專利名稱:產(chǎn)生l-胱氨酸的方法
本發(fā)明涉及通過(guò)酶反應(yīng)產(chǎn)生L-胱氨酸的方法。
胱氨酸能夠很容易還原為半胱氨酸。L-胱氨酸和L-半胱氨酸都是含硫的氨基酸，并用作例如藥物或其原料，或食品和化妝品的添加劑。特別值得注意的是近年來(lái)他們正被大量用于冷燙發(fā)液。
公眾已知有許多方法能產(chǎn)生L-半胱氨酸，包括(1)從天然物質(zhì)中提取;(2)有機(jī)合成;(3)發(fā)酵;和(4)酶反應(yīng)。從天然物質(zhì)中提取L-半胱氨酸方法的缺點(diǎn)在于人們認(rèn)為提供的原料不穩(wěn)定，提取的產(chǎn)物可能含有其他不需要的氨基酸。L-半胱氨酸的有機(jī)合成則需要將其與D-半胱氨酸分離。發(fā)酵產(chǎn)生L-半胱氨酸的方法，效率很低。因此，這三種方法中沒(méi)有一種方法適宜于工業(yè)生產(chǎn)。
人們已知有許多用酶產(chǎn)生L-半胱氨酸的方法，包括(1)通過(guò)使用半胱氨酸合酶或脫巰基酶，由L-絲氨酸和硫化氫合成L-半胱氨酸;(2)通過(guò)使用半胱氨酸脫巰基酶，例如從取代β-丙氨酸和金屬硫化物合成L-半胱氨酸;和(3)通過(guò)L-ATC-水化酶、ATC-消旋酶或S-氨基甲酰-L-半胱氨酸水化酶，從2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(ATC)合成L-半胱氨酸。由本發(fā)明的受讓與人提交的日本專利申請(qǐng)84545/1985號(hào)公開(kāi)了產(chǎn)生L-半胱氨酸的方法，即在色氨酸合酶存在的情況下，通過(guò)L-絲氨酸與具有巰基的化合物如金屬氫硫化物的作用產(chǎn)生。
無(wú)論哪種方法都可采用，但是當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物混雜在組合物中以及半胱胺酸大量溶于水中時(shí)，將半胱氨酸直接從反應(yīng)產(chǎn)物分離則是非常困難的。為此，通常是將半胱氨酸氧化為胱氨酸并將其從反應(yīng)產(chǎn)物中分離出來(lái)，通過(guò)電解還原等方法回收精制的半胱氨酸。
將半胱氨酸氧化為胱氨酸的許多方法都是眾所周知的。例如，日本專利公開(kāi)物7634/1982號(hào)介紹的方法是用空氣或過(guò)氧化物如H2O2將半胱氨酸氧化為含水的發(fā)酵產(chǎn)物，同時(shí)保持其pH值為5～10。
但是這個(gè)方法有許多不足之處。直到用酶反應(yīng)產(chǎn)生半胱氨酸之后，才能開(kāi)始例如由L-絲氨酸產(chǎn)生胱氨酸。用空氣或H2O2氧化半胱氨酸時(shí)，要是不嚴(yán)格控制氧化條件，則除了胱氨酸外還將大量產(chǎn)生分解產(chǎn)物。
對(duì)L-絲氨酸的酶反應(yīng)而言，將硫化氫(H2S)直接用作含硫氫基化合物，因其反應(yīng)速度快和費(fèi)用低，顯然更好些。但是H2S氣體難溶于水，通常不直接用它，而是用水溶性鹽，例如以氫硫化鈉作為H2S源。
在這種情況下，本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)改進(jìn)方法，即通過(guò)酶反應(yīng)，從L-絲氨酸產(chǎn)生L-胱氨酸的方法。
根據(jù)本發(fā)明的特征，用二甲亞砜(DMSO)氧化由L-絲氨酸與硫化氫或與堿金屬氫硫化物或堿金屬硫化物進(jìn)行酶反應(yīng)得到的含水反應(yīng)產(chǎn)物中的L-半胱氨酸。將二甲亞砜用于發(fā)生酶反應(yīng)的系統(tǒng)中，使產(chǎn)生的半胱氨酸可以成功地轉(zhuǎn)化為胱氨酸。使用二甲亞砜的優(yōu)點(diǎn)還在于，當(dāng)其促使硫化氫溶解在酶反應(yīng)的水介質(zhì)中時(shí)，使硫化氫獲得令人滿意的使用。
