專(zhuān)利名稱(chēng)：聚酰胺－胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料,其合成方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料學(xué)領(lǐng)域，涉及一種納米材料及其制備和應(yīng)用，進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及一種聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，其合成方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療(gene therapy)的興起及其發(fā)展為人類(lèi)的多種疾病帶來(lái)了更為有效的治療手段，尤其是對(duì)于各種惡性腫瘤、單基因遺傳性疾病、以及多種難治性、致死性疾病。然而，基因治療的臨床應(yīng)用仍有許多障礙還有待克服。其中，載體問(wèn)題，以及與載體相關(guān)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞毒性與安全性等問(wèn)題是基因治療研究領(lǐng)域亟待解決的最關(guān)鍵的問(wèn)題之一。介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的載體一般分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體由于存在誘發(fā)人體腫瘤和免疫排斥等缺陷，而傳統(tǒng)的非病毒載體，雖然安全，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率極低，難以獲得有意義的基因表達(dá)。
與病毒載體以及傳統(tǒng)的非病毒載體相比，聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方面有以下方面的明顯優(yōu)勢(shì)(1)由于納米材料是小分子非生物材料，沒(méi)有免疫原性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)；(2)與病毒載體不同，納米材料無(wú)遺傳毒性與細(xì)胞毒性，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與細(xì)胞死亡；(3)由于其特殊的表面星狀，或樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)及表面電荷，具有很高的基因轉(zhuǎn)移效率；(4)納米材料可介導(dǎo)外源基因在宿主細(xì)胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)；(5)納米材料可保護(hù)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因不受機(jī)體血漿，或組織細(xì)胞中各種補(bǔ)體以及各種酶的破壞，從而有利于目的基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，能更好、更穩(wěn)定地發(fā)揮其作用。造血干細(xì)胞被公認(rèn)為是基因治療最理想的靶細(xì)胞之一，有資料顯示，基因治療臨床方案近三分之一涉及到造血干細(xì)胞，充分顯示了造血干細(xì)胞作為基因治療靶細(xì)胞的魅力。因此，本發(fā)明所合成的納米材料可有效的將目的基因轉(zhuǎn)入造血干細(xì)胞，這將極大地推動(dòng)基因治療的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，由于現(xiàn)有技術(shù)中，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的載體一般分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體由于存在誘發(fā)人體腫瘤和免疫排斥等缺陷，而傳統(tǒng)的非病毒載體，雖然安全，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率極低，難以獲得有意義的基因表達(dá)，本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是提供一種聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，它是一類(lèi)高度枝化的球型結(jié)構(gòu)的單分散納米顆粒，分子大小為50-90納米。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料的分子大小為70-80納米。
本發(fā)明所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料的分子表面有極高的陽(yáng)性官能團(tuán)密度，內(nèi)部有空腔。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供一種聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料的合成方法，包括以丙烯酸甲酯和乙二胺為起始單體，通過(guò)合成5代(G5)的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子(PAMAM dendrimer)，然后采用透析方法對(duì)所得的5代的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子進(jìn)行純化，獲得高度枝化的球型結(jié)構(gòu)的單分散納米顆粒，即為所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供上述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料在造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染上的應(yīng)用。可將本發(fā)明的納米顆粒以一定濃度與一定比例的質(zhì)粒DNA混合，將該目的基因轉(zhuǎn)染到經(jīng)CD34免疫磁珠純化后的造血干細(xì)胞內(nèi)，目的基因所合成的蛋白在造血干細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的納米顆粒的濃度為5mg/ml。
本發(fā)明所述的納米顆粒與質(zhì)粒DNA混合的比例可以為10∶1-2∶1；更佳的，所述的納米顆粒與質(zhì)粒DNA混合的比例為5∶1。
本發(fā)明以丙烯酸甲酯和乙二胺為起始單體，合成5代的PAMAMdendrimer。本發(fā)明所述的PAMAM dendrimer的合成由兩步反應(yīng)組成(A)麥克爾加成；(B)親核取代，反應(yīng)式見(jiàn)下。重復(fù)進(jìn)行這兩步反應(yīng)，可以合成不同代數(shù)的聚合物。
首先進(jìn)行0.5代(G0.5)的合成，然后進(jìn)行1代(G1)的合成，重復(fù)以上兩步反應(yīng)。經(jīng)過(guò)5代反應(yīng)后，得到G5。
接著進(jìn)行純化步驟，將所得的混合物用蒸餾水溶解，微孔濾膜過(guò)濾，然后裝入透析袋中透析，在磁力攪拌下，不斷更換新鮮蒸餾水，直到透析袋外的溶液pH值為中性。接著進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，真空干燥，即得到純化的G5。此純化方法的原理是基于各代dendrimer的分子量(見(jiàn)表1)大小不同，代數(shù)越高直徑越大G＜5的分子可以從透析袋中擴(kuò)散出來(lái)，G5則留在透析袋內(nèi)，因此得到分離。
