專利名稱：阻燃熱塑性模塑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熱塑性模塑組合物，包含A)10-97重量％的不同于聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)的至少一種聚酯a1)，它含有以100重量％A)為基礎(chǔ)計的1-50重量％的PET a2)，B)1-30重量％的阻燃性結(jié)合物，由以100重量％B)為基礎(chǔ)計的以下組分組成b1)20-99重量％的含鹵素的阻燃劑，和b2)1-80重量％的氧化銻，C)0.01-5重量％的KH2PO4或LiH2PO4或它們的混合物，D)0.01-3重量％的防滴劑，和E)0-70重量％的其它添加劑，其中組分A)至E)的重量百分比的總和是100％。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的模塑組合物用于生產(chǎn)纖維、膜和模制品中的用途，和涉及任何類型的所得模制品。
US 4,532,290和US 3,953,539公開了PC/聚酯共混物，它含有作為酯基轉(zhuǎn)移的抑制劑或作為顏色穩(wěn)定劑的磷酸酯類。
EP-A 542,128公開了含有基于磷酸二氫鋅或磷酸二氫鈣的酯基轉(zhuǎn)移抑制劑的此類共混物，它也可以含有鹵代聚碳酸酯。
對于以作為聚酯的阻燃劑使用的含鹵素的、尤其低分子量的聚碳酸酯或低聚碳酸酯為基礎(chǔ)的模塑組合物的結(jié)晶行為和流動性，在工業(yè)上仍然有問題。在聚碳酸酯和聚酯之間的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成了嵌段共聚物，后者具有寬的分子量分布和較差的結(jié)晶性能。這尤其在快速熔融結(jié)晶溫度方面表現(xiàn)明顯，因此對于注塑和吹塑有不利影響。
因此，本發(fā)明的目的是提供阻燃性聚酯模塑組合物，它在加工過程中具有改進的結(jié)晶行為和更好的流動性。
因此我們發(fā)現(xiàn)這一目的可通過在開頭定義的模塑組合物來實現(xiàn)。在從屬權(quán)利要求中給出了優(yōu)選的實施方案。
令人吃驚地，尤其含鹵素的低聚阻燃劑與聚酯的這一結(jié)合物導(dǎo)致一種結(jié)晶行為，其中經(jīng)過長時間實施反復(fù)熔化后保持了高的結(jié)晶溫度。與這相關(guān)的是較短的周期時間和較短的脫模時間，和降低的粘合趨勢。
本發(fā)明的模塑組合物包含作為組分A)的10-97重量％、優(yōu)選20-97重量％和尤其30-80重量％的除聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)之外的聚酯，后者包含以100重量％A)為基礎(chǔ)計的1-50重量％、優(yōu)選10-35重量％的PET。
合適的聚對苯二甲酸乙二醇酯(a2)是從脂肪族二羥基化合物乙二醇和芳族二羧酸對苯二甲酸衍生的，和至多10摩爾％的芳族二羧酸在這里已經(jīng)被其它芳族二羧酸替代，如2，6-萘二羧酸或間苯二酸或它們的混合物，或被脂肪族或脂環(huán)族二羧酸替代，如己二酸、壬二酸或環(huán)己烷二羧酸。在聚對苯二甲酸乙二醇酯中的乙二醇也可以被至多0.75重量％的例如1，6-己二醇和/或5-甲基-1，5-戊二醇替代，基于所用的聚對苯二甲酸乙二醇酯總重量計。
本發(fā)明的聚對苯二甲酸乙二醇酯的粘度值一般是40-120ml/g，優(yōu)選60-100ml/g(根據(jù)ISO1628在苯酚/鄰二氯苯混合物(1∶1)的0.5重量％濃度溶液中于25℃測定)。
可使用的聚對苯二甲酸乙二醇酯的羧基端基含量一般是不大于60mval/kg，優(yōu)選不大于40mval/kg，和尤其不大于30mval/kg。羧基端基含量通常由滴定法(例如用電位測定法)測定。
所使用的聚對苯二甲酸乙二醇酯也可以是在粘度值和羧基端基含量上不同的這些化合物的混合物。
本發(fā)明的聚對苯二甲酸乙二醇酯是通過使用能促進酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)和如果合適的話能促進縮聚反應(yīng)的催化劑，由已知方法獲得。合適催化劑的例子是無機或有機路易斯酸金屬化合物，例如以元素周期表的IB、IIB、IVA、IVB、VA、VB或VIIIB族的金屬元素為基礎(chǔ)的那些?？墒褂玫哪切┑睦邮窃赨S專利3,936,421中提到的催化活性有機和無機鈦化合物、錫化合物和銻化合物。有機錫化合物和有機鈦化合物是特別合適的，例如四乙基錫、二氯二丁基錫、馬來酸二丁錫、月桂酸二丁基錫、正鈦酸四丁基酯、鈦酸四辛基酯和三乙醇胺鈦酸酯。
也理想的是將回用的PET材料(也稱作PET碎屑料)與聚酯如聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯例如PBT混合使用。
回用的材料一般是1)已知作為工業(yè)后回用材料的那些這些是在縮聚過程中或在加工過程中的生產(chǎn)廢料，例如來自注塑的熔渣，來自注塑或擠出的啟動材料，或來自擠塑片材或膜的裁邊。
2)消費后回用材料這些是在被最終消費者利用之后收集和處理的塑料制品。用于礦泉水、軟飲料和果汁的吹塑PET瓶子容易成為就數(shù)量而言占主導(dǎo)地位的制品。
這兩種類型的回用材料可以作為磨料或以粒料形式使用。在后一種情況下，粗的回用材料被分離和提純，然后使用擠出機熔化和造粒。這通常有利于處理和自由流動，和在加工中的附加步驟的計量加料。
所使用的回用材料可以是造粒形式或是再次研磨料形式。邊緣長度不應(yīng)該大于6mm，優(yōu)選低于5mm。
因為聚酯在加工過程中經(jīng)歷水解分裂(由于痕量的水分)，建議預(yù)先干燥回用材料。在干燥之后殘留水分優(yōu)選是＜0.2％，尤其＜0.05％。
不同于常用PET的聚酯a1)是以芳族二羧酸和脂肪族或芳族二羥基化合物為基礎(chǔ)的。
第一組的優(yōu)選聚酯是優(yōu)選在醇結(jié)構(gòu)部分中具有2-10個碳原子的聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯。
這一類型的聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯是本身已知的并描述在文獻中。它們的主鏈含有從芳族二羧酸衍生的芳族環(huán)。該芳族環(huán)也可以有取代基，例如被鹵素如氯或溴取代，或被C1-4烷基如甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、異丁基或叔丁基取代。
這些聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯可以按照本身已知的方式讓芳族二羧酸或其酯或其它能成酯的衍生物與脂肪族二羥基化合物進行反應(yīng)來制備。