此外，二甲亞砜不僅不阻滯酶反應(yīng)，而且還成功地將L-半胱氨酸氧化為L(zhǎng)-胱氨酸，因此有利于急劇加速酶反應(yīng)。對(duì)此，本發(fā)明能夠避免L-半胱氨酸分解生成任何副產(chǎn)品，并且能以高產(chǎn)率從L-絲氨酸產(chǎn)生L-胱氨酸。
根據(jù)本發(fā)明，凡是能使L-絲氨酸與硫化氫或堿金屬氫硫化物或堿金屬硫化物進(jìn)行酶反應(yīng)的任何酶都能使用。任何已知的酶，例如半胱氨酸合酶或脫巰基酶都能使用。在上述提及的專利申請(qǐng)中所建議的色氨酸合酶也能使用。
使用色氨酸合酶特別有效和合乎需要，如在日本專利申請(qǐng)84545/1985號(hào)中公開(kāi)的各種微生物都可用于產(chǎn)生酶，包括大腸桿菌MT-10242(FERM BP-20)。使用從大腸桿菌得到的色氨酸合酶則特別有利。
酶不一定需要純的提取產(chǎn)物。能使用任何這類微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物、通過(guò)離心從中收集活的微生物、其冷凍凍干產(chǎn)物、通過(guò)超聲處理得到的微生物等。
關(guān)于底物L(fēng)-絲氨酸在反應(yīng)液中的濃度并沒(méi)有特殊限制，但通常所用溶液可取的濃度為1～25%(重量)。加入溶液的酶量視各種因素而定，如底物的濃度和酶的活性。一般不能給出詳盡的規(guī)定，而應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選用。如用色氨酸合酶時(shí)，加入很少量的5′-磷酸吡哆醛作為輔酶則更為理想。溶液可以含有例如0.1～50ppm的酸。
含有用于酶反應(yīng)的硫氫基化合物可選自堿金屬氫硫化物，如NaHS和KHS，或金屬硫化物，如Na2S和K2S。另外，直接將硫化氫氣體引入反應(yīng)系統(tǒng)也是可能的。在這種情況下，較為可取的是每摩爾L-絲氨酸至少用1摩爾硫化氫。
關(guān)于二甲亞砜的用量，即適合的用量為每摩爾L-絲氨酸含0.2～5.0摩爾二甲亞砜，特別理想的用量為0.5～2.0摩爾。如每摩爾L-絲氨酸僅用約小于0.2摩爾二甲亞砜，則很難將所有的L-半胱氨酸產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸;如用硫化氫，則二甲亞砜并不能有助于其得到令人滿意的溶解。如果所用二甲亞砜的量約大于5摩爾，則可能會(huì)嚴(yán)重抑制酶反應(yīng)。
反應(yīng)通常在溫度20℃～60℃，pH5～10條件下進(jìn)行2～50小時(shí)，如用硫化氫，則最佳反應(yīng)時(shí)間為2～10小時(shí)。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，溶液漸呈白色，表示L-胱氨酸結(jié)晶沉淀析出。
完成了反應(yīng)的溶液含有L-胱氨酸和未反應(yīng)的L-絲氨酸。通過(guò)下面的實(shí)施例所述方法，從反應(yīng)產(chǎn)物中分離出胱氨酸。在強(qiáng)鹽酸和活性炭存在的條件下，對(duì)溶液進(jìn)行加熱和熱過(guò)濾，以濾去溶液中的殘留細(xì)胞。然后pH值降至5左右，使L-胱氨酸結(jié)晶。采用常規(guī)的固液分離，收集高純度的L-胱氨酸。所收集的L-胱氨酸可通過(guò)電能還原，產(chǎn)生L-半胱氨酸。
現(xiàn)在參考幾個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例，更詳細(xì)地介紹本發(fā)明。在各個(gè)實(shí)施例中，都是根據(jù)公知的Gaitonde方法，通過(guò)測(cè)定半胱氨酸的含量計(jì)算胱氨酸的含量。將各個(gè)實(shí)施例中所得反應(yīng)產(chǎn)物稀釋到濃度為1/1000～1/2000的溶液，以大約相同量的5微摩1，4-二硫蘇糖醇(還原劑)加入該溶液，再加入2N的NaOH溶液，直至該溶液的pH值達(dá)至8.0～8.5。溶液在室溫下靜置1小時(shí)，使所含的全部胱氨酸都還原為半胱氨酸。將酸性水合茚三酮試劑加至該溶液，使半胱氨酸顯色并在吸收儀的560nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸收值，與預(yù)先配制的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品在560nm波長(zhǎng)處吸收值的工作曲線進(jìn)行比較，以測(cè)定各實(shí)施例產(chǎn)物中半胱氨酸的濃度。
