專利名稱：一種香菇多糖的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種香菇多糖的分離純化方法。
背景技術(shù)：
香菇多糖是香菇中分離出來的一種具有明顯抗癌效果的活性物質(zhì)，于1969年在日本首次被發(fā)現(xiàn)，1986年日本首先生產(chǎn)并將香菇多糖制備成粉針劑銷售國(guó)外，臨床主要應(yīng)用于胃癌、直腸癌等消化系統(tǒng)癌癥，它的主要給藥途徑為靜脈滴注或推注，我國(guó)于1988年開始進(jìn)口日本味之素的香菇多糖，并應(yīng)用于臨床。自1982年以來，四川抗菌素研究所、河南省醫(yī)藥工業(yè)研究所先后從深層發(fā)酵培養(yǎng)的香菇液中提取香菇多糖，名為“香菇菌多糖”，以區(qū)別從子實(shí)體所提取的香菇多糖。1986年河南開封制藥廠生產(chǎn)香菇多糖片。同年衛(wèi)生部批準(zhǔn)福州梅峰制藥廠試產(chǎn)“香菇菌多糖片”和“香菇多糖肌肉注射劑”，均對(duì)慢性遷延性肝炎有效，可使部分乙型肝炎患者表面抗原轉(zhuǎn)陰；并配合化療藥物治療晚期食道癌、胃癌也有較好療效。目前市面上主要是南京振中生物工程有限公司生產(chǎn)的以香菇多糖為原料的注射用香菇多糖。
香菇多糖系從香菇子實(shí)體中獲得的單一組分(I) 它的提取分離十分復(fù)雜且得率很低，成本高。日本專利昭48-6767(1973)；昭49-484(1974)。近來曾有報(bào)導(dǎo)采用凝膠柱層析法，但該法只能獲得少量供研究用樣品，無法應(yīng)用于生產(chǎn)，而且由于凝膠價(jià)格昂貴使成本很高。
CN1153179A公開了香菇多糖的分離純化方法，它是由香菇多糖熱水提取濃縮、乙醇沉淀、沉淀物溶解后透析，乙醇沉淀所得粗品DEAE-纖維素吸附，不同濃度堿液洗脫，糖反應(yīng)陽性的洗脫液合并酸中和，超過濾，未透過部份濃縮，凍干即得。所用的原料用干香菇，每10公斤得單一香菇多糖2～2.4g，總收率0.02％～0.022％。該分離純化工藝收率低，多糖損失大，且工藝重現(xiàn)性、可操作性差。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了香菇多糖分離純化方法。本發(fā)明還提供該分離方法所得的香菇多糖。
本發(fā)明提供了一種香菇多糖分離純化方法，它包括如下步驟a、取新鮮香菇或干香菇或經(jīng)處理的香菇粉和/或塊；b、采用水或堿溶液提??；c、提取液濃縮，乙醇沉淀、沉淀用堿液溶解，過濾，濾液用酸中和，濃縮，得濃縮液；d、濃縮液經(jīng)乙醇沉淀，用丙酮和/或乙醇洗滌，干燥，得香菇多糖粗品；e、將香菇多糖粗品，堿液溶解，上DEAE-纖維素柱，用堿液洗脫，收集多糖反應(yīng)陽性部分，用酸中和，得洗脫液；f、洗脫液經(jīng)超濾或透析；g、超濾或透析液，經(jīng)DEAE-纖維素吸附、上柱、水洗、堿洗，中和，超濾，脫鹽。
h、取超濾中未透過液濃縮后凍干或采用丙酮或乙醇沉淀，沉淀干燥得香菇多糖。
其中，步驟b所述的水或堿溶液提取方法包括如下任一方法①熱水提取，過濾，得提取液；②香菇用熱水提取后，殘?jiān)訅A液浸提，堿液中和后與熱水合并得提取液；③香菇直接用堿液浸提，過濾，中和得提取液。
其中，所述步驟中堿液為碳酸鈉和/或碳酸氫鈉和/或氫氧化鈉和/或氫氧化鉀溶液。進(jìn)一步地，所述的堿液的濃度為0.1～1.0mol/L。
其中，步驟中所述的酸為鹽酸。
本發(fā)明還提供了該方法制備得到的香菇多糖。
本發(fā)明香菇多糖的分離純化方法簡(jiǎn)便易于生產(chǎn)，成本低，收率高。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取凈制的鮮香菇25kg，搗碎，加水煎煮2次，第一次6h，第二次3h，濾過，合并濾液。濾液濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，乙醇洗滌，沉淀用碳酸鈉液溶液解，濾過，濾液調(diào)pH為7.0，減壓濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，沉淀用丙酮洗滌，減壓干燥得香菇多糖粗品。
香菇多糖粗品用碳酸鈉溶液溶解，濾過，濾液經(jīng)DEAE-纖維素預(yù)柱預(yù)處理，中和。超濾，將濃縮液在減壓下濃縮，加入到DEAE-纖維素中讓其充分吸咐。然后上柱，水洗，最后用氫氧化鈉液洗脫，中和，用中空纖維膜超濾，未透過部份濃縮，丙酮沉淀，過濾，沉淀用丙酮洗滌后，于65℃減壓干燥。得香菇多糖2.4g，含量99.5％實(shí)施例2取凈制的干香菇3kg，搗碎，用0.25mol/l碳酸鈉液浸提三次，合并浸提液，中和，濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)70～75％，靜置，濾過，乙醇洗滌，沉淀用碳酸鈉溶液溶解，濾過，濾液調(diào)pH為7.0，減壓濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，沉淀用丙酮洗滌，減壓干燥得香菇多糖粗品。
