以及(c)用乙酸處理在步驟(b)中形成的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
25.根據(jù)權利要求24的方法制備的乙酸格拉太咪爾，其中在步驟(c)之前移除重量平均分子量小于約2kDa的格拉太咪爾。
26.根據(jù)權利要求25的乙酸格拉太咪爾，其中通過選自透析和滲濾的方法移除重量平均分子量小于2kDa的格拉太咪爾。
27.根據(jù)權利要求26的乙酸格拉太咪爾，其中透析最初在水中進行，隨后在乙酸水溶液中透析。
28.根據(jù)權利要求24的方法制備的乙酸格拉太咪爾，其中所述方法另外包括在用乙酸處理格拉太咪爾后的凍干步驟。
29.治療患有炎性、非自身免疫中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者或減輕此類疾病癥狀的方法，其包括對患者施用根據(jù)權利要求1的方法制備的多肽或其可藥用鹽，其中所述多肽或其可藥用鹽的用量和持續(xù)時間能夠有效治療該炎性、非自身免疫中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
30.治療患有炎性、非自身免疫中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者或減輕此類疾病癥狀的方法，其包括對患者施用根據(jù)權利要求2的方法制備的乙酸格拉太咪爾，其用量和持續(xù)時間能夠有效治療該炎性、非自身免疫中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
31.根據(jù)權利要求30的方法，其中非自身免疫中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是多發(fā)性硬化。
32.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括用堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液處理受保護的多肽以形成多肽或其可藥用鹽。
33.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)1在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；以及(b)1將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽。
34.制備乙酸格拉太咪爾的方法，其包括(a)1’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、L-谷氨酸γ-芐酯L-谷氨酸的N-甲酸酐和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾；(b)1’將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1’中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾；以及(c)1’用乙酸處理格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
35.根據(jù)權利要求33的方法，其中步驟(b)1在約-78℃到約40℃的溫度下進行。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其中步驟(b)1在約-25℃到約30℃的溫度下進行。
37.根據(jù)權利要求36的方法，其中步驟(b)1在約-10℃到約10℃的溫度下進行。
38.根據(jù)權利要求37的方法，其中步驟(b)1在約0℃的溫度下進行。
39.根據(jù)權利要求32的方法，其中pH為約13到約14。
40.根據(jù)權利要求32的方法，其另外包含緩沖液。
41.根據(jù)權利要求40的方法，其中緩沖液是乙酸鹽緩沖液并且pH為約8到約12。
42.根據(jù)權利要求32的方法，其中堿金屬或堿土金屬氫氧化物選自氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鉀、氫氧化鈉和其混合物。
43.根據(jù)權利要求42的方法，其中堿金屬或堿土金屬氫氧化物是氫氧化鈉。
44.根據(jù)權利要求32的方法，其中堿金屬或堿土金屬氫氧化物以占多肽或其可藥用鹽總重量的約0.1wt.％到約400wt.％的量存在。
45.根據(jù)權利要求44的方法，其中堿金屬或堿土金屬氫氧化物以占多肽或其可藥用鹽總重量的約10wt.％到約300wt.％的量存在。
46.根據(jù)權利要求45的方法，其中堿金屬或堿土金屬氫氧化物以占多肽或其可藥用鹽總重量的約140wt.％到約260wt.％的量存在。
47.通過一種方法制備的多肽或其可藥用鹽，所述方法包括用堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液處理受保護的多肽以形成多肽或其可藥用鹽，其中所述的多肽包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸。
48.通過一種方法制備的多肽或其可藥用鹽，所述方法包括(a)1在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；以及(b)1將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1中形成的受保護的多肽中以形成多肽或其可藥用鹽。
49.通過一種方法制備的乙酸格拉太咪爾，所述方法包括(a)1’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、L-谷氨酸γ-芐酯L-谷氨酸的N-甲酸酐和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾；(b)1’將堿金屬或堿土金屬氫氧化物水溶液加入到在步驟(a)1’中形成的受保護的格拉太咪爾中以形成格拉太咪爾；以及(c)1’用乙酸處理在步驟(b)1’中形成的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
50.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)2在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)2將酸與在步驟(a)2中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物；以及(c)2將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
51.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)2在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)2將酸與包含在步驟(a)2中形成的受保護的多肽和溶劑的溶液或混懸液混合以形成產(chǎn)物；以及(c)2將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
52.根據(jù)權利要求50的方法，其中受保護的L-賴氨酸是Nε-三氟乙酰L-賴氨酸。
53.根據(jù)權利要求50的方法，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物。
54.根據(jù)權利要求53的方法，其中受保護的L-谷氨酸是L-谷氨酸γ-芐酯。
