專(zhuān)利名稱(chēng)：一種靈芝多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝多糖的制備方法，尤其涉及一種靈芝大分子多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
從靈芝中分離提取水溶性多糖目前普遍采用乙醇分步沉淀法，易于大規(guī)模生產(chǎn)，其主要原理是通過(guò)降低水溶液的介電常數(shù)使多糖脫水，從而產(chǎn)生沉淀來(lái)達(dá)到分離多糖的目的，適用于大多數(shù)水溶性多糖，但得到的多糖雜質(zhì)多，有效成分含量低，特異性不高。如進(jìn)一步采用不同濃度的乙醇分步沉淀來(lái)純化，選擇性較差，回收率低，得到多糖含量在30％左右，且是多糖的混合物，同時(shí)要使用大量的有機(jī)溶劑，提高了成本。另外，也有一些實(shí)驗(yàn)室的研究，水提物通過(guò)去除蛋白和透析后得到靈芝多糖，但工藝復(fù)雜，需要加入氯仿和正丁醇等有機(jī)溶劑，不易成為工業(yè)化生產(chǎn)。
靈芝大分子多糖成分的免疫調(diào)節(jié)的作用已有大量的研究報(bào)道，并可通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能而達(dá)到抗癌作用，是抗癌作用的有效成分。但往往一種植物或真菌中含有多種多糖成分，分子量的大小也各不相同，其活性也各不相同，靈芝中也含有不同的分子量段的多糖成分，為提高多糖的效果，須將無(wú)活性或活性不高的成分去除，富集有活性的多糖部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種靈芝大分子多糖的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中提取的多糖純度低、特異性不高、難以工業(yè)化生產(chǎn)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的原理是將靈芝提取物中有活性的多糖部分用合適的超濾膜來(lái)富集的原理，去除沒(méi)有活性的多糖成分。
本發(fā)明的提供的一種靈芝大分子多糖的制備方法，包括如下步驟
1.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常溫浸泡10-60分鐘，加熱至60-100℃，保持此溫度60-120分鐘，過(guò)濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取1-2次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過(guò)濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬(wàn)道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬(wàn)分子量的部分和小于50萬(wàn)分子量的部分。
4.干燥大于50萬(wàn)分子量的部分直接干燥，即獲得所需的大分子多糖。
通過(guò)上述制備方法可獲得質(zhì)量穩(wěn)定、有效成份含量高、且平均分子量被嚴(yán)格控制在大于50萬(wàn)道爾頓的靈芝多糖成分，本方法不僅保持了多糖的抗腫瘤活性，而且靈芝多糖的含量得到提高，多糖含量超過(guò)50％。所以本制備方法是一種簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低、無(wú)污染、多糖純度高的適合工業(yè)生產(chǎn)的方法。
制備所得的大分子靈芝多糖的生物活性檢測(cè)根據(jù)Stanley報(bào)道的方法，選擇8～10周齡、體重(28±1)g的Balb/c小鼠，處死，抽取小鼠大腿、小腿骨中的骨髓，分散后培養(yǎng)于含10％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清(L929細(xì)胞株培養(yǎng)3d后，去除細(xì)胞的培養(yǎng)基)的完全DMEM培養(yǎng)基中。3d后，去除貼壁的細(xì)胞，將非貼壁細(xì)胞置于添加10％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清的完全DMEM培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)3d后，去除非貼壁的細(xì)胞，收集貼壁的細(xì)胞，即為小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞。小鼠巨噬細(xì)胞激活率測(cè)定將1×105個(gè)/mL的巨噬細(xì)胞懸浮液加至96孔板中，每孔加入180μL，并加入樣品20μL。于37℃、5％的CO2條件下培養(yǎng)3天，加入20μL AlamarBlue試劑，再培養(yǎng)6hr，用ELISA自動(dòng)讀板儀測(cè)定570nm和600nm處的吸光度，然后根據(jù)Alamar Blue試劑的公式計(jì)算各種樣品對(duì)巨噬細(xì)胞的激活率。計(jì)算公式為巨噬細(xì)胞激活率(％)＝[80856×Aλ570(樣品)-11726×Aλ600(樣品)]/[80856×Aλ570(對(duì)照)-11726×Aλ600(對(duì)照)]×100％。
分子量大于50萬(wàn)部分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率大于200％，可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。
多糖含量的檢測(cè)用苯酚-濃硫酸法，精密稱(chēng)取本品0.5g置100ml燒杯中，加水約80ml，煮沸提取1小時(shí)后冷卻至室溫，加入100ml容量瓶中。用水稀釋至刻度，搖勻，再稀釋25倍。精密吸取樣品1.0ml，置15ml試管中，分別加入苯酚-硫酸試劑，在490nm處測(cè)定吸收度A。以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算總糖的含量，并用DNS測(cè)定還原糖含量，多糖的含量等于總糖減還原糖。分子量大于50萬(wàn)部分的多糖含量大于50％以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5倍重量的水中，常溫浸泡60分鐘，加熱至60℃，保持此溫度60分鐘，過(guò)濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取一次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用100目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過(guò)濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬(wàn)道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬(wàn)分子量的部分和小于50萬(wàn)分子量的部分。
4.干燥大于50萬(wàn)分子量的部分噴霧干燥，即獲得所需的多糖。
制備的多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率為320％。多糖含量為55％。
實(shí)施例21.靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入10倍重量的水中，常溫浸泡30分鐘，加熱至70℃，保持此溫度60分鐘，過(guò)濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取一次，合并濾液。
2.靈芝粗提液的粗濾濾液用200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過(guò)濾。
3.靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬(wàn)道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬(wàn)分子量的部分和小于50萬(wàn)分子量的部分。
4.干燥大于50萬(wàn)分子量的部分直接冷凍干燥，即獲得所需多糖。
制備的多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞激活率為290％。多糖含量為53％。
權(quán)利要求
1.一種靈芝多糖的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟①靈芝的粗提以靈芝子實(shí)體為原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常溫浸泡10-60分鐘，加熱至60-100℃，保持此溫度60-120分鐘，過(guò)濾。濾渣重復(fù)上述步驟，再提取1-2次，合并濾液。②靈芝粗提液的粗濾濾液用50-200目的濾網(wǎng)粗濾，再用100微米的膜過(guò)濾。③靈芝濾出液超濾使用超濾膜進(jìn)行超濾，超濾膜的分子量截留值為50萬(wàn)道爾頓，壓力低于0.3Mpa，濾液被分為二部分，大于50萬(wàn)分子量的部分和小于50萬(wàn)分子量的部分。④干燥大于50萬(wàn)分子量的部分直接干燥，即獲得所需的大分子多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種靈芝大分子多糖的制備方法，該方法包括對(duì)靈芝進(jìn)行粗提、粗濾、超濾和干燥四個(gè)步驟，該制備方法可以得到分子量大于50萬(wàn)的靈芝大分子多糖，多糖含量超過(guò)50％，而且抗腫瘤活性和免疫增強(qiáng)活性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1618819SQ20041006730
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者唐慶九, 張勁松, 楊焱, 賈薇, 劉艷芳, 唐傳紅 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院