專利名稱：五環(huán)三萜烯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及含五環(huán)三萜烯的植物保護組合物及其使用方法。
背景植物的外層例如葉子的角質(zhì)層，果皮，以及莖皮保護植物免受擦傷，防止水分損失，也抵卸病原微生物。穿透植物的角質(zhì)層是病原體能夠進入植物內(nèi)部組織的前提。
植物對發(fā)病的早期階段自然地保衛(wèi)自已的機理還沒有完全了解。真菌繁殖體附著于寄主植物的最初過程基本是致病的成功確立。空中的真菌病原體牢牢地粘于非常疏水的表面這一事實暗示疏水力與附著過程有關(guān)。
空中的真菌病原體的附著包括外細胞粘液或粘著劑的分泌的活動過程，它可以在與寄主接觸后幾分鐘之內(nèi)開始。在粘著分泌液中已報告的其它組分包括酶，其中有酯酶和角質(zhì)酶。鄰近于分生胞子和在分生胞子下面的角質(zhì)層蠟的擦傷可在液體釋放的20分鐘內(nèi)觀察到。附著胞的胚芽管的生長僅出現(xiàn)在液膜沉積的區(qū)域。
一些研究已經(jīng)提出，感染區(qū)的準備包括由葉面病原菌主動溶解寄主的角質(zhì)層。也認為這種溶解是這些酶的目的。Nicholson，R.L.，和L.“真菌孢子和在植物與動物中的病害發(fā)生”(The Fungal Sporeand Disease lnitiation in Plants and Animals)，Eds.Cole，G.T.，和Hoch，H.C.，1991 Plenum Press，New Youk，3-23。因此，在病害發(fā)展的相繼階段出現(xiàn)之前，角質(zhì)層必須被進攻的病原體所滲透。除了酶的降解外，一些真菌孢子用感染結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的機械力幫助它們自己。(Kller，W.“真菌孢子和在植物與動物中的病害發(fā)生”(The Fungal Spore and Disease Initiation in Plants andAnimals)，Eds.Cole，G.T.，和Hoch，H.C.，1991 Plenum Press，New York，219-246)。
五環(huán)三萜烯(PT)是在最普通的植物次代謝物中，但是它們在植物中的功能還沒有被了解。它們通常被富集于最外層，例如植物的角質(zhì)層，果皮和莖皮。在一些情況下，這些表層含有非常高濃度的五環(huán)三萜烯。例如，每個蘋果的果皮含有大約0.1g熊果酸，百樺的外莖皮含有高達40％(重量/重量)的樺木腦。在芬蘭，每年從木材加工工業(yè)的白樺莖皮廢液可得到的樺木腦的量估計約15萬噸。目前，廢莖皮是用作能源生產(chǎn)的低價值的燃料。Jskelinen，P.(1981)Pap.Puu 63，599-603。
文獻提供了許多能被PT抑制的酶的實例，表明PT以非特定方式廣泛作用于多種靶標的能力。參見例如，(a)Büchler et al.(1991)Biochem.Biophys.Acta 1075，206-212，甾族化合物和三萜系化合物對大鼠腎的11-羥甾脫氫酶的抑制；結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系；(b)Kochet al.(1994)Phytother.Res.8，109-111，一組甾族和三萜系化合物在活體外對腺苷脫氨酶的抑制；(c)Najid et al.(1992)FEBS299，213-217，熊果酸的特征，采用巨噬細胞，血小板和辨別的HL60白血細胞作為脂肪氧合酶的環(huán)加氧酶抑制劑；(d)Pengsuparp et al.(1994)J.Nat.Prod.57，415-418，從Maprounea africana得到的五環(huán)三萜烯是HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的強抑制劑；(e)Simon et al.(1992)Biochem.Biophys.Acta 1125，68-72，從石南屬植物的花(Calluna Vulgaris)分離的熊果酸對脂肪氧合酶活性和HL60白血細胞增殖的抑制；(f)Ying et al.(1991)Biochem.J.277，521-526，熊果酸對人的白細胞彈性蛋白酶的抑制。關(guān)于五環(huán)三萜烯結(jié)合點的證據(jù)，這些文獻各自披露的內(nèi)容合并于此作為參考。