應(yīng)該提及的優(yōu)選的二羧酸是2，6-萘二羧酸、對苯二甲酸和間苯二甲酸，和它們的混合物。至多30摩爾％、優(yōu)選不超過10摩爾％的芳族二羧酸可以被脂肪族或脂環(huán)族二羧酸替代，如己二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸或環(huán)己烷二羧酸。
在脂肪族二羥基化合物之中，優(yōu)選的是具有2-6個碳原子的二醇，尤其1，2-乙二醇，1，3-丙二醇，1，4-丁二醇，1，6-己二醇，1，4-己二醇，1，4-環(huán)己二醇，1，4-環(huán)己烷二甲醇，和新戊二醇，和它們的混合物。
特別優(yōu)選的聚酯(A)是從具有3-6個碳原子的鏈烷二醇衍生的聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯。在這些之中，特別優(yōu)選的是聚對苯二甲酸丙二醇酯和聚對苯二甲酸丁二醇酯和它們的混合物。也優(yōu)選的是PPT和/或PBT，它們含有至多1重量％、優(yōu)選至多0.75重量％的作為其它單體單元的1，6-己二醇和/或2-甲基-1，5-戊二醇。
聚酯(A)的粘度值一般是50-220、優(yōu)選80-160(在苯酚/鄰二氯化苯混合物(1∶1重量比，25℃)中的0.5重量％濃度溶液中測量)，根據(jù)ISO 1628測定。
特別優(yōu)選的是這樣一些聚酯，它們的羧基端基含量是至多100mval/kg聚酯，優(yōu)選至多60mval/kg聚酯，和尤其至多50mval/kg聚酯。制備這一類型的聚酯的一種方法是使用DE-A 44 01 055的工藝。羧基端基含量通常由滴定法(例如用電位測定法)測定。
在A)的特別優(yōu)選的實施方案中，PBT∶PET比率優(yōu)選是3∶1至1.5∶1，尤其2.5∶1至2∶1。
應(yīng)該提及的另一組是從芳族二羧酸和芳族二羥基化合物衍生的全芳族聚酯類的那些。
合適的芳族二羧酸是上面在聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯之下描述的化合物。優(yōu)選的是從5-100摩爾％間苯二甲酸和0-95摩爾％對苯二甲酸形成的混合物，尤其從約80-50％對苯二甲酸與20-50％間苯二甲酸形成的混合物。
該芳族二羥基化合物優(yōu)選具有以下結(jié)構(gòu)式與多種生理過程。組織蛋白酶為糖蛋白，在它們的活性位點含有一個必需的半胱氨酸殘基，但是它們的一些酶學(xué)性質(zhì)不同，包括底物特異性和pH穩(wěn)定性。已經(jīng)鑒定的一些組織蛋白酶有廣泛的表達，可能起“管家”的作用，而其他組織蛋白酶(像組織蛋白酶S)具有組織限制性表達并且可能有更專門的功能。
除了組織蛋白酶S、L和F，還鑒定了一些其他參與抗原降解的組織蛋白酶。它們是組織蛋白酶B、組織蛋白酶H、組織蛋白酶D和組織蛋白酶E和潛在地組織蛋白酶Z、V和K。由于各種組織蛋白酶的最適pH不同，有些在早期內(nèi)體中更具活性，而其他的在較遲階段的抗原加工中起作用。結(jié)果，蛋白片段的種群將隨著加工途徑而變化，而在不同個體的APC中肽的范圍也可能不同。除了組織蛋白酶，其他蛋白酶(如天冬酰胺內(nèi)肽酶，它在加工B細胞攝入的抗原中起關(guān)鍵的作用)也可能參與抗原的降解。
MHC肽復(fù)合物的形成在抗原降解途徑后，在HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子的結(jié)合溝中將出現(xiàn)能結(jié)合這些分子的肽。為了使肽結(jié)合HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子，必須從結(jié)合溝中除去稱為CLIP(II類相關(guān)的Ii肽)的肽。CLIP是衍生自Ii蛋白的肽，它是一種伴侶蛋白分子，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HLA-DR、DQ和DP靶定到內(nèi)吞小泡。由于Ii含有(C末端)三聚區(qū)而形成九堿基序列復(fù)合物。Ii的胞質(zhì)區(qū)含有信號序列，該信號序列靶定復(fù)合物穿過高爾基體，進入內(nèi)吞途徑。這里Ii分子分幾個階段降解。首先，該三聚區(qū)被一種非半胱氨酸蛋白酶切下，因此九堿基序列分離得到DRα-DR β-IiP22復(fù)合物。一種Cys-蛋白酶從C末端切開CLIP區(qū)而除去兩個龐大的糖類，留下DRα-DRβ-IiP10。最后，Ii在CLIP肽的N末端切開，留下DRα-DRβ-CLIP。該CLIP肽可以和內(nèi)體中的其他肽交換。
在肽結(jié)合HLA-DR的交換反應(yīng)中，一種叫做HLA-DM的分子(一種MHC II類編碼的酶)通過催化CLIP肽和其他低親和力的結(jié)合DRα-DRβ的肽的交換以得到更穩(wěn)定地衍生自加工過的抗原的結(jié)合肽而起著關(guān)鍵作用[Busch等綜述，(2000)，Curr.Op.Immunol.12，99-106]。HLA-DM對于肽和體外純化的HLA-DR的交換反應(yīng)動力學(xué)有很大影響，有效刺激一些肽的釋放。內(nèi)體中HLA-DM和HAL-DR的化學(xué)計量為1∶5-1∶12，而體外DM的更新為約3-12/min。HLA-DM通過暴露的疏水區(qū)和帶電殘基與HLA-DR分子相互作用。已經(jīng)就HLA-DM的晶體結(jié)構(gòu)模型提出了相互作用的最可能位點[Mosyak等，(1998)Immunity9377-383]。HLA-DM優(yōu)先結(jié)合已經(jīng)和肽低親和性結(jié)合的HLA-DR復(fù)合物。除此之外，HLA-DM還結(jié)合空的HLA-DR二聚體，該二聚體不穩(wěn)定并且在沒有HLA-DM時可能聚集。HLA-DM的結(jié)合穩(wěn)定了與肽松散結(jié)合或沒有肽結(jié)合的HLA-DR二聚體的“空態(tài)”。通過用這種方式保持HLA-DR結(jié)合溝的打開，肽能夠競爭結(jié)合于該溝。肽的交換也可以在體內(nèi)沒有HLA-DM時發(fā)生，盡管交換效率顯著下降。CLIP肽的N末端區(qū)能在結(jié)合溝外和一些HLA-DR同種型結(jié)合，從而穩(wěn)定CLIP肽更可能被釋放的構(gòu)象。也不是絕對需要HA-DM的作用以將HLA-DR復(fù)合物運送到質(zhì)膜。沒有HLA-DM時，結(jié)合有自身肽的CLIP肽的II類分子仍然能到達細胞表面。
HLA-DM在酸性pH下有最大活力，因此主要在蛋白水解性內(nèi)體(稱作MHC)中有活性。在酸性MHC中，肽穩(wěn)定地結(jié)合在HLA-DR的抗原結(jié)合溝中后HLA-DM將被釋放。或者，HLA-DM可以和HLA-DR復(fù)合物共同運送到細胞表面，細胞表面的中性pH導(dǎo)致HLA-DM的快速釋放。實際上，在細胞表面可以發(fā)現(xiàn)少量HLA-DM，它們可能在細胞表面具有作用[Arndt等(2000)，EMBO J.196，1241-1251]。然后，含有溶酶體靶信號的HLA-DM被很快內(nèi)化并重新靶向MHC。