55.制備乙酸格拉太咪爾的方法，其包括(a)2’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中所述受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；(b)2’將酸與在步驟(a)2’中形成的受保護的格拉太咪爾和溶劑混合以形成產(chǎn)物；(c)2’將選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)2’中形成的產(chǎn)物，以及水或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的格拉太咪爾；以及(d)2’用乙酸處理在步驟(c)2’中形成的去保護的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
56.根據(jù)權利要求50的方法，其中用于步驟(b)2中的溶劑選自極性質(zhì)子溶劑、極性非質(zhì)子溶劑和其混合物。
57.根據(jù)權利要求56的方法，其中溶劑選自乙酸、四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、1，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。
58.根據(jù)權利要求57的方法，其中溶劑是四氫呋喃。
59.根據(jù)權利要求57的方法，其中溶劑是乙酸。
60.根據(jù)權利要求50的方法，其中選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)以這樣的量存在，所述量是在步驟(c)2中使用的步驟(b)2的產(chǎn)物的總重量的約1倍(wt.)到約1,000倍(wt)。
61.根據(jù)權利要求60的方法，其中選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)以約10倍(wt.)到約500倍(wt)的量存在。
62.根據(jù)權利要求61的方法，其中選自二異丙胺、異丙胺、氨和其混合物的物質(zhì)以約50倍(wt.)到約150倍(wt)的量存在。
63.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)3在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)3將酸與在步驟(a)3中形成的受保護的多肽和溶劑混合以形成產(chǎn)物；以及(c)3將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)3中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
64.制備包含L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法，其中所述方法包括(a)3在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和受保護的L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的多肽；(b)3將酸與包含在步驟(a)3中形成的受保護的多肽和溶劑的混合物混合以形成產(chǎn)物；以及(c)3將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與在步驟(b)3中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物混合，以形成去保護的多肽或其可藥用鹽。
65.根據(jù)權利要求63的方法，其中受保護的L-賴氨酸是Nε-三氟乙酰L-賴氨酸。
66.根據(jù)權利要求63的方法，其中受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物。
67.制備乙酸格拉太咪爾的方法，其包括(a)3’在極性非質(zhì)子溶劑中，在引發(fā)劑存在下，聚合L-酪氨酸的N-甲酸酐、L-丙氨酸的N-甲酸酐、受保護的L-谷氨酸的N-甲酸酐和Nε-三氟乙酰L-賴氨酸的N-甲酸酐的混合物，以形成受保護的格拉太咪爾，其中所述受保護的L-谷氨酸選自L-谷氨酸γ-對-甲氧基芐酯、L-谷氨酸γ-芐酯和其混合物；(b)3’將酸與包含在步驟(a)3’中形成的受保護的格拉太咪爾和溶劑的混合物混合以形成產(chǎn)物；(c)3’將選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)與包含在步驟(b)3’中形成的產(chǎn)物，以及溶劑或溶劑和水的混合物的混合物混合，以形成去保護的格拉太咪爾；以及(d)3’用乙酸處理在步驟(c)3’中形成的去保護的格拉太咪爾以形成乙酸格拉太咪爾。
68.根據(jù)權利要求63的方法，其中用于步驟(b)3中的溶劑選自極性質(zhì)子溶劑、極性非質(zhì)子溶劑和其混合物。
69.根據(jù)權利要求68的方法，其中溶劑選自乙酸、四氫呋喃、乙酸乙酯、二甲基呋喃、二甲基甲酰胺、1，4-二烷、二甲氧基乙烷、1，2-二氯乙烯、二甲亞砜和二氯甲烷。
70.根據(jù)權利要求69的方法，其中溶劑是四氫呋喃。
71.根據(jù)權利要69的方法，其中溶劑是乙酸。
72.根據(jù)權利要求63的方法，其中選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)以這樣的量存在，所述量占在步驟(c)3中使用的溶劑或溶劑和水的混合物總重量的約0.1wt.％到約10wt.％。
73.根據(jù)權利要求72的方法，其中選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)以這樣的量存在，所述量占在步驟(c)3中使用的溶劑或溶劑和水的混合物總重量的約0.1wt.％到約5wt.％。
74.根據(jù)權利要求63的方法，其中在步驟(c)3中使用的溶劑或溶劑和水的混合物以這樣的量存在，所述量是在步驟(c)3中所使用的步驟(b)3的產(chǎn)物的總重量的約1倍(wt.)到約1000倍(wt.)。
75.根據(jù)權利要求74的方法，其中在步驟(c)3中使用的溶劑或溶劑和水的混合物以這樣的量存在，所述量是在步驟(c)3中所使用的步驟(b)3的產(chǎn)物的總重量的約10倍(wt.)到約500倍(wt.)。
76.根據(jù)權利要求63的方法，其中選自堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和其混合物的物質(zhì)選自氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鉀、氫氧化鋇、氫氧化鈉、碳酸鈣、碳酸鋰、碳酸鎂、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈣、碳酸氫鋰、碳酸氫鎂、碳酸氫鉀和碳酸氫鈉。
77.根據(jù)權利要求76的方法，其中所述物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鋰和氫氧化鉀。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備包含L－酪氨酸、L－丙氨酸、L－谷氨酸和L－賴氨酸的多肽或其可藥用鹽的方法。該多肽或其可藥用鹽優(yōu)選是乙酸格拉太咪爾。
文檔編號C08G69/10GK101044188SQ200580035799
公開日2007年9月26日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權日2004年10月29日
發(fā)明者A·K·拉伊, H·K·V·帕特爾, J·盧德謝爾, M·安巴扎干, M·R·帕特爾, I·馬赫爾 申請人:桑多斯股份公司