在植物組織培養(yǎng)中，由非活化的真菌或真菌酶誘發(fā)的應(yīng)力已被用于增加生物活性的次代謝物的產(chǎn)量。在幾種情況下已經(jīng)報道這個真菌的引出導(dǎo)至過多生產(chǎn)五環(huán)三萜烯，代替了其它一些預(yù)期的代謝物。在Yander Heijden et al.，(1988)Plant Cell Rep.7，51-54中給出了適當?shù)膶嵗?，通常產(chǎn)生吲哚生物堿的Tabernaemontana spp.的組織培養(yǎng)受到了由真菌，細菌或酶，纖維素酶或果膠酶誘發(fā)的應(yīng)力。有應(yīng)力時，該培養(yǎng)產(chǎn)生了高達3位于正常量的熊果烷型(ursanetype)五環(huán)三萜烯(2％的干物質(zhì))，但是不增加存在的吲哚生物堿的產(chǎn)量。
用Candida albicans引出物處理的Taberna emiontanadivaricata的其它試驗導(dǎo)致產(chǎn)生一系列的熊果烷型和齊墩果烷(oleane)型的五環(huán)三萜烯，并伴隨抑制生長和吲哚生物堿的積累(van der Heijden et al.，(1989)Phytochemistry 28，2981，2988)。
通常為強細胞毒性的二萜的來源的Triterygium wilfordii的組織培養(yǎng)，在真菌葡萄孢屬引出物的應(yīng)力下戲劇性地增加了齊墩果烷型五環(huán)三萜烯的產(chǎn)量，而不是二萜，這促使人們得出結(jié)論，只有三萜烯是可誘導(dǎo)的抗微生物的植物抗毒素。Kutney，et al.，(1993)來自通過真菌引出的Tripterygium wilfordii細胞懸浮培養(yǎng)的抗炎齊墩果烷三萜烯。Plant Cell Rep.12，356-359。
已經(jīng)受到真菌和細菌進攻的闊葉和窄葉植物的常規(guī)處理是在突然蔓延出現(xiàn)后進行的。然后用一種或多種市售的合成的接觸性抗微生物噴霧液，以不產(chǎn)生藥害的施用量處理受危害的植物。有效處理量必須與傷害化學(xué)品處理植物的風(fēng)險相平衡，而這些化學(xué)品在結(jié)構(gòu)上與植物生理學(xué)方面和因素?zé)o關(guān)。希望有這樣的植物保護劑，它能有效地抵御微生物病原體，又能以類似于植物自然防御機理的方式工作，以減少藥害的風(fēng)險。與處理疏水性葉面相關(guān)的問題之一是材料的有效應(yīng)用。當前的噴霧技術(shù)導(dǎo)致一部分噴霧材料直接落到地上，或施藥后被很快出現(xiàn)的兩水沖洗掉。這兩種情況都增加了對環(huán)境的污染。
通過噴霧施用的保護劑應(yīng)在植物表面上保留一段足以發(fā)揮它們的功能的時間。因此，對紫外光和可見光的穩(wěn)定性是葉面處理所關(guān)注的。為此應(yīng)該開發(fā)能抵抗因暴露于紫外光以及可見光引起的降解的葉面施用殺菌劑。
而且已經(jīng)知道，侵襲的有機體會通過抗性品系的突變和繁殖來躲避處理劑的作用。這種發(fā)展的抗性在經(jīng)濟上是有害的，因為它逼迫去發(fā)現(xiàn)新的處理劑。提供突變的病原體不能躲避的植物抗感染劑是有幫助的。
本發(fā)明的概要本發(fā)明的一個目的是提供一種以與天然植物防御機理一致的成分，保護植物表面抵卸微生物病原體的組合物及其使用方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種對環(huán)境、人類，或益蟲產(chǎn)生低風(fēng)險的組合物和使用方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供突變的病原體所產(chǎn)生的抗性不能躲避的植物抗感染劑。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種對紫外光暴露，長期貯存的降解具有良好的抵抗性和對植物表面具有良好的固有粘著能力的組合物。
