專利名稱：一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由在高分子主鏈上形成羧酸酯鍵的反應(yīng)制得的高分子化合物，具體屬于一種羥基烷酸聚合體(以下簡稱PHA)的生產(chǎn)方法，更具體是3-羥基丁酸和3-羥基己酸聚合體[P(3-HB-co-3-HH)，以下簡稱P(HBHH)]的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
PHA是一類由生物合成的結(jié)構(gòu)簡單的高分子聚合物，是原核生物主要的碳源與能源貯藏物質(zhì)。原核生物在不平衡代謝條件下，便會(huì)利用剩余的營養(yǎng)物質(zhì)合成PHA并以顆粒的形式離散地分布在細(xì)胞中，其含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的90％，在生長需要時(shí)，再將其分解利用。正是由于這一生物學(xué)特性，賦予了這類物質(zhì)生物可再生性與生物可降解性。
研究表明，PHA有著與通用塑料，如聚丙烯，非常相似的理化性質(zhì)，通過塑性加工可以制作很多產(chǎn)品。正是由于它的這些物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，使其成為一類可以替代傳統(tǒng)石化塑料的“環(huán)境友好型”的新型生物熱塑材料。近年來發(fā)現(xiàn)，PHA具有良好的生物相容性、降解產(chǎn)物無毒性及表面可修飾性等性質(zhì)，這便極大地拓展了它的應(yīng)用范圍，使其在醫(yī)療與醫(yī)學(xué)組織工程方面有了廣闊的應(yīng)用前景。它不僅可以制作手術(shù)縫合線、創(chuàng)口覆膜及各種醫(yī)療器械等，還可以作為克隆器官的支架材料。美國Metabolix公司的Williams S.F等人于1998年就以PHA為框架在體外培養(yǎng)出了患者的自體血管。2000年，美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院又運(yùn)用PHA模型成功克隆了心臟瓣膜。近來還發(fā)現(xiàn)，分子量在10萬左右的納米級(jí)PHA是制作藥物緩釋劑的理想材料。
世界各國對(duì)于PHA的研究主要集中在開發(fā)生產(chǎn)菌株、構(gòu)建基因工程菌、探索代謝途徑及調(diào)控機(jī)理、創(chuàng)建生產(chǎn)方法與技術(shù)、測定產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與性能和拓寬應(yīng)用范圍等方面，并且已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。
至今已發(fā)現(xiàn)有90多個(gè)屬的原核生物可以在體內(nèi)積累PHA(Handbook ofBiodegradable Plastic，Research Association of Biodegradable Plastic，NTS Co.，Ltd.，pp.178-197)，然而用于PHA研究與生產(chǎn)的微生物菌種主要集中在產(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬等少數(shù)幾個(gè)屬的微生物。此外，通過基因工程手段還構(gòu)建了多株能夠合成PHA的基因工程菌。
大部分原核生物合成的PHA種類為PHB，但也有一些微生物能夠合成由其它單體組成的同型或異型PHA。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種不同的羥基烷酸單體。這些單體可以是飽和的或不飽和的羥基烷酸，可以是帶有芳香族側(cè)鏈的羥基烷酸，還可以是帶有鹵素或氰基取代基的羥基烷酸。羥基的取代位置可以分別在烷酸的2、3、4、5、6位碳原子上，但其中以3-羥基烷酸單體最為普遍。這些不同單體構(gòu)成的PHA，其物理學(xué)性能既有通性，也有特性。許多研究報(bào)道證實(shí)，PHA的單體碳鏈越長，其柔韌性就越好。一般來說，短鏈PHA(ssc-PHA)比中長鏈PHA(msc-PHA)更為堅(jiān)硬，而msc-PHA比ssc-PHA更為柔韌。在線形PHA鏈上增加一些特殊側(cè)鏈取代基常常會(huì)賦予PHA新的性質(zhì)與功能。此外，組成PHA的單體數(shù)目的多少，即PHA分子量的大小，也會(huì)在一定程度上影響PHA的性質(zhì)與用途。一般來說，PHA的分子量在50000～1000000Da之間，倘若其分子量低于20000，其熱塑性能便會(huì)受到很大的影響。
生物合成不同的PHA，與微生物種類、代謝途徑、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及調(diào)控方式等因素密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，采用真養(yǎng)嗜堿菌H16菌株[Alcaligenes eutropusH16(ATCC No.17699)]，不僅能夠生產(chǎn)PHB，而且應(yīng)用其突變株通過不同碳源可以合成各種比例的3-羥基丁酸(3-HB)和3-羥基戊酸(3-HV)聚合體[P(HBHV)](U.S.Pat.No.4,393,167和4,876,331)。在U.S.Pat.No.5,200,332專利中，建立了一種以甲養(yǎng)菌、副球菌、嗜堿菌和假單胞菌(Methylo-bacterium sp.Paracoccus sp.，Alcaligenes sp.和Pseudomonas sp.)為生產(chǎn)菌株，以乙醇為碳源合成P(HBHV)的方法。