一種叫做HLA-DO的MHC II類編碼的蛋白具有調(diào)節(jié)功能[van Ham等綜述，(2000)，Immunogen.51，765-770]，以依賴于pH的方式抑制HLA-DM的活性[van Ham等(1997)，Curr.Biol，7，950-957]。HLA-DM在pH 5時有最大活力，但在pH 6時也有活性。PH 6時HLA-DO的結(jié)合使HLA-DM活性喪失。這樣，HLA-DO起著HLA-DM活性的pH傳感器的作用，在早期內(nèi)體中抑制HLA-DM的活性而在溶酶體pH時允許其具有活性。實際上，在HLA-DO陰性細胞中，可以發(fā)現(xiàn)HLA-DR裝載著還沒有被完全加工的長肽，而在HLA-DO陽性細胞中不會發(fā)生這些肽對HLA-DR的結(jié)合。
盡管HLA-DM在所有APC中表達，但是HLA-DO卻主要在B細胞中發(fā)現(xiàn)。有人建議這是特異性刺激衍生自通過B細胞受體介導(dǎo)的攝取而內(nèi)化的抗原表位呈遞的一條途徑。當(dāng)結(jié)合抗體的抗原被B細胞胞內(nèi)吞后，它們很快被運送到MHC——晚期蛋白加工囊泡。由于酸性pH，HLA-DO在這些區(qū)域不起作用，從這些抗原中切除的肽將很快結(jié)合到HLA-DR。在早期內(nèi)體(即其中由于pH的關(guān)系，HKA-DM的功能被HLA-DO抑制的內(nèi)體)中，由被非受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入的抗原產(chǎn)生的肽將被阻止與HLA-DR的結(jié)合[van Ham等(2000)，J.Exp.Med1917，1127-1136]。
HLA-DR、DQ和DP二聚體的結(jié)合溝含有一些口袋，抗原肽氨基酸可以結(jié)合在這些口袋中?？梢越Y(jié)合在這些口袋中的所謂的肽的錨定殘基是將肽結(jié)合到HLA-DR、DQ和DP的主要決定簇。結(jié)合MHC是一種競爭性過程，具有高親和力的肽比低親和力的肽的競爭力要強，有助于它們在APC表面上的呈遞[Adorni L.等(1988)J.Ex.Med1682091；Ii.W.等(1992)Eur.J.Immunol.22943]。對于某些肽，親和力是如此高以至有效組成了不可逆的結(jié)合反應(yīng)[Lanzavecchia A.等(1992)Nature357249]。
發(fā)明概述因此，如上所述，希望鑒定并去除任何有治療價值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白的任何給定的T細胞表位或者至少降低其有效性。本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供方法，通過這些方法在施用作為治療分子的蛋白時，必然存在的T細胞表位不會導(dǎo)致對該蛋白的免疫原性應(yīng)答。因此，在去除或改善治療蛋白免疫原性可能性的這一主題中，此處提供了多個方法學(xué)的備選方案。
概括的講，本發(fā)明涉及下面的論題●一種修飾的多肽，其中該修飾破壞了該肽作為MHC II類配體的能力；●通過MHC II類途徑呈遞到免疫系統(tǒng)的能力降低的修飾的多肽；●一種修飾的多肽，當(dāng)體內(nèi)使用時其基本上沒有免疫原性或者比具有相同的生物學(xué)活性的未修飾多肽的免疫原性要??；●一種據(jù)此修飾的多肽，其中修飾是分別用D-異構(gòu)形式的氨基酸取代多肽鏈中特定氨基酸殘基；●一種據(jù)此修飾的多肽，其中修飾是共價連接一個化學(xué)基團；●一種據(jù)此修飾的多肽，其中修飾導(dǎo)入了信號序列，該信號序列能夠指導(dǎo)在合適的宿主中多肽的翻譯后修飾，并且該翻譯后修飾使得該多肽不能連同MHC II類分子一起呈遞；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中氨基酸序列的改變在某處進行，未修飾的多肽的該處易于被MHC II類蛋白水解途徑的蛋白酶切割；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中氨基酸序列的改變在某處進行，未修飾的多肽的該處不被MHC II類蛋白水解途徑的蛋白酶切割；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中所做的氨基酸序列的改變是為了向MHC II類蛋白水解途徑的蛋白酶導(dǎo)入一個新的切割位點；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中氨基酸序列的改變在某處進行，未修飾的多肽的該處為T細胞表位，并且由于肽的切割的原因該改變使得T細胞表位不能幸免于MHC II類呈遞的加工途徑；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中氨基酸序列的改變在某處進行，未修飾的多肽的該處為T細胞表位，并且該改變使得T細胞表位由于失去和Ii的相互作用而不能幸免于MHC II類呈遞的加工途徑；●一種特異性的多肽，其中通過氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的喪失，其中氨基酸序列的改變導(dǎo)致該多肽參與HLA-DM催化的肽交換反應(yīng)的能力降低；●HLA-DO類似物或衍生物的應(yīng)用，用于抑制HLA-DM催化的肽交換；●HLA-DM類似物或衍生物的應(yīng)用，用于抑制HLA-DM催化的肽交換；●一種據(jù)此改造的多肽，其中改造在被識別為T細胞表位的序列中進行，所述免疫原性的喪失通過氨基酸的替代、增加或缺失得到，該氨基酸序列改變的位置在未修飾多肽中為T細胞表位，該改變使得T細胞表位由于肽的切割而不能幸存于MHC II類呈遞的加工途徑；●一種方法，其中目的蛋白的蛋白酶識別位點的知識被用于確定從該蛋白中必須除去哪些潛在的T細胞表位；●一種含有T細胞表位的多肽，其中所述表位的N-末端和/或C-末端側(cè)面區(qū)域的一個或多個氨基酸的改變使得一個或多個蛋白酶識別位點對這些蛋白酶具有抗性；●一種含有T細胞表位的多肽，其中一個或多個氨基酸的改變使得在該表位中導(dǎo)入一個新的蛋白酶位點；●一種多肽，其中一個或多個氨基酸的改變產(chǎn)生了B細胞天冬酰胺酰基內(nèi)肽酶切割位點；●一種多肽，其中一個或多個氨基酸的改變產(chǎn)生了組織蛋白酶位點；●一種多肽，其中一個或多個表面暴露的天冬酰胺殘基被另外的氨基酸代替；●一種多肽，其中一個或多個表面暴露的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基代替；●一種多肽，其中所有表面暴露的天冬酰胺殘基被另外的氨基酸代替；●一種降低多肽免疫原性潛能的方法，包括通過任何方法分析該多肽的蛋白酶切割模式的步驟；●一種降低多肽免疫原性潛能的方法，包括使用基因數(shù)據(jù)庫研究技術(shù)(in