本發(fā)明的這些和其它目的，根據(jù)在此的說明將是顯而易見的本發(fā)明的組合物包括一種五環(huán)三萜烯或五環(huán)三萜烯的混合物，它包括一些特別富含五環(huán)三萜烯的植物萃取物，具有由式I，II或III的任一種所描述的主要組分化合物。
本發(fā)明的方法包括將有效量的，含五環(huán)三萜烯或式I，II或III任一種所示的五環(huán)三萜烯混合物的組合物施用于植物表面。
式I，II和III是 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，or CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，or NY1-X-OY1；條件是R2和R3之一是H或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，直鏈或支鏈的1-30個碳原子的烷基，3-30個碳原子的環(huán)烷基，3-30個碳原子的鏈烯基，4-30個碳原子的氧烷基，7-30個碳原子的苯基烷基，或7-30個碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此處m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此處p＝1-22。
本發(fā)明提供了一種能在被處理的植物表面特別有效地防止空氣傳播的真菌和細菌病害的爆發(fā)的組合物及其使用方法。組合物和五環(huán)三萜烯被施用并在植物表面形成薄膜。這層材料膜防止空中真菌病原體的預(yù)先侵襲和植物角質(zhì)層的滲透。另外，這些化合物無藥害，是與植物的延期防衛(wèi)相一致的。
詳細說明本發(fā)明涉及含有式I，II或III的五環(huán)三萜烯的組合物及其使用方法 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，or CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，or NY1-X-OY1；條件是R2和R3之一是H或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，3-30個碳原子的環(huán)烷基，3-30個碳原子的鏈烯基，4-30個碳原子的氧烷基，7-30個碳原子的苯基烷基，或7-30個碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此處m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此處p＝1-22。
優(yōu)選的五環(huán)三萜烯包括樺木腦，樺木酸，熊果酸，石竹素，樺木腦單-和雙-二酸酯或戊二酸酯，及其聚乙二醇衍生物。
對人類白細胞彈性蛋白酶的IC50值的濃度小于大約15微摩爾(μM)，更優(yōu)選IC50值小于大約1O，和最優(yōu)選IC50值小于大約8微摩爾的五環(huán)三萜烯是特別有用的。IC50值代表抑制劑的濃度，它可用每升微摩爾數(shù)來表示，此時酶的活性降低50％。因此，較低的IC50值意味著較高水平的酶抑制活性。
本發(fā)明的五環(huán)三萜烯是與衍生的，合成的，或在植物外表面葉，果，莖皮中天然發(fā)現(xiàn)的那些相同的，都可抑制包括角質(zhì)層的酶降解的致病。本發(fā)明，為了提高噴霧層的物理特性，將五環(huán)三萜烯或其衍生物與適當?shù)妮d體例如水，含水的成膜溶液，洗滌劑，乳液形成添加劑，適當?shù)木酆衔镆黄鹗┯糜诒┞兜闹参锿獗砻妗?br> 五環(huán)三萜烯可以通過采用適合于三萜烯的一種或多種有機溶劑，萃取含五環(huán)三萜烯的植物組織而得到。優(yōu)選的PT的植物組織源包括白樺樹的莖皮，蘋果皮，和屬于鳥飯樹屬與肉豆蔻屬植物的葉子。可用的萃取溶劑包括乙酸乙酯，丙酮，甲乙酮，乙醇，丙醇，異丙醇，甲醇，二氯甲烷，氯仿，或它們的混合物。
為了作為在被處理植物表面的均勻包衣的應(yīng)用，應(yīng)該把本發(fā)明的五環(huán)三萜烯或它們的聚乙二醇衍生物從非結(jié)晶態(tài)變成充分混合的膠體懸浮液。除了通過液體劑型的常規(guī)噴霧裝置不能到達的下表面或隱蔽區(qū)域外，均勻的包衣有助于保證很好地保護植物表面抵抗病原體。