在Appl.Environ.Microbiol，58(2)，746(1992)中報(bào)道了食樹脂假單胞菌(Pseudomonas resinovorans)可以利用辛酸作為底物合成HB、羥基己酸(HH)、羥基辛酸(HO)和羥基癸酸(HD)聚合體[P(HB-HH-HO-HD)]，其中單體HB、HH、HO、HD的比例為1∶15∶75∶9；而以癸酸為底物時(shí)合成P(HB-HH-HO-HD)的HB、HH、HO和HD的單體比例為8∶62∶23∶7。在U.S.Pat.No.5,292,860和Japanese PatentApplication Laid-Open No.7,265,065中由豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)以橄欖油和油酸作為碳源合成了P(HBHH)。張瑾、吳瓊、陳國強(qiáng)等人利用嗜水性氣單胞菌(Aeromonas hydrophila 4AK4)以豆油為碳源也合成了P(HBHH)(食品與生物技術(shù)，Val，21，76-79，2002)。歐陽少平、吳瓊、陳國強(qiáng)等人構(gòu)建了兩株嗜水性氣單胞菌(Aeromonas hydrophila WQ和Aeromonas hydrophila 4AK4)基因重組菌，以葡萄糖酸鈉和月桂酸為碳源合成了P(HBHH)，并進(jìn)行了6L發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗(yàn)(生物工程學(xué)報(bào)，Vol，19，709～714，2003)。
綜上所述，為了改善PHA的理化性能、加工性能和拓展其應(yīng)用范圍，在生產(chǎn)菌種的開發(fā)、改造及其生產(chǎn)方法等方面已經(jīng)開展了不少研究，并取得一定進(jìn)展。在與本發(fā)明相近似的羥基烷酸聚合體的研究方面，有關(guān)成果及其特點(diǎn)如下(1)開發(fā)出了由四種羥基烷酸單體組成的聚合體P(HB-HH-HO-HD)，由兩種羥基烷酸單體組成的二聚體P(HBHV)和P(HBHH)。(2)羥基烷酸聚合體的理化性質(zhì)，首先與組成聚合體的單體種類有關(guān)。比較P(HBHH)和P(HBHV)的性能，前者較后者脆性低而彈性強(qiáng)，具有良好的加工性能。其次，羥基烷酸聚合體的性質(zhì)與聚合體的單體比例有關(guān)。已報(bào)道的P(HBHH)二聚體，其中3-HH在該二聚體中的含量可控制在6％～15％之間。而在P(HB-HH-HO-HD)中單體種類較多，一般來說單體種類越多，在發(fā)酵生產(chǎn)中控制各種單體比例就越難，生產(chǎn)單體比例相對(duì)固定和理化性能相對(duì)穩(wěn)定的PHA產(chǎn)品就比較困難。(3)在相關(guān)的羥基烷酸聚合體研究中，采用的微生物菌株有假單胞菌、氣單胞菌及相關(guān)的基因重組菌。這些菌株共同的生理學(xué)特性是以脂類或脂肪酸作為唯一碳源合成3-羥基烷酸聚合體，其對(duì)碳水化合物類碳源的利用能力較差，特別是嗜水性氣單胞菌，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到1％，就會(huì)對(duì)菌體生長與PHA合成形成抑制作用。然而，對(duì)于絕大多數(shù)微生物來講，碳水化合物是其生長的最佳碳源，因此研究以碳水化合物為基質(zhì)，輔以代謝調(diào)控手段合成羥基烷酸聚合體，對(duì)于利用微生物開發(fā)羥基烷酸聚合體產(chǎn)品更具有代表性。此外，目前在食品與醫(yī)療產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中一般不采用基因重組菌作為生產(chǎn)菌株，以避免出現(xiàn)生物安全性問題。(4)在相關(guān)P(HBHH)的研究中，采用的主要原料分別為橄欖油和油酸、豆油和月桂酸、葡萄酸鈉和月桂酸等，均未報(bào)道下游提取與加工過程。一般來說，以油類作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)PHA會(huì)增加產(chǎn)品提取的難度，常常會(huì)影響PHA的質(zhì)量。而以葡萄酸鈉作為發(fā)酵原料，會(huì)因其價(jià)格較高，加大生產(chǎn)成本，影響其應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在以生產(chǎn)性狀優(yōu)良的菌株，利用較廉價(jià)的原料，發(fā)酵制得羥基烷酸聚合體，使其產(chǎn)品性能優(yōu)良且內(nèi)毒素含量符合要求，能作為醫(yī)療、醫(yī)學(xué)組織工程及其他領(lǐng)域的新型熱塑生物材料。
本發(fā)明提供的一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征是，采用費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii，以下簡稱S.fredii)菌種，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，生產(chǎn)羥基烷酸聚合體。S.fredii菌種由他人保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No.AB92049。
菌種S.fredii菌株的細(xì)胞形態(tài)為桿狀(見圖5)，0.5～0.9μm×1.2～3.0μm，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏陰性，能與豆科植物有效生瘤，共生固氮。