silico)分析該多肽的蛋白酶切割模式；●一種降低多肽免疫原性潛能的方法，包括改變該多肽的蛋白酶切割模式；●一種降低多肽免疫原性潛能的方法，包括通過向該多肽序列中導(dǎo)入一個或多個額外的切割位點而改變該多肽的蛋白酶切割模式；●一種降低多肽免疫原性潛能的方法，包括通過除去該多肽中一個或多個切割位點改變該多肽的蛋白酶切割模式；●一種修飾的多肽，由此上述或下述任何類型的修飾特異地作用而導(dǎo)致一旦該多肽被加工以呈遞于APC就失去和MHC II類肽結(jié)合溝的結(jié)合能力；●一種通過向治療蛋白導(dǎo)入一份或多份能有效呈遞MHC II類的肽序列而降低該治療蛋白免疫原性的方法；●一種通過向治療蛋白導(dǎo)入一份或多份能有效呈遞MHC II類的肽序列而降低該治療蛋白免疫原性的方法，并且多份拷貝串連，每個肽單元側(cè)面與一個蛋白酶切割位點相接；●一種特異性的方法，其中附加的肽序列是自身肽；●一種特異性的方法，其中附加的肽序列是序列為AILEFRAMAQFSRKTD的自身肽；●一種結(jié)構(gòu)為[X]nY的修飾肽，其中X＝全反應(yīng)結(jié)合多個MHC同種型的自身肽，n＝包括1的任何整數(shù)，Y＝治療蛋白；●一種特異性的多肽結(jié)構(gòu)，但X＝AILEFRAMAQFSRKTD；●一種特異性的多肽結(jié)構(gòu)，但X含有C-末端蛋白酶特別是對表1的任何組織蛋白酶的切割位點；●一種結(jié)構(gòu)為Y-[X]n的修飾多肽，其中X＝全反應(yīng)結(jié)合多個MHC同種型的自身肽，n＝包括1的任何整數(shù)，Y＝治療蛋白；●一種特異性的多肽結(jié)構(gòu)，但X含有N-末端蛋白酶特別是對表1的任何組織蛋白酶的切割位點；●一種結(jié)構(gòu)為[X’]n-Y-[ X”]n的修飾多肽，其中X＝全反應(yīng)結(jié)合多個MHC同種型的自身肽，n＝包括1的任何整數(shù)，Y＝治療蛋白；●一種據(jù)此修飾多肽結(jié)構(gòu)，但X’＝X”；●一種據(jù)此修飾多肽結(jié)構(gòu)，但X’含有C-末端蛋白酶切割位點并且X”含有N-末端切割位點；●一種結(jié)構(gòu)為[X]nY的修飾多肽，其中X＝全反應(yīng)結(jié)合多個MHC同種型的自身肽，n＝包括1的任何整數(shù)，Y＝治療蛋白；此處和所附權(quán)利要求書中所用術(shù)語“肽”為包括兩個或多個氨基酸的化合物。這些氨基酸通過肽鍵(下面定義)相連。有20種不同的天然存在的氨基酸參與肽的生物生產(chǎn)，并且任意數(shù)目的它們可以以任意順序連接形成肽鏈或環(huán)。在肽的生物生產(chǎn)中所用的天然存在的氨基酸都為L構(gòu)型。可用傳統(tǒng)合成方法，利用L-氨基酸、D-氨基酸或這兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種組合制備合成肽。有些肽只含有一些氨基酸單元。短肽(例如，具有少于10個氨基酸單元)稱為“寡肽”。其他肽含有許多氨基酸殘基(例如多達100個或更多)，稱為“多肽”。通常，可認為“多肽”是含有三個或更多氨基酸的任何肽鏈，而通常認為“寡肽”是特定類型的“短”多肽。這樣，如此處所用的，任何所提及的“多肽”也包括寡肽。此外，任何提及的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。每個不同的氨基酸排列組成不同的多肽或蛋白。可形成的多肽數(shù)目——因此不同蛋白的數(shù)目——實際上是無限的。
APC表面上的MHC II類/肽復(fù)合物提供了特異性的T細胞受體(TCR)的結(jié)合面，該T細胞受體能夠識別由該肽暴露的殘基和MHC II類分子提供的決定簇。結(jié)合MHC II類分子并且使得TCR促進免疫應(yīng)答的任何肽通常定義為表位，特別是功能性T細胞表位。
發(fā)明詳述本發(fā)明特別提供了通過MHC II類途徑呈遞給免疫系統(tǒng)的能力降低的修飾多肽。在第一個實施方案中，通過氨基酸替代修飾該多肽，該替換為將多肽鏈中的一個或多個特定氨基酸殘基改變?yōu)樗鼈兏髯缘腄-異構(gòu)形式。
已知將單個D-氨基酸包含于多肽中將破壞對MHC II類結(jié)合溝的結(jié)合。US 5,679,640表明D-氨基酸的替代需要在肽MHC復(fù)合物的關(guān)鍵接觸位點進行，非關(guān)鍵位點的替代在MHC/肽復(fù)合物中是可以忍受的。本發(fā)明的目的是利用D-氨基酸替代破壞MHC II類結(jié)合口袋中的結(jié)合以便使肽不能呈遞給TCR。這和US5,679,640所教導(dǎo)的方法顯著不同，US5,679,640中替代發(fā)生在非關(guān)鍵結(jié)合殘基，其策略是用保持對MHC高親和性但不能識別和結(jié)合TCR的自身抗原替代物置換自身抗原肽。
在本領(lǐng)域中有許多描述多肽療法的例子，并且這些例子的特征在于一級結(jié)構(gòu)中一個或多個D-氨基酸殘基。這些例子包括US5,182,261、US5,668,109、US4,764,504、US5,948,764、US5,545,618、US5,877,156、US5,932,545、US6,087,441等，其中均產(chǎn)生了含有一個或多個D-氨基酸殘基的全合成肽。通常，這些替代與對N和/或C末端殘基的額外修飾結(jié)合以通過減小被肽酶降解的可能性而賦予其體內(nèi)穩(wěn)定性。D-氨基酸本身不易受到酶的攻擊從而具有體內(nèi)穩(wěn)定性，但是在上面引用的例子的上下文中，D-氨基酸被包含在特定位置，通常通過使它們對生物靶標(biāo)的結(jié)合增強和阻礙某些具有潛在的或?qū)嶋H的治療優(yōu)點的生物學(xué)活性而賦予它們的組成性合成肽的拮抗活性。
這樣，US5,985,242公開了以D-氨基酸為特征的合成的β淀粉狀蛋白肽類似物，提出這些類似物結(jié)合存在于淀粉狀蛋白產(chǎn)生性疾病如阿爾茨海默氏病中的新生神經(jīng)原纖維纏結(jié)的天然存在的β淀粉狀蛋白肽。通過如此結(jié)合，該多肽類似物抑制了進一步的聚集。類似地，該申請還描述了含有D-氨基酸的人髓鞘堿性蛋白(MBP)的肽類似物。在US5,948,764中的一個實施方案中描述了至少有7個氨基酸并且優(yōu)選包含人MBP的86-99位殘基的肽。修飾包含87位殘基(否則將是L-纈氨酸)的肽以在該位置包含一個D-氨基酸，這樣相對于天然MBP87-99，肽類似物對MHC的結(jié)合增強。典型的修飾包括將L-纈氨酸替換為D-纈氨酸或另一種D-氨基酸。
在本領(lǐng)域，特別是在合成肽治療學(xué)領(lǐng)域，通常在肽的N和/或C末端包括“帽化”結(jié)構(gòu)以增加該肽的體內(nèi)半衰期。這樣，從上面的例子中，在US5,985,242中，末端修飾除了在序列段中包含D-氨基酸外還包括C-末端酰胺化、烷基化或加入芳基酰胺或羥基基團。也公開了N-末端的修飾方法，包括加入環(huán)、雜環(huán)、多雜環(huán)和/或分支的烷基基團，在本領(lǐng)域中，已經(jīng)考慮過各種化學(xué)基團和化學(xué)鍵旨在使體內(nèi)環(huán)境中多肽的末端穩(wěn)定。