本發(fā)明的五環(huán)三萜烯是疏水性的結(jié)晶固體。這些固體可被溶解在許多適合農(nóng)業(yè)使用的溶劑中。如果需要，為了裝運和貯存可以制備五環(huán)三萜烯的溶液或膠狀的濃液劑。然后由加工者或施用者在使用時進一步稀釋這種濃液劑。
用于五環(huán)三萜烯固體的優(yōu)選溶劑含有大約1-25％(重量計)的丙酮，大約0-10％(重量計)的二甲基亞砜(DMSO)，0-35％的脂肪酸的聚乙二醇酯，和大約0-25％(重量計)的表面活性劑，例如市售洗滌劑如Tween 80TM或PalmoliveTM洗碟洗滌劑。一般，這種溶劑混合物可以配成PT是1500-4000％(重量計)的濃度，這是施用于植物所需要的。
濃液劑可用農(nóng)業(yè)上可接受的載體，優(yōu)選是水進一步稀釋成100-4000％，優(yōu)選300-1000％(重量計)的濃度，以制得根據(jù)本發(fā)明的可噴霧組合物。特別有用的濃度是在每加侖水大約7-30克的范圍內(nèi)。充分的混合僅要求低至中等的剪切，以保證在稀釋過程中濃液劑的充分混合。例如，計量濃液劑進入附屬于文丘里混合器的貯液器，混合器提供充分的剪切以使?jié)庖簞┡c另加的水完全混合。
根據(jù)本發(fā)明的五環(huán)三萜烯或它們的聚乙二醇衍生物按足以防止病原體感染的量被施用。PT的抑制特性被植物用于使真菌孢子分泌的酶失去活性以便降解植物角質(zhì)層。有效保護的適宜施用量包括在大約0.1-1000kg/h范圍內(nèi)的用量。優(yōu)選施用量在大約0.1-100kg/h范圍內(nèi)。對于在特殊地區(qū)特別類型的植物，最好的特定施用量是容易通過本領(lǐng)域普通技巧的應(yīng)用來確定的?？墒?，應(yīng)該設(shè)計施藥落在并覆蓋于被處理植物暴露的葉面上，正如采用常規(guī)葉面噴霧裝置作常規(guī)葉面處理時所出現(xiàn)的情況。
如果需要，PT或它們的聚乙二醇衍生物可與一種或多種惰性成分或活性成分一起施用。舉例的材料包括染料，影響濃液劑穩(wěn)定性的添加劑和影響噴霧層物理特性的添加劑，葉面肥，殺菌劑和殺蟲劑。
實際上可以用根據(jù)本發(fā)明的組合物有益地處理任一種可通過蠟角質(zhì)層被侵染的植物。有益的商品化植物包括谷物(例如里麥，小麥和大麥)，番茄，豆，胡椒，小麥和花生。
特別是谷物可從本發(fā)明得到好處。這些植物一般不產(chǎn)生足夠水平的五環(huán)三萜烯，用以阻止入侵微生物的酶的進攻。這些植物的天然病原體一般不適應(yīng)于產(chǎn)生足夠量的酶去克服外部施用的五環(huán)三萜烯化合物的抑制作用。
對小蟲(如蚜蟲)的侵擾敏感的植物也可從本發(fā)明的處理得到好處。熊果酸對螨及其幸存者顯示有毒性和進食制止作用。螨的繁殖指數(shù)按在食物中熊果酸含量的比例降低，另外，對含熊果酸的食物的消化時間減少了大約30％(Varanda et al.，1992)。這些觀察資料暗示一種可能性，昆蟲的消化酶遭到熊果酸的損害。
PT抑制酶的模式不是特定的，主要是基于與酶的疏水領(lǐng)域的疏水相互作用。這個特性表明通過突變發(fā)展微生物病原體抗性的可能性是很小的。因為只要植物生存，病原體就必須涉及在植物角質(zhì)層中存在的PT，可以假設(shè)對PT的微生物的抗性已被優(yōu)化。用于植物保護的PT的基本劑型應(yīng)該有利于抵抗用酶去突破角質(zhì)層的病原微生物，例如真菌，細菌，線蟲和病毒。這些劑型也應(yīng)有利于抵抗小蟲，對它們的消化酶進行抑制。通過用含五環(huán)三萜烯的薄膜覆蓋葉面，可以提高角質(zhì)層的動防御特性，它可減少或完全防止病原體的成功滲透。
以下實例有助于理解本發(fā)明，但無意去限制附屬的權(quán)利要求的范圍。
實施例商品化的化合物可從Extrasyntheses(法國)，Aldrich，Sigma或ICN Pharmaceuticals購得。采用Reichert Thermovar熔點儀測得熔點并經(jīng)校正。采用Bruker WM-250或270核磁共振譜儀，在C5D5N中，用TMS作內(nèi)標(0.0ppm)得到Hnmr譜。采用帶Super-INCOS軟件和直接嵌入試探電極的Finnigan 4023 EI/CI GCMS質(zhì)譜儀得到質(zhì)譜。