對(duì)于S.fredii菌株的研究與應(yīng)用，以前主要集中在共生固氮方面，其他生理學(xué)功能尚未受到重視而被開發(fā)利用。經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有底物范圍寬、生長速率快、生產(chǎn)性狀穩(wěn)定等優(yōu)良的發(fā)酵生產(chǎn)性狀，當(dāng)該菌株生長在葡萄糖等碳水化合物的培養(yǎng)基上時(shí)，在細(xì)胞生長的同時(shí)便合成一些PHA，到穩(wěn)定期隨著氮源物質(zhì)濃度的降低，會(huì)利用培養(yǎng)基中剩余的碳源物質(zhì)大量積累PHA。因此，該菌株合成PHA的發(fā)酵類型屬于部分生長關(guān)聯(lián)型。
顯然，該菌株的糖代謝是通過EMP途徑生成乙酰CoA。其中一部分乙酰CoA進(jìn)入TCA環(huán)產(chǎn)生能量與還原力，而另一部分乙酰CoA則由酮硫解酶催化兩分子乙酰輔酶合成乙酰乙酰輔酶，后者在乙酰乙酰輔酶還原酶的作用下形成3-羥基丁酰輔酶，聚合酶將3-羥基丁酰輔酶聚合成PHB。
然而，當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在葡萄糖和脂肪酸鹽時(shí)，會(huì)啟動(dòng)脂肪酸的β-氧化途徑。當(dāng)加入癸酸鹽時(shí)，會(huì)合成P(HBHH)；而加入辛酸鹽、己酸鹽和丁酸鹽及乙酸鹽時(shí)，均只合成PHB。一個(gè)共同的規(guī)律是聚合物中的羥基烷酸單體較基質(zhì)脂肪酸鏈少一個(gè)四碳結(jié)構(gòu)單位。雖然詳細(xì)的機(jī)理尚待深入研究，但該菌株顯然是經(jīng)β-氧化途徑，而非經(jīng)脂肪酸合成途徑獲得合成羥基烷酸聚合體前體的。在這一點(diǎn)上是有別于假單胞菌等菌株是經(jīng)脂肪酸合成途徑形成羥基烷酸聚合體的代謝方式。正是由于這一代謝特點(diǎn)，可以應(yīng)用該菌株，通過癸酸鹽底物水平的代謝調(diào)控穩(wěn)定地生產(chǎn)P(HBHH)產(chǎn)品。
培養(yǎng)基基于以前對(duì)S.fredii的研究主要集中在生物固氮方面，因此已有的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件均與固氮作用有關(guān)。為了開發(fā)該菌株合成PHA的功能，將其用作PHA的生產(chǎn)菌株，本發(fā)明應(yīng)用正交試驗(yàn)，分別以菌體生物量與PHA合成量為檢測指標(biāo)，對(duì)該菌株的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。依照方差分析的結(jié)果，制定出生產(chǎn)PHA產(chǎn)品適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。
培養(yǎng)基的組分及其含量(g/L)碳水化合物，10～40；(NH4)2SO4，1～5；KH2PO4·12H2O，0.61～1.22；K2HPO4，0.39～0.78；CaCl2，0～0.1；豆芽，100～300；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002。其中碳水化合物是葡萄糖、淀粉水解液或廢糖蜜，具體加入量以實(shí)際含糖量計(jì)算。豆芽，要制成豆芽汁，制法取豆芽加3倍重量的水熬煮，過濾，濾液濃縮至1/3。也可以用酵母膏代替豆芽汁。
優(yōu)選的各階段培養(yǎng)基的組分及其含量(g/L)如下(1)斜面培養(yǎng)基葡萄糖，10；(NH4)2SO4，1.0；KH2PO4·12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，100；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；瓊脂，20；pH7.0～7.2(用于斜面種子培養(yǎng))。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)基葡萄糖，10；(NH4)2SO4，1.5；KH2PO4·12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，100；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于搖瓶種子培養(yǎng))。
(3)發(fā)酵種子培養(yǎng)基葡萄糖，30；(NH4)2SO4，3.0；KH2PO4·12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，200；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于種子罐種子擴(kuò)大培養(yǎng))。
(4)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳水化合物(葡萄糖、淀粉水解液或廢糖蜜)，30；(NH4)2SO4，3.0；KH2PO4·12H2O，1.22；K2HPO4，0.78；CaCl2，0.1；豆芽，200；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。
淀粉水解液制備方法取淀粉20g，加水80ml，制成淀粉乳，調(diào)節(jié)pH6.5，加熱糊化后，加入20000U/ml的α-淀粉酶0.05ml，在95℃水浴中液化2h，再加入50000U/g的糖化酶0.02g，調(diào)pH至4.5，在60℃水浴條件下水解6h，過濾，將濾液減壓濃縮至30ml。用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量0.5g/ml。
廢糖蜜來自山西省大同糖廠，經(jīng)蒽酮法測定還原糖含量為27.5％。