利用非天然對映異構(gòu)體形式的氨基酸如D-氨基酸對于通過化學(xué)合成制備的治療劑是可行的策略。不能用重組表達系統(tǒng)將D-氨基酸摻入大分子量的多肽治療劑中。盡管許多微生物來源的發(fā)酵系統(tǒng)和從細菌、真菌和其他生物來源純化的酶能夠互變外消旋的游離氨基酸，但是，根據(jù)發(fā)明人的知識，在多肽鏈中使得氨基酸殘基外消旋的酶學(xué)方法在本領(lǐng)域中還是未知的。在本發(fā)明的方案下，這種酶的能力的發(fā)現(xiàn)將具有明顯的實用性。
本發(fā)明的另一個實施方案包括將化學(xué)基團共價連接到多肽治療蛋白上。所附加的基團將阻止一個或多個上面所概述的抗原加工步驟并使該基團所連接的多肽序列的片段呈遞于APC表面MHC/肽所有組成成分的傾向減至最小。最優(yōu)選地，所用的化學(xué)基團連接到多肽鏈的單個目的位點。也考慮備選的構(gòu)型，由此共價連接修飾發(fā)生在許多目的位點和/或由該多肽特定一級結(jié)構(gòu)中指定的位點。
在本領(lǐng)域中存在通過共價連接大化學(xué)基團或附件(appendage)如聚糖衍生物、聚乙二醇衍生物脂部分等的修飾多肽的方法[例如見US5,885,570、WO0026230、WO90/13590等]。還公開了其他的修飾方法，如連接單碳乙?；鵞WO0035427]，所進行的修飾旨在通過空間阻礙分子上特定受體位點和/或免疫監(jiān)視逃避的一般化機制增強治療劑的生物利用度。
這種設(shè)想的化學(xué)修飾的一個特定的實例是對多肽鏈增加Asn-連接的糖基化，該化學(xué)修飾對于本發(fā)明的目的是特別合適的。提供Asn-連接的糖基化的共有信號序列確切定義為Asn-X-Ser/Thr，其中X為除Pro之外的任何氨基酸(三字母密碼)。在任何定義的表位中通過單個氨基酸替換產(chǎn)生Asn-X-Ser/Thr基元對于大多數(shù)表位實際上是不可能的，因為它們的核心序列將和該基元相去甚遠，這是公認的。為此，建議用多個氨基酸的替代產(chǎn)生該信號序列，并且這些氨基酸替代在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域中已知其他糖基化連接，如O-連接的糖基化，包括簡單的寡糖鏈或粘多糖鏈[Alberts.B.等(1990)Molecular Biology of the Cells第二版，Garland Publishing Inc.New York 433-475頁]并且位于本發(fā)明范圍內(nèi)。
糖基化肽(例如Asn-連接的聚糖)是穩(wěn)定的并且不會被TAP(MHC I類加工途徑的一個關(guān)鍵組分)從細胞溶膠中輸出到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔[Momburg F.M.等(1994)J.Exp.Med.179533]。而且，大多數(shù)天然加工的肽不含有N-連接的聚糖共有序列，可以合理預(yù)期MHC II類途徑中的聚糖肽的加工和運輸將受到單糖決定簇的影響并且進一步使該肽和MHC II類結(jié)合溝結(jié)合的不可能性增大。
因此，可以理解多肽的糖基化可以導(dǎo)致糖基化的多肽比未糖基化的多肽(否則具有相同結(jié)構(gòu))的免疫原性要弱。本發(fā)明另一個實施方案提供了多肽，其中糖基化信號或者糖基化位點被除去以至所得多肽比未糖基化肽相對物更具免疫原性。這種情況是例如疫苗分子所需要的，由此旨在關(guān)注對特定分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
優(yōu)選使用本發(fā)明的多肽的共價修飾發(fā)生在最小數(shù)目的位點上。特別優(yōu)選共價修飾定位于多肽一級結(jié)構(gòu)內(nèi)所限定的殘基。將化學(xué)連接定位于多肽分子的特定殘基或幾類氨基酸殘基的方法是熟知的，并且根據(jù)優(yōu)選的實施方案，在本發(fā)明范圍內(nèi)這些方法可用于修飾。這樣，使得靶向連接到Lys殘基的酰胺基團或者Asp或Glu殘基上的羧基基團或者活化Cys殘基上的巰基的化學(xué)修飾方法是成熟的[見例如Bioconjugate Techniques，(1996)Hermanson G.T.Academic Press Inc；Aslam M.& Dent A.Bioconjugation(1998)Macmillan，London]并且可用于本發(fā)明方案中。類似地，活化和偶聯(lián)聚合物分子如PEG的方法已在本領(lǐng)域中詳細描述[實例見US5,349,001和WO90/13590]并且可鑒定適合在本發(fā)明方案中使用的本領(lǐng)域中偶聯(lián)其他脂質(zhì)或酰胺或單糖或其他化學(xué)物質(zhì)的類似方案。
本發(fā)明涉及降低治療蛋白免疫潛能的方法，通過第四種通用方法也可以達到該目的，該方法包括這樣一個實施方案，即在治療多肽氨基酸殘基序列的一個或多個特定區(qū)域?qū)ζ溥M行修飾。該修飾可以是替代、缺失或加入氨基酸殘基，這種修飾的結(jié)果是改變了一個或多個關(guān)鍵蛋白酶對該多肽的識別，這些蛋白酶通過對肽的降解而使加工的肽表位最終可能和MHC II類結(jié)合溝結(jié)合。
本發(fā)明的一個特定實施方案是對被證明或者預(yù)測可能結(jié)合MHC II類分子HLA-DR、DQ和DP的側(cè)翼肽進行突變或修飾，使得這些肽不能被參與MHC II類途徑蛋白加工的蛋白酶從抗原蛋白中切除。
另一個實施方案是對被證明或者預(yù)測可能結(jié)合HLA-DR、DQ和DP分子的蛋白序列進行修飾，使得這些序列對參與MHC II類加工途徑的蛋白酶敏感。這也可以通過改變氨基酸使得產(chǎn)生的基元能被參與MHC II類途徑的蛋白酶識別和切割而完成。
在另一個實施方案中，關(guān)于目的蛋白中蛋白水解加工位點的信息本身就是有用的數(shù)據(jù)，可以用于預(yù)測以鑒定可能結(jié)合HLA-DR、DQ或DP并因此可能在APC的表面發(fā)現(xiàn)的肽。
蛋白酶天冬酰胺內(nèi)肽酶在被B細胞攝入的抗原的加工中起關(guān)鍵作用。已表明該酶在降解人B細胞破壞的溶酶體中的破傷風(fēng)毒素區(qū)中扮演著關(guān)鍵角色[Manouri等，(2000)Nature396695-699]。B細胞天冬酰胺?；鶅?nèi)肽酶的切割位點依賴于靶蛋白的序列和結(jié)構(gòu)。已知道所述多肽抗原首先用該蛋白酶消化從而暴露對其他蛋白酶如組織蛋白酶敏感的位點，這些位點對于進一步加工是必須的。天冬酰胺?；鶅?nèi)肽酶對破傷風(fēng)毒素C片段的加工可以被所述抗原Asn殘基的N-糖基化所抑制。該酶在胸腺APC中的蛋白加工中起作用[Mannoury等，(2002)Nat.Immunol3169-174；Anderton等，(2002)Nat.Immunol3175-181]，在胸腺APC中該酶除去髓鞘堿性蛋白(含有一個中央天冬酰胺)的一個隱含的表位。