實施例1a和1b 28-半丁二酰基樺木腦和3，28-雙-半丁二?；鶚迥灸X的合成實施例1a通過將咪唑(4當量)和丁二酸酐(1.08當量)溶解于N-甲基吡咯烷酮中制得反應(yīng)混合物。溶劑的體積是樺木腦重量的大約4.5倍。在兩種反應(yīng)試劑溶解時，加入樺木腦(1當量)。反應(yīng)混合物置于室溫中并偶爾搖動。大約48小時后，約92-95％的樺木腦已被轉(zhuǎn)變成28-半丁二?；鶚迥灸X，并帶有2-4％未轉(zhuǎn)化的樺木腦和二?；鶚迥灸X。
28-半丁二?；鶚迥灸X通過將反應(yīng)混合物倒入緩慢攪拌下的20倍體積的水中來純化。從固體殘留物輕輕傾倒出水，并用幾份新水重復(fù)洗滌。分出固體，干燥并溶解于氯仿和異丙醇的混合物中。蒸發(fā)除去氯仿，使28-半丁二酰基樺木腦產(chǎn)生和結(jié)晶。28-半丁二?；鶚迥灸X是白色的，熔點242-244℃。
對C34H54O5計算值，C，75.22％，H，10.03；實驗值C，75.0，H，9.91.The1Hnmr(DMSO-d6)給出峰在4.86和4.72(1H，s，each，CH2＝C)，4.57和4.14(AB型，J＝12Hz，OCH2O)，3.44(1H，t，J＝8.6Hz)，2.95(4H，s，CHOCH2CH2CO)，1.71，1.22，1.02，0.98，0.98，0.84(s，each，Me)；eims(m/z，rel.int.)524(20，[M-H2O]+)，424(15)，411(27)，207(38)，203(41)，189(100)，135(70)，119(61)，107(62)，95(81)，81(79)，55(90％)；cims543(11，M+)，525(64，[MH-H2O]+)，425(80)，407(100)，217(91)，203(90)，191(48)，和189(52％).
實施例1b將樺木腦443mg(1mmol)，咪唑227mg(4mmoles)，丁二酸酐400mg(4mmoles)和0.6ml甲基吡咯烷酮加到小玻璃瓶中。反應(yīng)混合物在70℃保持20小時。然后將反應(yīng)混合物滴加到100ml水中，并攪拌半小時。濾出所得沉淀，為了除去剩下的反應(yīng)劑，在另一份水中再懸浮和攪拌。該程序重復(fù)幾次，直到?jīng)]有反應(yīng)劑洗出為止。收集固體，干燥，溶于丙酮中。過濾丙酮溶液，蒸發(fā)得到470mg 3，28-雙半丁二?；鶚迥灸X。
對C38H58O8·H2O計算值，MW 642.84；C，70.5％，H，9.1％；實驗值C70.43％，H 9.15％.1H NMR4.70和4.61(1H，s，each，＝CH2)，4.52(1H，dd，J1＝5.4Hz，J2＝10.0Hz)，4.33和3.90(1H，d，AB型，J＝11.1Hz，OCH2)，2.63-2.71(8H，m，丁二酰基鏈)，1.70，1.05，0.99，0.87，0.86，和0.85(Me，s，each).MALDI-TOF-MS給出m/z 665(M＋Na+)和也m/z 542和525.
實施例2乙?；鶚迥舅岬暮铣蓪迥舅?00mg(0.22mmoles)加到在5ml CH2Cl2中含有4mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和0.5ml(CH3CO)2O的溶液中。2小時后，在真空中除去CH2Cl2，留下的殘留物與25ml水一起攪拌。攪拌過程中加入足夠的K2CO3分解過量的乙酸酐，此后，用25ml CH2Cl2萃取反應(yīng)混合物。萃取液蒸發(fā)至干，所得固體在CH3OH中結(jié)晶，得到104mg乙酰基樺木酸，為白色結(jié)晶，熔點285℃。
對C32H50O4計算值，C，77.06，H，10.10；實驗值C，77.02，H，10.08％.The1Hnmr(DMSO-d6)給出峰在4.93和4.76(1H，s，each，CH2＝C)，4.67(1H，dd，C3-H，J＝5.0，10.0 Hz)，2.05(s，CH3CO)，1.78，1.06，1.00，0.87，0.84和0.73(each，s，CH3)；eims(m/z，相對強度)499(1，MH+)，452(2)，438(38)，395(26)，189(40)，43(100％)；cims(m/z，相對強度)499(37，MH+)，440(27)，439(100)，437(18)，393 (20)，203(15)，191(24％).