香菇多糖粗品用碳酸氫鈉溶液溶解，濾過，濾液經(jīng)DEAE-纖維素預(yù)柱預(yù)處理，中和，超濾。將濃縮液在減壓下濃縮，加入到DEAE-纖維素中讓其充分吸咐。然后上柱，水洗，最后用0.5mol/L氫氧化鈉溶液洗脫，收集多糖反應(yīng)呈陽性部分，中和，用中空纖維膜超濾，未透過部份濃縮，丙酮沉淀，過濾，沉淀用丙酮洗滌后，于65℃減壓干燥。得香菇多糖2.9g，含量95.4％實(shí)施例3取凈制的鮮香菇25kg，搗碎，加水煎煮2次，第一次6h，第二次3h，濾過，合并濾液。殘?jiān)?.25mol/l碳酸鈉溶液浸提兩次，合并浸提液，中和后，與水提液合并，濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，乙醇洗滌，沉淀用碳酸鈉液溶液解，濾過，濾液調(diào)pH為7.0，減壓濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，沉淀用丙酮洗滌，減壓干燥得香菇多糖粗品。
香菇多糖粗品用碳酸氫鈉溶液溶解，濾過，濾液經(jīng)DEAE-纖維素預(yù)柱預(yù)處理，中和。將濃縮液在減壓下濃縮，加入到DEAE-纖維素中讓其充分吸咐。然后上柱，水洗，最后用0.5mol/L碳酸鈉液洗脫，中和，用中空纖維膜超濾，超濾，未透過部份濃縮，丙酮沉淀，過濾，沉淀用丙酮洗滌后，于65℃減壓干燥香菇多糖。得香菇多糖4.2g，含量94.3％本發(fā)明可采用新鮮香菇多糖，通常新鮮香菇的含水量約為88％，即10kg新鮮香菇相當(dāng)于干香菇1.2kg。因此，本發(fā)明香菇多糖的得率明顯高于對(duì)比文件CN1153179A。
以上產(chǎn)品經(jīng)剛果紅反應(yīng)，然后紫外測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在480～495nm處呈最大吸收峰。中和后再測(cè)紫外，其最大吸收位移至505～520nm，該反應(yīng)紫外吸收的二個(gè)范圍為β(1→3)葡聚糖所特有。香菇多糖屬β(1→3)葡聚糖，所以也應(yīng)有二個(gè)最大吸收值。完全酸水解產(chǎn)物經(jīng)TLC和HPLC檢查顯示為葡萄糖聚合物。
紅外光譜有3500～3300cm-1(糖環(huán)上OH之O-H伸縮振動(dòng))；2920～2800cm-1(糖環(huán)上C-H變角振動(dòng))；1100～1000cm-1(糖環(huán)上C-O伸縮振動(dòng))；890cm-1(β構(gòu)型的異頭碳特征吸收)等四個(gè)特征吸收峰。
香菇多糖的含量測(cè)定方法用高效液相層析獲得的香菇多糖峰及雜質(zhì)峰、由峰面積換算成濃度，即可求得香菇多糖的含量，或采用蒽酮比色法(對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)香菇多糖)測(cè)定含量。
權(quán)利要求
1.一種香菇多糖分離純化方法，它包括如下步驟a、取新鮮香菇或干香菇采用水或堿溶液提?。籦、提取液濃縮，乙醇沉淀、沉淀用0.1～1.0mol/L堿液溶解，過濾，濾液用酸中和，濃縮，得濃縮液；c、濃縮液再經(jīng)乙醇沉淀，丙酮和/或乙醇洗滌，干燥，得香菇多糖粗品；d、將香菇多糖粗品，用0.1～1.0mol/L堿液溶解，上DEAE-纖維素柱，用堿液洗脫，收集多糖反應(yīng)陽性部分，再用酸中和，得洗脫液；e、將d步驟的洗脫液進(jìn)一步純化，即得香菇多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分離純化方法，其特征在于e步驟所述的進(jìn)一步純化方法為將洗脫液經(jīng)超濾或透析，超濾液或透析液經(jīng)DEAE-纖維素吸附、上柱、水洗、堿液洗脫，合并糖反應(yīng)陽性部分，中和，再超濾；取超濾中未透過液，濃縮凍干，或采用丙酮或乙醇沉淀，沉淀干燥得香菇多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的香菇多糖分離純化方法，其特征在于步驟a所述的水或堿溶液提取方法包括如下任一方法①熱水提取，過濾，得提取液；②香菇用熱水提取后，殘?jiān)訅A液浸提，堿液中和后與熱水合并得提??；③香菇直接用堿液浸提，過濾，中和得提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的香菇多糖分離純化方法，其特征在于所述步驟中所述的堿液為碳酸鈉和/或碳酸氫鈉和/或氫氧化鈉和/或氫氧化鉀溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分離純化方法，其特征在于步驟中所述的酸為鹽酸。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的香菇多糖分離純化方法制備得到的香菇多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種香菇多糖的分離純化方法，它是將香菇多糖提取液，經(jīng)濃縮，醇沉，堿溶后再醇沉，沉淀用堿溶后經(jīng)預(yù)處理，脫鹽，經(jīng)DEAE－柱層析，超濾，未透過部分濃縮，經(jīng)凍干或丙酮等沉淀，得香菇多糖，本方法易于大生產(chǎn)，收率高，產(chǎn)品質(zhì)量好。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1978467SQ20051002223
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者吳四靈, 王小林 申請(qǐng)人:成都三康藥物研究所