因此，通過除去暴露于表面的天冬酰胺殘基可以降低本發(fā)明方案中多肽的免疫原性。通過氨基酸替代，最方便的是用重組DNA技術(shù)(盡管也可考慮其他方案如化學(xué)脫酰胺作用或化學(xué)合成)完成去除。在第一個實例中，特別好的替代是用谷氨酰胺替換天冬酰胺，盡管可以同樣考慮其他替換，如用天冬氨酸或谷氨酸進行替換。
另一個蛋白酶(只在胸腺中發(fā)現(xiàn))是胸腺特異性絲氨酸蛋白酶。編碼該蛋白的基因位于MHC I類區(qū)。在其他APC中沒有觀察到該蛋白的表達。該酶的專有表達和胸腺細胞中組織蛋白酶L的特異角色(見上面)表明胸腺細胞中蛋白水解環(huán)境是相當(dāng)獨特的。
因為一些上面所提到的蛋白酶也參與其他生理過程，所以也對這些蛋白酶中的某些的機制和特異性進行了分析。表1概述了許多重要的組織蛋白酶的特異性。
表1
本發(fā)明的目的是修飾抗原蛋白，使得被參與MHC II類呈遞蛋白水解加工途徑的蛋白酶加工的位點對這些酶不敏感，導(dǎo)致在抗原呈遞細胞表面抗原肽的呈遞減少；另一個目的是在抗原蛋白的T細胞表位導(dǎo)入額外的蛋白酶位點，使得這些表位在內(nèi)吞小泡中被進一步加工而不再被呈遞給免疫系統(tǒng)。這些突變和那些除去或破壞表位自身的突變不同，而是導(dǎo)致潛在的MHC II類配基從加工途徑中出現(xiàn)并被呈遞到APC表面的可能性減小。這樣，在本發(fā)明方案下，不必突變抗原肽的MHC錨定殘基，盡管本發(fā)明的突變可以和這種策略組合進行。
以及采用了許多方法鑒定通過此處所概述的MHC II類系統(tǒng)呈遞到APC表面的肽的性質(zhì)。例如，可以從載有抗原的APC表面純化抗原肽并對提取的肽應(yīng)用蛋白測序技術(shù)。備選地，將構(gòu)成某種目的蛋白的合成(重疊的)肽文庫結(jié)合到抗原呈遞細胞或純化的HLA-DR、DQ或DP分子，洗脫后對與這些蛋白相互作用的那些肽進行序列分析。另一個方法是基于HLA-DR分子的共有結(jié)合基元或者通過X射線衍射/結(jié)構(gòu)建?；蛘咂渌诨驍?shù)據(jù)庫研究技術(shù)如肽對接來預(yù)測某種目的蛋白的哪些肽可能結(jié)合HLA-DR分子。
原則上，所有這些方法都能夠得到可能結(jié)合到MHC分子的肽的序列的信息，這些數(shù)據(jù)可用來在肽或衍生肽的蛋白中產(chǎn)生突變，這樣和MHC分子的相互作用就受到嚴(yán)重的阻礙。可以在蛋白中得到的突變通常局限于那些緊密結(jié)合于HLA-DR、DQ或DP的肽結(jié)合溝中的抗原肽的殘基，即所謂的錨定殘基。盡管大多數(shù)表位的這些突變足夠降低抗原性，但是，有些表位較難去除，因為這些位置的突變嚴(yán)重地影響該蛋白的功能活性。本發(fā)明將克服該局限。
當(dāng)使用肽文庫選擇DR結(jié)合肽時，可能發(fā)現(xiàn)肽具有結(jié)合DR分子的潛力，但是在抗原呈遞細胞中從不發(fā)生，因為這些細胞中的蛋白水解途徑不允許該肽從抗原蛋白中出現(xiàn)。對于用計算機算法預(yù)測結(jié)合DR或DQ分子的肽也會出現(xiàn)同樣的問題。結(jié)果，兩種方法都導(dǎo)致對可能在對某個蛋白的免疫應(yīng)答中起作用的肽的數(shù)目的過多預(yù)測。確定哪些預(yù)測的可能T細胞表位很可能被呈遞到抗原呈遞細胞還需要關(guān)于該蛋白中蛋白酶位點的額外信息。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的除去蛋白酶加工位點的方法如下1.確定給定目的蛋白的(部分)序列。
2.鑒定可能結(jié)合HLA-DR、HAL-DQ或HLA-DP分子的肽。
3.分析這些表位兩側(cè)伸展的氨基酸已確定存在可以被參與MHC II類加工途徑的蛋白酶，特別是表1詳述的蛋白酶識別的基元。
4.設(shè)計突變，使得蛋白酶不再在這些位置識別并切割。
5.用任何現(xiàn)今的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)向目的蛋白中導(dǎo)入突變。
6.任選地，重新分析修飾的分子以證實在所希望的區(qū)域失去蛋白酶敏感性并且該肽于MHCII類結(jié)合而被呈遞于細胞表面的能力降低。
在實施上面的方法時，可利用從抗原呈遞細胞中提取蛋白水解蛋白時，任選地進行步驟3。將目的蛋白和提取物孵育，這可以在寬范圍的條件下(例如多個pH點)進行?？梢岳缬肏PLC純化各種片段，然后用Edman降解和/或質(zhì)譜鑒定它們的序列來分析目的蛋白的消化產(chǎn)物。根據(jù)該方案，所發(fā)現(xiàn)的片段的序列與目的蛋白序列的對比表明蛋白酶切割的位點使得可以設(shè)計合理的突變而使蛋白酶不再識別這些位置并在這些位置切割。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的通過導(dǎo)入額外的加工位點而降低免疫原性的方法如下1.確定給定目的蛋白(部分)的序列。
2.鑒定可能結(jié)合HLA-DR、HAL-DQ或HLA-Dp分子的肽。
3.在鑒定為T細胞表位的肽中設(shè)計導(dǎo)入蛋白酶識別基元突變，這樣可以在T細胞表位的第一個和最后一個錨定殘基之間用該蛋白酶消化。
4.用任何現(xiàn)今的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)向目的蛋白中導(dǎo)入突變。
5.任選地，重新分析修飾的分子以證實在所希望的區(qū)域失去蛋白酶敏感性并且該肽與MHC II類結(jié)合而被呈遞于細胞表面的能力降低。
在可檢測到多個重疊T細胞表位的情況下特別優(yōu)選上面的方法。根據(jù)上面方法的步驟3，由此在某個定義的表位的第一個和最后一個錨定殘基之間導(dǎo)入從頭加工位點，定義的要求可能是行不通的，除非已經(jīng)非常詳細的繪出了足以可以鑒定關(guān)鍵的九堿基序列的表位圖。實踐中，應(yīng)該考慮許多MHC II類同種異型(特別是HLA DR)，一種同種異型的nonomer序列可能“逃避”與結(jié)合同樣的表位具有類似同種異型特異性的nonomer序列的登記，在長度超過9個殘基的序列中可以定義一系列重疊nonomer。在這種情況下，在步驟3中定義的從頭切割位點可能落在表位第一個和最后一個錨定殘基之間的區(qū)域的外面，然而切割仍然導(dǎo)致通過MHCII類的肽呈遞的喪失。認為這種突變改變在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在另外一個實施方案中，關(guān)于目的蛋白中蛋白水解加工位點的信息本身是有用的數(shù)據(jù)，可用于預(yù)測可能結(jié)合HLA-DR、DQ或DP的肽。如上所描述的，T細胞表位預(yù)測算法和重疊肽文庫中能結(jié)合HLA-DR、DQ或DP分子的肽的選擇將幾乎不可避免的導(dǎo)致T細胞表位數(shù)目的過多預(yù)測。當(dāng)預(yù)測潛在T細胞表位含有被參與MHC II類加工途徑的蛋白酶切割的識別基元時，在自然界中發(fā)現(xiàn)該表位的機會減少了，所以不必從目的蛋白中除去該表位。同樣，當(dāng)預(yù)測潛在T細胞表位兩側(cè)沒有蛋白酶識別位點時，這個表位從蛋白中切除并被呈遞到抗原呈遞細胞表面的機會減少了，所以不必從目的蛋白中除去該表位。