實施例3 3-甲磺?；鶚迥舅岬暮铣蓪迥舅?00mg(0.22mM)溶解在5ml吡啶中，并用100mg(0.88mmoles)CH3SO2Cl處理。16小時后，在真空中除去吡啶，所得的殘留物懸浮在10ml水中。用NaHCO3水溶液分解過量的CH3SO2Cl，用10mlCH2Cl2萃取反應(yīng)混合物。蒸發(fā)溶劑得到含3-甲磺?；鶚迥舅岬拇之a(chǎn)品，再通過3g硅膠柱色譜提純，用含0-5％CH3OH梯度的CH2Cl2洗提。色譜提純的3-甲磺?；鶚迥舅釓腃H3OH中結(jié)晶得到62mg白色結(jié)晶，熔點210-2l2℃。
對C31H50O5S計算值C，69.62，H，9.42，S，6.00；實驗值C，69.78，H，9.46，S，5.90％.1Hnmr(DMSO-d6)4.95和4.78(1H，each，s，CH2＝C)，4.50(1H，dd，J4.6，11.8Hz)，3.30(3H，s，CH3SO2)，1.79，1.07，1.06，1.00，0.82，0.72(each，s，CH3)；eims(m/z，相對強度)438(9)，423(11)，395(72)，259(12)，161(26)，135(62)，121(100)，107(60)，93(61)，79(54％)；cims(m/z，相對強度)535(11，MH+)，439(91)，423(25)，395(52)，249(12)，203(28)，191(34)，97(100％).
實施例43-甲磺酰基樺木酸甲酯的合成將樺木酸甲酯500mg(1.06mmoles)和320mg(3.3mmoles)(CH3)3N溶解在10ml CH2Cl2中。在冰浴中冷卻該溶液并用190mg(1.7mmoles)CH3SO2Cl處理。然后令反應(yīng)混合物升至室溫并放置過夜。真空中蒸發(fā)溶劑，留下殘留物，再將它溶解在10ml(C2H5)2O中，并用5ml水洗3次。醚層用MgSO4干燥，過濾，蒸發(fā)得到582mg3-甲磺?；鶚迥舅峒柞?。從C2H5OH中重結(jié)晶得到結(jié)晶，熔點190℃。
對C32H52O5S計算值C，70.03，H，9.55，S，5.84；實驗值C，69.85，H，9.50，S，5.65％.1Hnmr(DMSO-d6)4.89和4.73(1H，each，CH2＝C)，4.47(1H，dd，C3-H，J＝2.5，12.5Hz)，3.70(s，OCH3)，3.29(s，CH3SO2)，1.72，1.04，0.99，0.92，0.81，0.72(s，each，CH3)；eims(m/z，相對強度)452(9)，409(14)，341(8)，273(15)，255(12)，189(100)，175(47)，121 (72)，107(72)，93 (76)，79(85％)；cims(m/z，相對強度)549(16％，MH+)，453(100)，393(19)，203(13)，189(12)，97(80％).
實施例5 24-彈性蛋白酶抑制采用人類白細胞彈性蛋白酶(HLE)進行的研究表明，帶有羽扇豆烷、齊墩果烷和熊果烷骨架的許多普通天然存在的PT在低微摩爾濃度下能抑制HLE。為了探索結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，采用合成方法制備了幾個這些PT的衍生物，在試驗時，它們也抑制HLE。對于所試驗的化合物，從HLE抑制得到的抑制常數(shù)值IC50列于表1。
混合原料溶液產(chǎn)生pH為7.5的在0.1M Tris，0.5M NaCl和3％DMSO(體積/體積)中含有0.5mM Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Sigma)和0.7μmg/ml人類白細胞彈性蛋白酶(ElastinProducts)的反應(yīng)混合物。試驗化合物溶于DMSO中?；旌系润w積的酶和抑制劑，并令其在室溫培養(yǎng)15分鐘。通過加入第3份等體積的基質(zhì)使反應(yīng)開始。反應(yīng)在微升盤中進行。在405nm，在Dynatechmicroelisa Reader M600中監(jiān)測對硝基苯胺的出現(xiàn)。比較在存在和不存在試驗化合物情況下的最初速度以測定在表1中所報告的IC50值。