生產(chǎn)步驟本發(fā)明中的P(HBHH)的生產(chǎn)過程可分為斜面及搖瓶種子培養(yǎng)、種子罐種子培養(yǎng)、細(xì)胞的高密度發(fā)酵與癸酸鹽代謝調(diào)控和產(chǎn)物P(HBHH)的分離純化四個(gè)操作單元。具體生產(chǎn)方法包括如下步驟(1)斜面及搖瓶種子培養(yǎng)斜面種子培養(yǎng)接種S.fredii保藏種子至斜面培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)兩次轉(zhuǎn)接活化，作為斜面種子，備用。
搖瓶種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)基裝入300mL的搖瓶中，裝量為100mL，以斜面種子接種一級(jí)搖瓶，在30℃，150r/min(偏心距為30mm)搖床條件下培養(yǎng)16h～18h，再以一級(jí)搖瓶種子液接種二級(jí)搖瓶，接種量為10％。當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期中期，細(xì)胞濃度約在1.79g干細(xì)胞/L～2.81g干細(xì)胞/L(OD600為3.5～5.5)之間，作為種子罐種子液備用。
(2)種子罐種子培養(yǎng)采用10L自控發(fā)酵罐為種子罐，使用發(fā)酵種子培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接入種子罐種子液，接種量8％～10％，溫度控制在30℃，pH值恒定在7.0～7.2，通氣量1∶1(v/v·min)，通過調(diào)節(jié)攪拌速度使溶氧飽和度維持在20％以上，當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期中期，細(xì)胞濃度約在10.2g干細(xì)胞/L～12.2g干細(xì)胞/L(即OD600為20～24)之間，作為發(fā)酵罐的種子液。
在種子罐種子培養(yǎng)過程中，檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞及主要營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，鏡檢細(xì)胞形態(tài)，通過控制培養(yǎng)時(shí)間把握種子液的質(zhì)量。要求種子液的細(xì)胞濃度適當(dāng)，糖、氮、磷等營養(yǎng)成分在初始量的30％以上，細(xì)胞形態(tài)整齊均一，且PHA顆粒較少，確保種子液既處在對(duì)數(shù)生長期，又具有較高的細(xì)胞濃度。
(3)細(xì)胞的高密度發(fā)酵與癸酸鹽代謝調(diào)控細(xì)胞的高密度發(fā)酵采用100L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接種量8％-10％，溫度控制在30℃，pH值恒定在7.0，通氣量1∶1(v/v·min)，通過調(diào)節(jié)攪拌速度使溶氧飽和度維持在10％以上。
在發(fā)酵培養(yǎng)過程，每隔4小時(shí)取樣測定細(xì)胞濃度、糖濃度、銨離子濃度和磷酸根離子濃度。當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，根據(jù)發(fā)酵液中細(xì)胞、糖、銨離子和磷酸根離子濃度的變化情況，通過適時(shí)補(bǔ)加碳水化合物和硫酸銨等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)將溫度、pH值、溶氧等控制至最適條件下，促使菌體迅速生長至高密度狀態(tài)。
癸酸鹽代謝調(diào)控當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到30.6g干細(xì)胞/L(即OD600為60)以上時(shí)，控制發(fā)酵液中糖含量保持在初始量的30％以上，同時(shí)限制氮含量在初始量的10％～30％之間。采用癸酸鹽二步加入法進(jìn)行癸酸鹽的代謝調(diào)控。第一步，加入4mmol/L～6mmol/L的癸酸鹽作為基礎(chǔ)鹽，形成一定的脅迫壓，啟動(dòng)β-氧化途徑。第二步，以一定速度流加癸酸鹽溶液，使體系中癸酸鹽的總加量達(dá)到8mmol/L～12mmol/L。加入癸酸鹽后控制發(fā)酵液中硫酸銨含量在0.5g/L左右，同時(shí)補(bǔ)加糖液使其濃度保持在10g/L左右，調(diào)節(jié)pH值在7.0，促進(jìn)P(HBHH)合成。調(diào)控5～6.5h后，當(dāng)P(HBHH)在細(xì)胞中達(dá)到一定含量且HH單體在P(HBHH)中的比例處在預(yù)期范圍內(nèi)，即可放罐，采收細(xì)胞。
(4)P(HBHH)的分離純化我們采取溶劑萃取工藝路線進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化，基本操作單元依次為發(fā)酵液的液固分離、濕細(xì)胞干燥、細(xì)胞與萃取劑混合、萃取液分離、萃取液濃縮、乙醇沉淀、分離與干燥、P(HBHH)產(chǎn)品。
通過正交實(shí)驗(yàn)，以P(HBHH)的收率及純度為檢測指標(biāo)，對(duì)萃取劑的種類、用量、萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取方式進(jìn)行了選擇試驗(yàn)，確定了氯仿為最佳萃取劑，并且優(yōu)化了萃取條件和萃取方式。同時(shí)對(duì)細(xì)胞與萃取液的液固分離進(jìn)行了離心與過濾、萃取液濃縮倍數(shù)、沉淀劑乙醇的加量等操作條件也進(jìn)行了研究與優(yōu)化，建立了一整套分離與純化P(HBHH)的方法，具體操作方法如下在發(fā)酵結(jié)束后，首先經(jīng)管式離心機(jī)，在離心因素為15700×g的條件下，控制流速，進(jìn)行連續(xù)液固分離，收集濕菌體，再經(jīng)二次水洗并離心細(xì)胞，80℃下烘干，得干細(xì)胞。干細(xì)胞用氯仿在30℃～60℃下振蕩萃取2h～4h，抽濾，收集萃取液，常壓濃縮；加入冷乙醇沉淀，得P(HBHH)粗品，再經(jīng)2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，得P(HBHH)純品。