根據(jù)本發(fā)明的這個進一步的實施方案，優(yōu)選的靶定以除去的關(guān)鍵T細胞表位的方法如下1.測定給定目的蛋白的序列。
2.預(yù)測序列中潛在的T細胞表位。
3.仔細檢查所有潛在的T細胞表位以確定在結(jié)合區(qū)中存在的基元能夠被參與MHC II類蛋白水解途徑的蛋白酶識別。
4.認為所有發(fā)現(xiàn)在潛在T細胞表位的N末端或C末端10個氨基酸中含有蛋白酶切割位點的潛在T細胞表位對于表位去除都是關(guān)鍵的。認為所有缺乏這些基元的潛在表位都是較不關(guān)鍵的，并且可以從需要從目的蛋白中除去的表位組中排除。
本發(fā)明涉及降低治療蛋白免疫潛能的方法，通過第四種通用方法也可以達到該目的，該方法包括這樣一個實施方案，即在治療多肽氨基酸殘基序列的一個或多個特定區(qū)域?qū)ζ溥M行修飾。該修飾可以是替代、缺失或加入一個氨基酸殘基，這種修飾的結(jié)果是改變了關(guān)鍵HLA-DM催化反應(yīng)的效率，在該反應(yīng)中加工的肽表位和MHC II類結(jié)合溝結(jié)合。
盡管HLA-DM催化的表位的肽交換的主要決定簇是該肽對HLA-DR的親和力，但是越來越多的證件表面不決定對HLA-DR結(jié)合親和性的氨基酸殘基也對交換反應(yīng)有影響。已經(jīng)表明用合成肽進行的與HLA-DR-CLIP的體外肽交換反應(yīng)中HLA-DM的存在對置換CLIP肽的選擇有很大影響。Lightstone等[Lightstone等(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA949255-9260]比較了正常Ii-、HLA-DM-和HLA-DM/Ii-抗原呈遞細胞表面上自身肽的表達，注意到有或沒有HLA-DM表達的呈遞于細胞上的肽陣列中的顯著的差異。Kropshofer等[Kropshofer等(1996)；EMBO J.156144-6154]用親和純化方法從EBV-轉(zhuǎn)化的類淋巴母細胞中得到了HLA-DR分子(DR2和DR3同種異型)并在有或沒有HLA-DM的情況下，在pH5孵育這些分子16小時。將保持復(fù)合的肽洗脫下來并用質(zhì)譜分析。當(dāng)比較光譜時，明顯發(fā)現(xiàn)一些肽被HLA-DM有效地除去，而另一些肽不受影響。在另一個實驗中，當(dāng)原先從HLA-DR1洗脫的6種不同的自身肽的混合物進行結(jié)合分析測試時，在沒有DM時它們中的5種有效結(jié)合DR1，存在DM時，只有兩種保持結(jié)合。從這些及其他實驗得出這樣一個觀點HLA-DM可能起肽編輯器的在于，它選擇某些肽的亞群呈遞于細胞表面。很明顯除了這些肽對HLA-DR的親和力，一些其他因素也起作用復(fù)合物的動力學(xué)穩(wěn)定性。雖然穩(wěn)定性和親和力是相關(guān)的(KD＝Koff/Kon)，但是Koff對HLA-DM催化的交換反應(yīng)的效率有深遠的影響。這可通過CLIP肽來例證，該肽具有異常高的Kon和高koff。因此，親和力相對較高，但穩(wěn)定性(在DM存在時)卻較低。這樣HLA-DM的角色可描述為動力學(xué)校正型。
已經(jīng)進行了多種嘗試來分析潛在表位一些位置的哪些氨基酸將影響HLA-DM催化的交換反應(yīng)的效率。Kropshofer等[Kropshofer等(1996)；EMBO J.156144-6154]分析了HA肽錨定位置(307-319)的突變對體外結(jié)合HLA-DR1的影響。1位錨定殘基的絲氨酸非常適于結(jié)合溝的第一個口袋。用天冬氨酸替換使得不能結(jié)合。在該位用甲硫氨酸或纈氨酸替換后仍然結(jié)合良好，但是在HLA存在時結(jié)合減弱。所以可以選擇抗HLA-DM的錨定位置的(亞)最優(yōu)殘基。對口袋9位殘基也進行了類似的觀察。在口袋6中觀察到適度相反的效果HLA-DM能使不利于其不存在的殘基結(jié)合。HLA-DM還選擇抗少于11個氨基酸的表位，反映了自然界中發(fā)現(xiàn)的DR-結(jié)合肽的大小。
Raddrizzani等[Raddrizzani等(1999)；Eur.J.Imnunol.29，660-668]表明(合成)肽最可能被富含甘氨酸和脯氨酸殘基的HLA-DM體外從HLA-DR釋放出來?？赡艿慕忉屖歉拾彼岷透彼釋﹄牡亩壗Y(jié)構(gòu)有相對較大的影響。實際上，當(dāng)將對HLA-DR1有高親和力的肽與甘氨酸或脯氨酸或者導(dǎo)入或者除去的變異肽相比較時，觀察到體外HLA-DM催化的交換反應(yīng)的顯著影響。
將前述作為本發(fā)明另一個重要的實施方案進行了介紹，在該實施方案中有一種修飾多肽的方法，該修飾使得一種或多種從多肽抗原加工而來的肽被阻止參與HLA-DM催化的肽交換反應(yīng)或者至少參與反應(yīng)的能力下降。這可通過突變目的蛋白使得能結(jié)合HLA-DR、DQ和DP的一些肽在該交換反應(yīng)中失利。
在本發(fā)明該實施方案下的一般性方法如下1.確定給定目的蛋白(部分)序列。
2.鑒定可能結(jié)合HLA-DR、HLA-DQ或HLA-D分子的肽。
3.在這些(潛在的)T細胞表位中設(shè)計突變，該突變將降低HLA-DM催化的和HAL-DR-CLIP復(fù)合物的交換反應(yīng)的效率。
4.用現(xiàn)今標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)向目的蛋白中導(dǎo)入突變。