表1實施例號 化合物名稱 IC50(μM)5 羽扇醇8.46 羽扇醇乙酸酯 14.97 樺木腦5.08 28-丁二酰基樺木腦 6.39 樺木酸3.310樺木酸甲酯5.711乙?；鶚迥舅? 7.0123-酮基樺木酸 11.013甲基磺?；鶚迥舅? 11.2143-甲基磺酰基樺木酸甲酯7.315β-香樹素 5.416山楂醇4.517熊果酸7.718熊果酸，甲酯 4.919α-香樹素 21.120齊墩果酸 18.721齊墩果酸，甲酯8.522合歡酸21.123常春(藤苷)酸基16.824葳嚴仙根堿酸基(Caulophyllogenin) 0％@ 21°用熊果酸和齊墩果酸進行的進一步試驗表明，這些化合物也可以抑制其它酶，例如血纖維蛋白溶酶和尿激酶。在血纖維蛋白溶酶試驗中，在22μM測定的抑制值，對熊果酸是43％，對齊墩果酸是25％，而在尿激酶試驗中，對熊果酸是83％，對齊墩果酸是40％。對于樺木酸，在以下試驗中所測定的IC50值是凝血酶2.3，胰蛋白酶8.5，血纖維蛋白溶酶6.2和尿激酶5.0μM。在所試驗的酶中明顯缺乏專一性和在0.1％清蛋白存在下抑制停止的觀察結(jié)果表明抑制是非特定的結(jié)合于蛋白造成的。因此，PT看來是非共價地結(jié)合于酶的疏水領(lǐng)域，要么阻塞通往酶作用點的通路，或是引起構(gòu)型的改變，兩者都導(dǎo)致酶無力去完成它的功能。
所研究的一組PT的大多數(shù)強抑制劑都含有1-3個氧化的取代基，例如羥基或羧基。這些部分為化合物的總的抑制作用出了力。
實施例25殺菌活性番茄，蠶豆，胡椒，小麥和花生在溫室中生長1～3周(取決于品種)。每個品種取2盆，代表2個重復(fù)，放在一塊平地上，以使每塊平地上都有一種化合物噴霧的所有植物品種。用所需要的噴霧溶液或標準殺菌劑噴霧每塊平地上的植物至流掉藥液。作對照，用水噴霧對照的植物。讓這些植物空氣干燥2-3小時。植物干了以后，按植物品種把它們分類、成組。
表2列出了實施例25-28的組合物保護疏水植物表面的能力。
表2實施例 材料25對照媒介物含有丙酮18ml，二甲基亞砜4ml，和PalmoliveTM洗滌劑200mg.以3％水溶液試驗2640mg樺木腦溶解在1.5ml媒介物中，并加入98.5ml水2780mg樺木腦，3.0ml媒介物和97ml水2840mg熊果酸，2.0ml媒介物和98ml水植物病原真菌致病疫霉(Pi)，早期枯萎病菌(As)，灰霉病菌(Bc)和落花生尾孢(Ca)生長在實驗室里適當?shù)慕橘|(zhì)上。從每種真菌收取接種物，將濃度調(diào)整到預(yù)先確定的水平。專性的植物病原真菌(小麥白粉菌，小麥隱匿柄銹菌)在溫室中從它們的寄主收取，將濃度調(diào)整到預(yù)先確定的水平。
用真菌接種物噴霧以前用試驗化合物處理過的植物，然后放入濕氣室中一段時間，發(fā)現(xiàn)這是發(fā)展每種病害的最適條件。培養(yǎng)后，將植物移到溫室，允許癥狀發(fā)展，并評價植物的病害強度。表3報告了作為兩個重復(fù)的平均值的病害防治百分數(shù)。
表3病害(％防治率)實施例 Pi Pv As Bc Sn Pr Eg25 8 藥害 5 12 0 0 026 0 0 173 0 0 027 40 037 0 0 028 65 藥害 8 33 0 0 029 33 0 12 12 0 0 0Pi致病疫霉；番茄晚疫病Pv葡萄生單軸霉；葡萄霜霉病As早期枯萎病菌；番茄早疫病Bc灰霉病菌；葡萄灰霉病Sn穎枯殼針孢(小麥穎枯病)Pr隱匿柄銹菌；小麥葉銹病Eh禾白粉菌；小麥白粉病在檢查由實施例25-29所完成的防治之后，改變了五環(huán)三萜烯和載體媒介物的濃度。表4列出實施例30-35的組合物，表5顯示在實施例30-35中，保護施用各材料后植物病害的防治百分率。表5中的結(jié)果是3次重復(fù)的平均值。
表4實施例材料30含0.35％Tween 80TM水溶液的載體媒介物31在100ml載體中200mg樺木腦32在100ml載體中400mg樺木腦33在100ml載體中800mg樺木腦34在100ml載體中400mg樺木腦表5病害(％防治率)實施例 PiPvAs Bc SnPrEgSm-p Sm-t307 043 940 0 0 50 3031 10 0471000 0 0 60 203273753 820 0 0 65 3033 60 063 970 0 0 50 30340 0 0 600 0 0 40 60Pi致病疫霉；番茄晚疫病Pv葡萄生單軸霉；葡萄霜霉病As早期枯萎病菌；番茄早疫病Bc灰霉病菌；葡萄灰霉病Sn穎枯殼針孢(小麥穎枯病)Pr隱匿柄銹菌；小麥葉銹病Eh禾白粉菌；小麥白粉病Sm-p小核盤菌；菌核病(花生上)Sm-t小核盤菌；菌核病(番茄上)正如從表5中所見，所施用的樺木腦量增加，一般會提高對敏感真菌的防治率。
權(quán)利要求
1.用于抑制酶在植物表面侵襲的組合物，它含有一種農(nóng)業(yè)上可接受的載體和一種有式I，II或III任一種結(jié)構(gòu)的五環(huán)三萜烯化合物。 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，orCH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，或NY1-X-OY1；條件是R2和R3之一是H，或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30個碳原子的烷基，3-30個碳原子的直鏈的或支鏈的環(huán)烷基，3-30個碳原子的鏈烯基，4-30個碳原子的氧烷基，7-30個碳原子的苯基烷基，或7-30個碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此處m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此處p＝1-22。