(5)檢測方法①細(xì)胞干重為加快發(fā)酵過程中細(xì)胞濃度的測定速度，基于培養(yǎng)液中無顆粒性的營養(yǎng)物質(zhì)，我們采用分光光度法，在600nm波長處測定細(xì)胞懸液的吸光值，然后再根據(jù)吸光值與細(xì)胞干重曲線折算成細(xì)胞濃度。
②還原糖測定3，5-二硝基水楊酸法，蒽酮法。
③銨離子測定改良靛酚藍(lán)比色法。
④無機(jī)磷的測定鉬酸銨比色法。
⑤PHA含量測定稱取15mg干細(xì)胞或5mgPHA產(chǎn)品，加入1ml含15％硫酸的甲醇溶液中溶解，再加入1ml氯仿-苯甲酸溶液(苯甲酸作為內(nèi)標(biāo))于100℃水浴保溫140min進(jìn)行酯化反應(yīng)，然后將反應(yīng)液冷卻后加入1ml無離子水振蕩混勻，3500×g離心15min，收集有機(jī)相，加入無水Na2SO4脫水后，用氣相色譜分析。
⑥PHA結(jié)構(gòu)的測定經(jīng)氯仿法提取并精制得PHA純品，應(yīng)用75MHz-核磁共振儀測定13C NMR圖譜，根據(jù)圖譜結(jié)果分析確定PHA結(jié)構(gòu)。
⑦分子量的測定烏氏粘度計(jì)法。
⑧內(nèi)毒素的測定鱟試劑盒法。
優(yōu)點(diǎn)與效果本發(fā)明采用性狀優(yōu)良的費(fèi)氏中華根瘤菌為生產(chǎn)菌株，應(yīng)用廉價(jià)而來源廣泛的生產(chǎn)原料，使用特有的發(fā)酵與調(diào)控方式，獲得了一種PHA產(chǎn)品，經(jīng)75MHz-核磁共振儀測定和圖譜分析，確定其結(jié)構(gòu)為3-羥基丁酸和3-羥基己酸聚合體[P(3-HB-co-3-HH)](見附圖1)，創(chuàng)建了從菌種、上游發(fā)酵到下游提取的整套P(HBHH)生產(chǎn)新工藝。通過這一工藝生產(chǎn)的P(HBHH)產(chǎn)品，其分子量適中、內(nèi)毒素含量低，性能優(yōu)良，用途廣泛，尤其可用作為生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)組織工程的新型納米級(jí)脂質(zhì)材料。
我們選用S.fredii作為P(HBHH)的生產(chǎn)菌株。該菌株具有底物范圍寬、生長速率快、生產(chǎn)性狀穩(wěn)定、不產(chǎn)生色素等優(yōu)良生產(chǎn)性狀，容易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵生產(chǎn)，且經(jīng)過脂肪酸鹽底物水平的調(diào)控能夠合成羥基烷酸聚合體。S.fredii是革蘭氏陰性菌，利于進(jìn)行P(HBHH)的分離與純化。此外，該菌種是自然界的固氮菌，即使在生產(chǎn)過程中不慎流入環(huán)境中也不存在生物安全性的問題。
在本發(fā)明中，我們詳細(xì)研究了應(yīng)用S.fredii菌株生產(chǎn)P(HBHH)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，葡萄糖、淀粉水解液、廢糖蜜均可作為碳源，硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等均可作為氮源，酵母膏或豆芽汁均可作為其生長因子，因此主要生產(chǎn)原料價(jià)格低廉且來源豐富。如采用最廉價(jià)的原料進(jìn)行生產(chǎn)，原料成本可降低1/2～3/4。此外，由于該菌株生長速率快，溫度、溶氧等培養(yǎng)條件適中，發(fā)酵管理費(fèi)用較低，這些都有利于降低P(HBHH)的成本。
在本發(fā)明中，依據(jù)S.fredii菌株的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)和部分生長關(guān)聯(lián)型合成P(HBHH)的發(fā)酵類型，建立了細(xì)胞的高密度發(fā)酵和癸酸鹽代謝調(diào)控的發(fā)酵管理新工藝。在發(fā)酵的第一階段，發(fā)酵管理的重點(diǎn)放在滿足細(xì)胞生長需要的方面，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式使菌體細(xì)胞快速生長到高密度水平，使發(fā)酵液中細(xì)胞濃度達(dá)到30.6g干細(xì)胞/L以上。在第二階段，發(fā)酵管理的重點(diǎn)放在調(diào)節(jié)P(HBHH)產(chǎn)物的合成方面。在第二階段經(jīng)二步法加入癸酸鹽，調(diào)節(jié)合成了P(HBHH)羥基烷酸聚合體，其產(chǎn)量達(dá)到10.7g/L～16.4g/L。
癸酸鹽二步加入法，不僅滿足了羥基烷酸聚合體合成的調(diào)控需要，而且消除了因一次性加入癸酸鹽產(chǎn)生泡沫過多的現(xiàn)象，并克服了癸酸鹽濃度過高抑制細(xì)胞合成P(HBHH)活性的弊病，提高了癸酸鹽的利用率，維持了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)，確保了P(HBHH)較高的發(fā)酵生產(chǎn)率。
本發(fā)明以萃取工藝路線為基礎(chǔ)建立了一套P(HBHH)的分離純化方法，此方法具有工藝簡單，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。通過此法獲得的P(HBHH)產(chǎn)品，收率達(dá)到95％以上，純度達(dá)到98％以上。此法不會(huì)降低產(chǎn)品的分子量和影響P(HBHH)的性質(zhì)。此外，應(yīng)用這一分離純化方法，可降低P(HBHH)產(chǎn)品中內(nèi)毒素的含量，可將其內(nèi)毒素的含量控制在4～6EU/g之間，低于美國FDA規(guī)定的最低20EU/g的標(biāo)準(zhǔn)。