表1各代樹(shù)枝狀高分子的分子量的比較(計(jì)算值)G3 G4 G53252 6900 14196本發(fā)明的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料可應(yīng)用于造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料分子可有效地將目的基因轉(zhuǎn)染到經(jīng)CD34免疫磁珠純化后的造血干細(xì)胞內(nèi)，使目的基因所合成的蛋白在造血干細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下的例子只是作為對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1G5聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子的合成1.原料的預(yù)處理甲醇加入鎂粉，回流4h后蒸餾純化。乙二胺加入氫氧化鈉，放置24h，蒸餾純化。丙烯酸甲酯加入無(wú)水氯化鈣，回流4h后蒸餾純化。
2.G5 PAMAM dendrimer的合成0.5代(G0.5)的合成取乙二胺0.7ml(10mmol)于圓底燒瓶中，加入20ml甲醇，緩慢滴加丙烯酸甲酯9.0ml(100mmol)，室溫電磁攪拌3d。反應(yīng)完畢后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇和過(guò)量的丙烯酸甲酯，得淡黃色粘稠液體3.8g。產(chǎn)率94.1％。
1代(G1)的合成取上步反應(yīng)得到的G0.5 3.8g，加入甲醇40ml，緩慢滴加乙二胺20ml，室溫電磁攪拌3d。反應(yīng)完畢后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇和過(guò)量的乙二胺，得淡黃色粘稠液體4.5g。產(chǎn)率92.7％。
重復(fù)以上兩步反應(yīng)。經(jīng)過(guò)5代反應(yīng)后，得到G5。將所得的混合物用蒸餾水溶解，微孔濾膜(0.8μm)過(guò)濾。然后把濾液裝入透過(guò)分子量為8000-12000的透析袋中透析，在磁力攪拌下，不斷更換新鮮蒸餾水，直到透析袋外的溶液pH值為中性為止。收集透析袋里的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，真空干燥，即得到G5。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.2(m，6H，CH2)，2.2(s，5H，CH2)，3.21-3.25(m，2H，CH2)，3.7(m，4H，NH)。FTIR(KBr)υ(cm-1)3286(υN-H)，2942(υCH2)，2838(υCH2)，1652(υC＝O)，1556(βN-H)，1356(υC-N)，700(γC-N)。
實(shí)施例2造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染1.造血干細(xì)胞的純化采集時(shí)間不超過(guò)4小時(shí)的臍帶血用Ficoll分離出單個(gè)核細(xì)胞，用CD34免疫磁珠分離出CD34陽(yáng)性造血干細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度達(dá)到95％。在含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)一天。
2.造血干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染含有目的基因的質(zhì)粒DNA用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒純化后，用TE緩沖液稀釋到1ug/ul，將制備的納米顆粒配成5mg/ml的水溶液，將納米顆粒與質(zhì)粒DNA按5∶1的比例混勻，滴加到造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，離心洗滌一次，重新加入含造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)，檢測(cè)目的基因表達(dá)蛋白以確定轉(zhuǎn)染效率。
權(quán)利要求
1.一種聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，其特征在于，它是一類(lèi)高度枝化的球型結(jié)構(gòu)的單分散納米顆粒，分子大小為50-90納米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，其特征在于，所述的分子大小為70-80納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，其特征在于，所述的分子表面有極高的陽(yáng)性官能團(tuán)密度，內(nèi)部有空腔。
4.權(quán)利要求1所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料的合成方法，其特征在于，以丙烯酸甲酯和乙二胺為起始單體，通過(guò)合成5代的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子，然后采用透析方法對(duì)所得的5代的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子進(jìn)行純化，獲得高度枝化的球型結(jié)構(gòu)的單分散納米顆粒，即為所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料。
5.權(quán)利要求1所述的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料在造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染上的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將納米顆粒以一定濃度與一定比例的質(zhì)粒DNA混合，將該目的基因轉(zhuǎn)染到經(jīng)CD34免疫磁珠純化后的造血干細(xì)胞內(nèi)，目的基因所合成的蛋白在造血干細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，納米顆粒的濃度為5mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，納米顆粒與質(zhì)粒DNA混合的比例為10∶1-2∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，納米顆粒與質(zhì)粒DNA混合的比例為5∶1。
全文摘要
本發(fā)明屬于材料學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種聚酰胺－胺型樹(shù)枝狀聚合物納米材料，以丙烯酸甲酯和乙二胺為起始單體，通過(guò)合成5代的聚酰胺－胺型(PAMAM)樹(shù)枝狀高分子(dendrimer)，采用透析方法對(duì)所得的G5 PAMAM dendrimer進(jìn)行純化，獲得一類(lèi)高度枝化的球型結(jié)構(gòu)的單分散納米顆粒，分子大小在50－90納米，表面有極高的陽(yáng)性官能團(tuán)密度，內(nèi)部有空腔。該納米顆粒與一定比例的質(zhì)粒DNA混合后，可有效地將目的基因轉(zhuǎn)染到經(jīng)CD34免疫磁珠純化后的造血干細(xì)胞內(nèi)，目的基因所合成的蛋白在造血干細(xì)胞內(nèi)可長(zhǎng)期表達(dá)。
文檔編號(hào)C08G69/00GK1631936SQ200310122668
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者范華驊, 陸華中, 鄭濱, 高峰 申請(qǐng)人:上海市血液中心