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜烯有式I的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜烯有式II的結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜烯有式III的結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜烯選自羽扇醇，樺木腦，28-半丁二?；鶚迥灸X，樺木酸，香樹素，山楂醇，熊果酸及其甲酯。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜稀化合物選自羽扇醇，樺木腦，28-丁二酰樺木腦，和28-丁二酰基樺木腦的甲酯。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜稀是樺木腦。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜稀是熊果酸。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的五環(huán)三萜稀選自樺木酸聚丙二醇酯；熊果酸聚丙二醇酯；石竹素聚丙二醇酯；28-半丁二?；鶚迥灸X聚丙二醇酯；3，28-雙半丁二酰基樺木腦二聚丙二醇酯；28-聚丙二醇-樺木腦醚；和3，28-雙(聚丙二醇)-樺木腦二醚。
10.保護植物抵抗真菌侵襲的方法，其過程包括將載體和有效量的含有一種式I，II或III結(jié)構(gòu)的五環(huán)三萜烯的組合物施用于暴露的植物表面 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，orCH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，或NY1-X-OY1；條件是R2和R3之一是H，或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30個碳原子的烷基，3-30個碳原子的直鏈的或支鏈的環(huán)烷基，3-30個碳原子的鏈烯基，4-30個碳原子的氧烷基，7-30個碳原子的苯基烷基，或7-30個碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此處m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此處p＝1-22。
11.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括含有式I結(jié)構(gòu)的五環(huán)三萜烯化合物的組合物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括施用含有式II結(jié)構(gòu)的五環(huán)三萜烯化合物的組合物。
13.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括施用含有選自的羽扇醇，樺木腦，28-丁二?；鶚迥灸X，樺木酸，甲磺?；鶚迥舅幔銟渌?，山楂醇，熊果酸，及其甲酯的五環(huán)三萜烯化合物的組合物。
14.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括施用含有選自羽扇醇，樺木腦，28-丁二?；鶚迥灸X，及其甲酯的五環(huán)三萜烯化合物的組合物。
15.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括施用含有樺木腦的組合物。
16.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括施用含有熊果酸的組合物。
17.權(quán)利要求10的方法，其中施用步驟包括將所說的組合物施用于谷物的表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及在農(nóng)業(yè)上可接受的載體中至少含有一種五環(huán)三萜烯化合物的殺菌有效的組合物。
文檔編號C07C69/40GK1334733SQ99816045
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月8日
發(fā)明者J·格林斯基, K·布蘭利 申請人:麥克羅弗羅公司, 泊靈格英格爾海姆藥品公司