由本發(fā)明獲得的P(HBHH)羥基烷酸二聚體產(chǎn)品，雖然產(chǎn)品P(HBHH))有相關(guān)的專利與文獻(xiàn)報(bào)道，但生產(chǎn)菌種與工藝均不相同。我們生產(chǎn)的P(HBHH)，其分子量在13.7×104Da左右，可作為納米級(jí)脂質(zhì)材料，可用在醫(yī)療與醫(yī)學(xué)組織工程等領(lǐng)域。
本發(fā)明中在搖瓶調(diào)控實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了多次100L發(fā)酵罐的擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn)和小型生產(chǎn)規(guī)模的分離純化試驗(yàn)，已取得擴(kuò)大生產(chǎn)的相關(guān)技術(shù)參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1P(HBHH)的75MHz-13C NMR圖譜。
圖2以葡萄糖為碳源合成的P(HBHH)的氣相色譜圖。
圖3以淀粉水解液為碳源合成的P(HBHH)的氣相色譜圖。
圖4以廢糖蜜為碳源合成的P(HBHH)的氣相色譜圖。
圖2、3、4中1為甲醇特征峰，2為氯仿特征峰，3為3-HB單體，4為3-HH單體峰，5為內(nèi)標(biāo)峰。
圖5費(fèi)氏中華根瘤菌細(xì)胞形態(tài)圖，圖中細(xì)胞內(nèi)染色較深的為PHA顆粒。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中培養(yǎng)基的組分含量同說明書，所用的發(fā)酵設(shè)備為鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司生產(chǎn)的10L、100L自控發(fā)酵罐配套設(shè)備。
實(shí)施例1、以葡萄糖作為碳源合成P(HBHH)的發(fā)酵生產(chǎn)(1)斜面及搖瓶種子培養(yǎng)將保藏的S.fredii菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于30℃的培養(yǎng)箱中活化兩次，轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的搖瓶中再活化兩次，待后一級(jí)搖瓶培養(yǎng)16h，當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1.79g干細(xì)胞/L(OD600值為3.5)時(shí)，細(xì)胞生長仍處于對(duì)數(shù)生長期，作為種子罐的種子液備用。
(2)種子罐種子培養(yǎng)以10L自控罐為種子罐，采用發(fā)酵種子培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接入種子液，接種量為8％，培養(yǎng)30℃，通過6mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)控制pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度20％以上，經(jīng)過20小時(shí)的種子培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到10.2g干細(xì)胞/L(即OD600為20)，作為100L發(fā)酵罐的種子液。
(3)細(xì)胞的高密度發(fā)酵及癸酸鹽代謝調(diào)控采用100L自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接種量8％。在發(fā)酵過程中，控制溫度在30℃，pH值恒定在7.0，通氣量1∶1(v/v·min)，維持溶氧飽和度在10％以上。每隔4小時(shí)取樣測定葡萄糖濃度、銨離子濃度、磷酸根離子濃度和細(xì)胞濃度。在發(fā)酵過程中通過適時(shí)補(bǔ)加葡萄糖和硫酸銨等，使其在發(fā)酵液中的濃度分別維持在10g/L和1g/L以上，滿足菌體的生長需求，延長其對(duì)數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到40.29g干細(xì)胞/L(即OD600為79)時(shí)，采用癸酸鹽二步加入法進(jìn)行癸酸鹽代謝調(diào)控。第一步，加入一定量的0.5mol/L癸酸鹽溶液作為基礎(chǔ)鹽，使其加量達(dá)到4mmol/L，形成脅迫壓，啟動(dòng)β-氧化途徑。第二步，以一定速度流加癸酸鹽溶液，使體系中癸酸鹽的總加量達(dá)到8mmol/L。加鹽后維持發(fā)酵液中硫酸銨含量在0.5g/L左右，同時(shí)補(bǔ)加葡萄糖并保持濃度在10g/L左右，保持pH值在7.0，促進(jìn)P(HBHH)的積累，繼續(xù)培養(yǎng)5.5h后，放罐。
(4)P(HBHH)的分離純化采用管式離心機(jī)，在離心因素為15700×g的條件下，控制流速，進(jìn)行連續(xù)液固分離，收集濕菌體，水洗并離心兩次，將菌體在80℃烘干。干細(xì)胞加入10倍體積(v/w)萃取劑氯仿，充分混勻，在50℃下攪拌4小時(shí)，抽濾，收集萃取液。將萃取液在78℃水浴下，蒸餾濃縮至原體積的1/5，得濃縮萃取液，并回收氯仿，然后將濃縮萃取液加入5倍體積的冷乙醇，并緩慢攪拌沉淀，過濾，棄濾液，收集P(HBHH)沉淀，得P(HBHH)粗品，再經(jīng)2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，室溫下干燥得P(HBHH)純品。