實(shí)施例1在帶攪拌器、吹氣管和排氣管的200毫升分液瓶中，將10克L-胱氨酸、5.6克二甲亞砜和25毫克5′-磷酸吡哆醛進(jìn)料，加入離子交換水，使其在分液瓶中組成100克溶液，再加10%的NaOH溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.5。在分液瓶中再進(jìn)料2.0克(干重)含有色氨酸合酶的大腸桿菌MT-10242(FERM BP-20)，同時(shí)溶液保持在35℃。
將瓶中的硫化氫氣體的每分鐘約14毫升的速率吹入分液瓶，吹氣反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行4小時(shí)左右，同時(shí)加NaOH溶液使反應(yīng)溶液的pH值保持在8.5。吹入溶液的硫化氫摩爾數(shù)約是L-絲氨酸摩爾數(shù)的1.5倍。吹入硫化氫氣體后，溶液漸呈白色，表示L-胱氨酸沉淀析出。
盡可能均勻地從反應(yīng)產(chǎn)物中采取試樣，將各個(gè)樣品溶于2N的鹽酸溶液。通過(guò)離心分離從中離去大腸桿菌。由L-半胱氨酸分析計(jì)算L-胱氨酸的值為9.3%。這意味著大約81%的L-絲氨酸已經(jīng)變?yōu)長(zhǎng)-胱氨酸。
將大約25毫升的35%鹽酸加入反應(yīng)產(chǎn)物，pH值調(diào)至0.5。加入1.0克活性炭后，溶液在95℃下加熱大約1小時(shí)。然后立即對(duì)溶液進(jìn)行熱過(guò)濾，濾去其中的大腸桿菌。溶液呈現(xiàn)透明黃色。
將大約5毫升的40%NaOH溶液加入該溶液，調(diào)整pH值至5。冷卻溶液，析出L-胱氨酸結(jié)晶。用真空吸濾過(guò)濾器收集結(jié)晶，在20毫升離子交換水中洗滌，干燥后得8.2克白色L-胱氨酸結(jié)晶。這個(gè)量相當(dāng)于所用L-絲氨酸的72摩爾%。晶體的[α]20D值為-218.7°，純度99.1%，灰分含量0.2%。
實(shí)施例2在帶攪拌器的200毫升分液瓶中，將10克L-絲氨酸，5.6克二甲亞砜，25毫克5′-磷酸吡哆醛和9.5克氫硫化納(試劑純度70%)進(jìn)料。加入離子交換水，使其在分液瓶中組成200克溶液。加10%NaOH溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.0，然后在分液瓶中裝入2.0克(干重)與實(shí)施例1所用相同的菌。再加入濃度為每升4摩爾的磷酸溶液，溶液的pH值保持在8.0，溫度為35℃。反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行16小時(shí)左右。反應(yīng)開(kāi)始后約2小時(shí)，溶液呈白色，表示胱氨酸沉淀析出。
盡可能均勻地從反應(yīng)產(chǎn)物中采取試樣，各個(gè)樣品溶于2N的鹽酸溶液，通過(guò)離心分離，離去其中的大腸桿菌。從L-半胱氨酸分析計(jì)算L-胱氨酸的值為9.1%。這表示大約79%的L-絲氨酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。
由此以下的各個(gè)步驟都重復(fù)實(shí)施例1的方法，得到L-胱氨酸晶體7.6克。這個(gè)量相當(dāng)于所用L-絲氨酸的66.7摩爾%。晶體的[α]20D值為-220°，純度99.3%，灰分含量0.1%。