可以在(潛在的)T細胞表位的任何位置進行降低HLA-DR催化的和結(jié)合HLA-DR復(fù)合物的CLIP肽的交換反應(yīng)效率的突變。這包括可能結(jié)合在HLA-DR抗原結(jié)合溝的口袋中的位置。這些位置的某些突變可能不影響肽對HLA-DR的親和力，但是可能降低HLA-DR催化的交換反應(yīng)的效率。此外，某些突變可以在非錨定位置進行。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，并且作為操縱肽序列以影響HLA-DM催化的交換反應(yīng)的備選方案，可以通過操縱或模擬HLA-DM或HLA-DO分子自身改變這種交換。例如，通過外源HLA-DO(或其模擬物)的胞吞作用或通過導(dǎo)入編碼HLA-DO的基因或通過活化停留HLA-DO基因?qū)LA-DO分子或模擬HLA-DO作用的其他分子導(dǎo)入APC而不是B細胞(如果它們存在的話)。實踐中可以修飾(如通過氨基酸的改變)這些HLA-DO分子，該修飾改變HLA-DO pH依賴的行為使得例如，該分子可能在pH5或更低的pH下抑制HLA-DM活性從而阻礙HLA-DM催化的肽的交換。類似地，可以向APC中導(dǎo)入HLA-DM分子或其他模擬HLA-DM作用的分子以提高肽交換的效率，或者通過對HLA-DM進行合適的修飾來抵抗HLA-DO的抑制作用或者改變被HLA-DM結(jié)合的肽的特異性或者改變HLA-DM的pH敏感性。這樣，操縱或者模擬HLA-DO或HLA-DM能夠增強特定肽在HLA-DP、DQ或DR上的呈遞或者減弱/除去這種呈遞。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，可以在臨近或者在特定HLA結(jié)合肽中包括特異性蛋白酶識別位點，使得該蛋白酶位點對于不同APC中的切割具有不同的敏感性。通過該方法，肽可以被特定APC從蛋白序列中優(yōu)先釋放出來以影響從接下來的在APC上的肽的呈遞從而影響T細胞應(yīng)答。例如，和巨噬細胞中通過相同蛋白的加工誘導(dǎo)的細胞應(yīng)答相比，從樹突細胞優(yōu)先釋放的肽(例如通過優(yōu)先包含側(cè)翼組織蛋白酶S位點)可能誘導(dǎo)不同類型的細胞應(yīng)答(例如TH1偏向的)。這樣，由相同蛋白誘導(dǎo)的TH0、TH1和TH2應(yīng)答的平衡可能被明智地包含側(cè)翼或內(nèi)部蛋白酶位點所影響。類似地，不同APC中蛋白酶的不同模式可被用來影響APC中肽的運輸。擾亂APC表面肽呈遞動力學(xué)的一個特別有利的方案是在治療性多肽抗原中提供肽序列，這些序列通過它們的序列和豐度能夠通過MHC系統(tǒng)優(yōu)先呈遞于外表面。為此，這些優(yōu)先呈遞的肽將勝過那些存在于抗原蛋白中的其他肽，這樣那些肽將不能被用來啟動免疫應(yīng)答。這種方法有用性的關(guān)鍵是優(yōu)先呈遞的肽本身不能誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，在該方案的設(shè)計中暗含使用自身肽抗原，即來自宿主生物的肽，該生物對該肽具有高水平的免疫耐受性。
除了需要自身耐受序列，可被定義為“免疫抑制”的、在該方案中有效的肽還應(yīng)該具有對寬范圍的MHC、優(yōu)選HLA-DR同種異型由高親和性，在HLA-DM存在時還具有高的動力學(xué)穩(wěn)定性的特征。具有上面提到的特征的肽定義為自身肽SP3，其單字母密碼序列為AILEFRAMAQFSRKTD。
在本發(fā)明方案中，SP3或功能等價的肽序列被連接到治療性目的蛋白的C末端和/或N末端。優(yōu)選在肽的每側(cè)連接有一個識別基元，該基元被參與MHC II類加工途徑的蛋白酶如表1所描述的任何或更多的蛋白酶所識別。該肽可以串連重復(fù)連接到治療蛋白的N和/或C末端。設(shè)計該構(gòu)建體的方法在本領(lǐng)域中可容易地得到，可以設(shè)想具有任何數(shù)目重復(fù)單元特征的結(jié)構(gòu)并且這些結(jié)構(gòu)都位于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種熱塑性模塑組合物，包含A)10-97重量％的不同于聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)的至少一種聚酯a1)，它含有以100重量％A)為基礎(chǔ)計的1-50重量％的PET a2)，B)1-30重量％的阻燃性結(jié)合物，由基于100重量％B)計的以下組分組成b1)20-99重量％的含鹵素的阻燃劑，和b2)1-80重量％的氧化銻，C)0.01-5重量％的KH2PO4或LiH2PO4，或它們的混合物，D)0.01-3重量％的防滴劑，和E)0-70重量％的其它添加劑，其中組分A)至E)的重量百分比的總和是100％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的熱塑性模塑組合物，其中組分a1)是由在烷基結(jié)構(gòu)部分中具有2-10個碳原子的聚對苯二甲酸亞烷基二醇酯組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所要求的熱塑性模塑組合物，包含1-50重量％的纖維狀或顆粒狀填料E)，或它們的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物，其中b2)是由三氧化銻或五氧化二銻或它們的混合物組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物，其中組分b2)是以在熱塑性塑料中的母料形式添加。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所要求的熱塑性模塑組合物，其中該熱塑性塑料是聚烯烴。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物，其中組分D)是由具有基于D)計55-76重量％的氟含量的乙烯聚合物組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物用于生產(chǎn)纖維、膜或模制品的用途。
9.可從根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物獲得的模制品。
10.可從根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項所要求的熱塑性模塑組合物獲得的線圈罩，線圈架，線圈支撐體，電容器凹槽，插塞接頭，多點連接器，旋塞橋，芯片載體，印刷電路板，燈部件，燈座，起動機殼，變壓器殼體，電池組殼體，冷卻風(fēng)扇輪，冷卻風(fēng)扇輪的殼體，燈插頭，燈的防護罩，燈架，照明開關(guān)，小型電氣裝置，衣服熨斗的殼體，轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，斷路器，充電器，塞孔，馬達的組件，發(fā)電機的組件，或輸出終端拉絲。
全文摘要
本發(fā)明涉及熱塑性塑料模塑組合物，包含A)10－97重量％的不同于聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)的至少一種聚酯a1)，它含有以100重量％A)為基礎(chǔ)計的1－50重量％的PETa
文檔編號C08K7/02GK1524111SQ02813543
公開日2004年8月25日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月5日
發(fā)明者M·格普雷格斯, M 格普雷格斯 申請人:巴斯福股份公司