(5)通過GC氣相色譜層析測定干細(xì)胞中P(HBHH)含量及產(chǎn)品純度，P(HBHH)含量15g/L，(其中HB占87.9％，HH占13.1％，見圖2)。
(6)粘度法測定產(chǎn)品分子量，分子量為12.7×104Da。
(7)鱟試劑盒法測定產(chǎn)品P(HBHH)內(nèi)毒素含量，內(nèi)毒素含量4.0EU/g。
實(shí)例2、以淀粉水解液作為碳源合成P(HBHH)的發(fā)酵生產(chǎn)(1)斜面及搖瓶種子培養(yǎng)將保藏的S.fredii菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于28℃的培養(yǎng)箱中活化兩次，轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的搖瓶中再活化兩次，待后一級(jí)搖瓶培養(yǎng)18h，當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到2.81g干細(xì)胞/L(OD600值為5.5)時(shí)，細(xì)胞生長仍處于對(duì)數(shù)生長期，作為種子罐的種子液備用。
(2)種子罐種子培養(yǎng)以10L自控罐為種子罐，采用發(fā)酵種子培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接入種子液，接種量為9％，培養(yǎng)30℃，通過6mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)控制pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度20％以上，經(jīng)過19小時(shí)的種子培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到12.3g干細(xì)胞/L(即OD600為24)，作為100L發(fā)酵罐的種子液。
(3)發(fā)酵管理及代謝調(diào)控采用100L自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作，裝料系數(shù)0.7，接種量10％。在發(fā)酵過程中，控制溫度在30℃，pH值恒定在7.0，通氣量1∶1(v/v·min)，維持溶氧飽和度在10％以上。在發(fā)酵過程中通過適時(shí)補(bǔ)加淀粉水解濃縮液和硫酸銨等營養(yǎng)物質(zhì)，使發(fā)酵液中的糖濃度和硫酸銨維持在10g/L和1g/L以上，滿足菌體的生長需求，延長其對(duì)數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到46.92g干細(xì)胞/L(即OD600為92)時(shí)，采用癸酸鹽二步加入法進(jìn)行癸酸鹽代謝調(diào)控。第一步，加入一定量的0.5mol/L癸酸鹽溶液作為基礎(chǔ)鹽，使加量達(dá)到5mmol/L，形成脅迫壓，啟動(dòng)β-氧化途徑。第二步，以一定速度流加癸酸鹽溶液，使體系中癸酸鹽的總加量達(dá)到10mmol/L。加鹽后維持發(fā)酵液中硫酸銨含量在0.5g/L左右，同時(shí)補(bǔ)加淀粉水解濃縮液使糖濃度保持在10g/L左右，保持pH值在7.0，促進(jìn)P(HBHH)的積累，繼續(xù)培養(yǎng)6h。
在此過程中，關(guān)鍵在于控制糖濃度，在放罐前4小時(shí)內(nèi)不再補(bǔ)加廢糖蜜，以免放罐增加提取難度，影響產(chǎn)品質(zhì)量。
(4)P(HBHH)的分離純化干細(xì)胞加入8倍體積(v/w)萃取劑氯仿在30℃下攪拌4小時(shí)，步驟同于實(shí)例1。
本實(shí)施例中得到的P(HBHH)含量為含量16.4g/L，(其中HB占75.1％，HH占24.9％，見圖3)，分子量為13.5×104Da，內(nèi)毒素含量5.6EU/g。
實(shí)施例3、以廢糖蜜作為碳源合成P(HBHH)的發(fā)酵生產(chǎn)(1)斜面及搖瓶培養(yǎng)將保藏的S.fredii菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于32℃的培養(yǎng)箱中活化兩次，轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的搖瓶中再活化兩次，待后一級(jí)搖瓶培養(yǎng)18h，當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到2.6g干細(xì)胞/L(OD600值為5.2)時(shí)，細(xì)胞生長仍處于對(duì)數(shù)生長期，作為種子罐的種子液備用。
(2)種子罐種子培養(yǎng)以10L自控罐為種子罐，采用發(fā)酵種子培養(yǎng)基，裝料系數(shù)0.7，接入種子液，接種量為10％，培養(yǎng)30℃，通過6mol的NaOH溶液調(diào)節(jié)控制pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度20％以上，經(jīng)過20小時(shí)的種子培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到11.1g干細(xì)胞/L(即OD600為22)，作為100L發(fā)酵罐的種子液。
(3)發(fā)酵管理及代謝調(diào)控采用100L自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作，裝料系數(shù)0.7，接種量10％。在發(fā)酵過程中，控制溫度在30℃，pH值恒定在7.0，通氣量1∶1，維持溶氧飽和度在20％以上。在發(fā)酵過程中通過及時(shí)補(bǔ)加廢糖蜜、硫酸銨及磷鹽，使發(fā)酵液中的糖和硫酸銨等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度分別維持在10g/L和1g/L以上，滿足菌體的生長需求，延長其對(duì)數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到30g干細(xì)胞/L(即OD600為60)時(shí)，采用癸酸鹽二步加入法進(jìn)行癸酸鹽代謝調(diào)控。第一步，加入一定量的0.5mol/L癸酸鹽溶液作為基礎(chǔ)鹽，使其加量達(dá)到6mmol/L，形成脅迫壓，啟動(dòng)β-氧化途徑。第二步，以一定速度流加癸酸鹽溶液，使體系中癸酸鹽的總加量達(dá)到12mmol/L。加鹽后維持發(fā)酵液中硫酸銨含量在0.5g/L左右，同時(shí)補(bǔ)加廢糖蜜使糖濃度保持在10g/L左右，保持pH值在7.0，促進(jìn)P(HBHH)的積累，繼續(xù)培養(yǎng)5.5h。
(4)P(HBHH)的分離純化干細(xì)胞加入10倍體積(v/w)萃取劑氯仿在60℃下攪拌2小時(shí)，其它步驟同于實(shí)例1。
本實(shí)施例中得到的P(HBHH)含量為10.7g/L，(其中HB占72.3％，HH占27.7％，見圖4)，分子量為13.7×104Da，內(nèi)毒素含量6.0EU。
權(quán)利要求
1.一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征是，采用保藏號(hào)為CCTCC No.AB92049的費(fèi)氏中華根瘤菌生產(chǎn)羥基烷酸聚合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的羥基烷酸聚合體為3-羥基丁酸和3-羥基己酸聚合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟(1)斜面及搖瓶種子的培養(yǎng)將菌種接種在培養(yǎng)基上，于28℃～30℃條件下活化，當(dāng)菌體細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期的中期時(shí)，作為種子罐的種子液；(2)種子罐種子的培養(yǎng)將上述種子液接入種子罐中，培養(yǎng)基裝料系數(shù)為0.7，接種量為8％～10％，控制溫度28℃～32℃，pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度20％以上，當(dāng)菌體細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期的中期時(shí)，作為發(fā)酵罐種子液；(3)細(xì)胞的高密度發(fā)酵及癸酸鹽代謝調(diào)控將發(fā)酵罐種子液接入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基裝料系數(shù)0.7，接種量為8％～10％，28℃～32℃培養(yǎng)，控制pH7.0，保持溶氧飽和度10％以上，進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵；當(dāng)發(fā)酵液中菌體濃度達(dá)到30.6g干細(xì)胞/L以上時(shí)，先加入4mmol/L～6mmol/L的癸酸鹽作為基礎(chǔ)鹽，然后流加癸酸鹽溶液，使癸酸鹽的總加量達(dá)到8mmol/L～12mmol/L，同時(shí)進(jìn)行限氮補(bǔ)糖培養(yǎng)5～6.5h，放罐；(4)產(chǎn)品的分離純化采用管式離心機(jī)，進(jìn)行連續(xù)液固分離，收集濕菌體，水洗，離心，烘干；干細(xì)胞用氯仿在30℃～60℃振蕩萃取2h～4h，抽濾，收集萃取液，常壓濃縮；加入冷乙醇沉淀，得粗品，再經(jīng)2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，得純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組分及其含量(g/L)碳水化合物，10～40；(NH4)2SO4，1～5；KH2PO4.12H2O，0.61～1.22；K2HPO4，0.39～0.78；CaCl2，0～0.1；豆芽，100～300；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的碳水化合物是葡萄糖、淀粉水解液或廢糖蜜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羥基烷酸聚合體的生產(chǎn)方法，其特征是選用費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)作為生產(chǎn)菌株，以碳水化合物為碳源，以銨鹽為氮源，在最適培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下，通過高密度發(fā)酵和癸酸鹽代謝調(diào)控，獲得了3－羥基丁酸和3－羥基己酸聚合體[P(3－HB－co－3－HH)]產(chǎn)品，并建立了該產(chǎn)品的發(fā)酵管理方法、分離純化方法及質(zhì)量檢測方法。這一方法生產(chǎn)的[P(3－HB－co－3－HH)]產(chǎn)品，其產(chǎn)量達(dá)到10.7g/L～16.4g/L，其分子量在12.7×10
文檔編號(hào)C08G63/06GK1648150SQ20041009244
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者趙良啟, 王海賓, 馮濤, 肖婧凡 申請人:山西大學(xué)