實(shí)施例3在帶攪拌器的200毫升分液瓶中，將10克L-絲氨酸，5.6克二甲亞砜，25毫克5′-磷酸吡哆醛和9.3克硫化鈉(試劑純度96%或更高純度)進(jìn)料。加入離子交換水，組成200克溶液，再加10%HCl溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.0。在分液瓶中再裝入2.0克(干重)與實(shí)施例1所用相同的菌，同時(shí)溶液保持在35℃，加10%HCl溶液，使pH值保持在8.0。反應(yīng)持續(xù)約16小時(shí)。反應(yīng)開(kāi)始后約2小時(shí)，溶液開(kāi)始時(shí)呈白色，表示胱氨酸沉淀析出。
盡可能均勻地從反應(yīng)產(chǎn)物中采取試樣，每個(gè)樣品都溶于2N的鹽酸溶液中，通過(guò)離心分離，離去其中的大腸桿菌。從L-半胱氨酸中分析計(jì)算L-胱氨酸的值為8.7%，即74%左右的L-絲氨酸已轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。
由此以下的各個(gè)步驟都重復(fù)實(shí)施例1的方法，得到L-胱氨酸結(jié)晶7.4克。這個(gè)量相當(dāng)于所用L-絲氨酸的64.9摩爾%。晶體的[α]20D值為-221°，純度98%，灰分含量03%。
實(shí)施例4在帶攪拌器的200毫升分液瓶中，將10克L-絲氨酸和5.6克二甲亞砜進(jìn)料。加入離子交換水，組成50克溶液。然后將分液瓶裝上含有半胱氨酸脫巰基酶的酶溶液，這種酶是通過(guò)培養(yǎng)枯草桿菌ATCC 6051并在緩沖液中經(jīng)超聲破碎所收集的大腸桿菌制備得到的。加入NaOH溶液，組成100克溶液，pH值為8.5。
將瓶中的硫化氫氣體以每分鐘大約14毫升的速率吹入分液瓶，吹氣反應(yīng)持續(xù)約4小時(shí)，用NaOH溶液將反應(yīng)溶液的pH值保持在8.5。吹入溶液的硫化氫摩爾數(shù)約是L-絲氨酸摩爾數(shù)的1.5倍。吹入氣體后，溶液漸呈白色，說(shuō)明存在L-胱氨酸。
盡可能均勻地從反應(yīng)產(chǎn)物中采取試樣，各個(gè)樣品溶于2N的鹽酸溶液，通過(guò)離心分離，離去其中的枯草桿菌。由L-半胱氨酸分析計(jì)算L-胱氨酸的值為5.8%。這表示大約53%的L-絲氨酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。反應(yīng)產(chǎn)物顯示的半胱氨酸濃度不超過(guò)0.1%。
權(quán)利要求
1.一種在有酶存在的條件下將L-絲氨酸反應(yīng)生成L-半胱氨酸并且再氧化該L-半胱氨酸產(chǎn)生L-胱氨酸的方法，其改進(jìn)在于將所述的L-絲氨酸與選自一組包括硫化氫、堿金屬硫化物和堿金屬氫硫化的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，而該L-絲氨酸與上述物質(zhì)的反應(yīng)是在有二甲亞砜用作所述L-半胱氨酸的氧化劑參加下進(jìn)行的。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述酶是色氨酸合酶。
專利摘要
L-絲氨酸與硫化氫或堿金屬硫化物或氫硫化物在有酶參加下反應(yīng)生成L-半胱氨酸，該L-半胱氨酸經(jīng)氧化產(chǎn)生L-胱氨酸。該反應(yīng)是在用作氧化劑的二甲亞砜參加下進(jìn)行的，使由酶反應(yīng)生成的L-半胱氨酸在反應(yīng)系統(tǒng)中可成功地轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。
文檔編號(hào)C07C323/58GK87103767SQ87103767
公開(kāi)日1988年12月7日 申請(qǐng)日期1987年5月20日
發(fā)明者宮原匠一郎, 上口俊昭, 宮原徹, 橋向匡嗣, 新田一成 申請(qǐng)人:三井東圧化學(xué)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan