專利名稱：升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在抗骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從常用中藥西升麻(Cimicifuga foetida L.)，關(guān)升麻(Cimicifugaheracleifolia Komarov)和北升麻(Cimicifuga dahurica(Turcz)Maxim)三種中得到的三萜類(包括三萜苷類)化合物，作為抗骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥藥物和保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥被稱為無(wú)聲無(wú)息的流行病，是一種常見(jiàn)的中，老年人的以骨組織量減少和微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性增加并易于發(fā)生骨折的較復(fù)雜的疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)目前骨質(zhì)疏松患者超過(guò)2億人。在美國(guó)有1000萬(wàn)患者，其直接醫(yī)療費(fèi)用估計(jì)為140億美元。日本據(jù)估計(jì)現(xiàn)在已達(dá)到1000萬(wàn)，并有繼續(xù)增加的趨勢(shì)。隨著我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象的不斷加快，骨質(zhì)疏松癥的病人正迅猛增加，已成為老年患者多發(fā)性疾病。我國(guó)目前有8400萬(wàn)人患有不同程度的骨質(zhì)疏松癥，據(jù)推測(cè)，到2010年我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患者將達(dá)到1.15億人1)。毫無(wú)疑問(wèn)對(duì)于我們這樣的人口大國(guó)，如此數(shù)目驚人的膨大的骨質(zhì)疏松癥患者群，不僅給社會(huì)帶來(lái)巨大的壓力，亦造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是高齡骨折患者，生活完全要靠人照顧。骨質(zhì)疏松癥是我們面臨的一個(gè)巨大的醫(yī)學(xué)及社會(huì)課題。
在2000年全球暢銷的前500種藥品中，用于治療骨疏松癥的10種處方藥的銷售額已達(dá)56億美元，美國(guó)決策資源公司預(yù)測(cè)，2009年，世界主要骨質(zhì)疏松藥品市場(chǎng)將超過(guò)100億美元，其平均年增長(zhǎng)率超過(guò)10％。2001年，骨質(zhì)疏松市場(chǎng)前5個(gè)品種的銷售額均以20％的速度遞增，2002年的市場(chǎng)約在80億美元左右2)。我國(guó)治療骨質(zhì)疏松癥藥物的市場(chǎng)需求也在不斷增長(zhǎng)，浙江省6家醫(yī)藥公司的銷售數(shù)據(jù)表明2001年較1998年增長(zhǎng)了100％3)。武漢地區(qū)1998-2000年的統(tǒng)計(jì)表明在所用藥物中進(jìn)口，合資品種占92.2％，這為純國(guó)產(chǎn)藥物研發(fā)提供了廣闊的前景4)。
目前治療和防治骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有鈣制劑、二磷酸鹽類、雌激素、雄激素、維生素D3類、降鈣素及激素替代療法。激素替代療法雖然是防治和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的首選療法，但長(zhǎng)期使用有導(dǎo)致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的潛在危險(xiǎn)。二磷酸鹽類長(zhǎng)期使用效果還沒(méi)有被完全證實(shí)。其他藥物如降鈣素、氟化物等，或價(jià)格昂貴，或遠(yuǎn)期療效不確切，均不夠理想。由于骨質(zhì)疏松癥是慢性病，需要長(zhǎng)期服藥，自然而然價(jià)格合理，毒副作用小的中藥治療骨質(zhì)疏松癥已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。
升麻為常用中藥，其歐洲種(歐洲升麻，Cimicifuga rasemosa)粗提物在歐洲(尤其在德國(guó))、美國(guó)臨床上用于更年期綜合癥治療，并證實(shí)其安全有效。對(duì)于北升麻的化學(xué)成分(從1966年開(kāi)始)大量的化合物被報(bào)道，其中主要為三萜類化合物。
本發(fā)明申請(qǐng)者李建新從1996-1993年(見(jiàn)參考文獻(xiàn)6-8，J.X.Li為本發(fā)明申請(qǐng)者李建新)在抗骨質(zhì)疏松藥物的研究中，使用體外小鼠頭蓋骨培養(yǎng)系統(tǒng)，首次發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)升麻[北升麻(C.dahurica)，關(guān)升麻(C.heracleifolia)和西升麻(C.foetida)]的甲醇提取物對(duì)由甲狀旁腺素引起的骨吸收亢進(jìn)具有較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)甲醇提取物進(jìn)一步分離，得到正己烷，乙酸乙酯，正丁醇和水可溶部。進(jìn)一步的活性檢測(cè)顯示甲醇提取物的乙酸乙酯可溶部對(duì)骨吸收亢進(jìn)具有較強(qiáng)的抑制作用。然后，利用活性炭脫色，各種正相、反相硅膠分離技術(shù)對(duì)關(guān)升麻和西升麻的化學(xué)成分做了詳細(xì)的研究。從關(guān)升麻的乙酸乙酯可溶部中分離到14個(gè)化合物。利用二維譜技術(shù)和X射線衍射分析對(duì)這些化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，確定其中10個(gè)為新三萜化合物。同樣從西升麻的乙酸乙酯可溶部中分得18個(gè)化合物，11個(gè)為新三萜化合物，其中3個(gè)具有trinor-triterpenoid五環(huán)新骨架。以上的三萜類化合物為環(huán)菠蘿蜜烷型(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，2)。
由于體外小鼠頭蓋骨培養(yǎng)系統(tǒng)只是提示升麻可能具有抗骨質(zhì)疏松效果，要證實(shí)該作用體內(nèi)試驗(yàn)必不可少。申請(qǐng)者李建新首次發(fā)現(xiàn)了(1996年，見(jiàn)參考文獻(xiàn)9-10)關(guān)升麻和西升麻的乙酸乙酯可溶部對(duì)大鼠的骨吸收亢進(jìn)而引起的血鈣濃度上升具有明顯的降低效果，首次利用8個(gè)月大的經(jīng)產(chǎn)大鼠雙側(cè)卵巢摘除模型和目前臨床上最常用的測(cè)定骨密度的雙能量X射線吸收法(DXA)證實(shí)各乙酸乙酯可溶部對(duì)由老齡大鼠雙側(cè)卵巢摘除引起的骨質(zhì)疏松化具有明顯的預(yù)防作用。并且未能觀察到雌激素樣副作用。
申請(qǐng)者隨后的試驗(yàn)體外和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，證實(shí)了三萜皂苷抗骨質(zhì)疏松的有效性，并從體外試驗(yàn)證明了三萜皂苷之間的作用的相乘效果。完成了本發(fā)明。
于本發(fā)明相關(guān)的中國(guó)發(fā)明有CN1111427C(申請(qǐng)日1999年2月8日)介紹了升麻的利用提出了利用升麻提取物(60-80％乙醇提取浸膏用正己烷提取后，再用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物用活性炭純化后的產(chǎn)物)用于促進(jìn)骨形成和抗吸收方面藥物的用途和傳統(tǒng)有機(jī)溶媒提取方法，但沒(méi)有指出活性成分。另外一個(gè)發(fā)明(申請(qǐng)日2003年7月31日，公開(kāi)號(hào)CN1475296A)提出了升麻精(為升麻皂甙)的提取制備方法，并提出了升麻皂甙的含量以及該提取物在促進(jìn)骨形成和抗吸收以及治療女性雌激素失調(diào)而引起的疾病如更年期綜合癥方面藥物和保健品的用途，但未有升麻中各升麻皂甙化合物的具體報(bào)告。
參考文獻(xiàn)如下[1]樸俊紅、龐蓮萍、劉忠厚等，中國(guó)人口狀況及原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)生率，中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，8(1)，1-7，2002。
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J.X.Li，H.Y.Li et al，Effects of Cimicifugae Rhizoma on Serum Calcium andPhosphate Levels in Low Calcium Dietary Rats and on Bone Mineral Density inOvariectomized Rats，Phytomedicine 4，379-385(1996)升麻提取物對(duì)低鈣大鼠血鈣、血磷水平及卵巢摘除大鼠骨密度的作用。
J.X.Li，S.Kadota et al，The Effect of Traditional Medicines on Bone ResorptionInduced by Parathyroid Hormone(PTH)in Tissue CultureA Detailed Study onCimicifugae Rhizoma，Journal of Traditional Medicine 13，50-58(1996)中藥提取物對(duì)由甲狀旁腺素引起的骨吸收的作用對(duì)升麻的詳細(xì)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有骨質(zhì)疏松和更前期綜合癥治療作用而且副作用很小或沒(méi)有副作用的從中藥升麻中得到的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物及其在關(guān)生麻中以化合物3，5，8、西升麻中以化合物13a，17，19等為主要成分的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物以及環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的混合物。
提供中藥升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物及其在關(guān)生麻中以化合物3，5，8、西升麻中以化合物13a，17，19為主要成分的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物以及環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的混合物在骨質(zhì)疏松和更前期綜合癥治療中的應(yīng)用，如在劑型上的應(yīng)用，如提供湯劑(口服液)、片劑、膠囊、丸劑等。
本發(fā)明中使用的升麻為國(guó)產(chǎn)升麻[北升麻(C.dahurica，關(guān)升麻(C.heracleifolia)和西升麻(C.foetida)]根莖及須根。升麻為中醫(yī)常用藥，具有升陽(yáng)舉陷，清熱解毒，發(fā)表透疹之功效。主治中氣下陷，脾虛泄瀉，婦女帶下等疾病。其主要用法為湯劑，粉末，丸劑等。在本發(fā)明中，對(duì)從升麻中得到了到對(duì)骨質(zhì)疏松具有治療作用的在關(guān)生麻中以化合物3，5，8、西升麻中以化合物13a，17，19等為主要成分的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物，對(duì)其活性進(jìn)行了體內(nèi)外的檢測(cè)和研究，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下升麻的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的提取物在抗骨質(zhì)疏松藥物的用途，中國(guó)產(chǎn)升麻[北升麻(C.dahurica)，關(guān)升麻(C.heracleifolia)和西升麻(C.foetida)]的干燥根莖及須根粉碎，用50％乙醇或丙醇加熱回流提取得乙醇或丙醇浸膏，將浸膏溶于蒸餾水，經(jīng)過(guò)活性炭脫色，大孔樹(shù)脂分離純化所得的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的提取物用于抗骨質(zhì)疏松和更年期綜合癥及保健品。在關(guān)生麻中以化合物3，5，8或西升麻中以化合物13a，17，19中之一的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物和保健品中應(yīng)用。
在關(guān)生麻中以化合物3，5和8的混合物或西升麻中以化合物13a，17和19的混合物在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物和保健品中應(yīng)用。
本發(fā)明用含有生理有效量的升麻環(huán)菠蘿蜜烷三萜類化合物單體或混合物和/或藥物可接受的載體，所述升麻環(huán)菠蘿蜜烷三萜類化合物是上述1到24化合物。各種劑型均可。
中國(guó)產(chǎn)升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的提取物的提取方法北升麻(C.dahurica)，關(guān)升麻(C.heracleifolia)和西升麻(C.foetida)]的干燥根莖及須根，粉碎，用50-70％乙醇或丙醇加熱回流，提取1-4次。合并提取液，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇或丙醇浸膏。將該浸膏溶于蒸餾水中或少量50％乙醇中，混懸于蒸餾水中，加入石油醚類溶劑1-4次萃取后，同樣的將經(jīng)石油醚提取后的浸膏蒸餾水混懸液用乙酸乙酯等酯類提取1-4次，得到乙酸乙酯提取液。減壓濃縮除去這些提取液中的溶媒，得乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物溶于95-100％的乙醇中，通過(guò)活性炭柱層析，用95-100％乙醇沖洗(也可以將酯類溶于95-100％的乙醇中，回流10-60分鐘，濾紙過(guò)濾)，去黑色，再用正相和反相硅膠柱分離，純化，得到含有圖1和2化合物的。
本發(fā)明對(duì)抗骨質(zhì)疏松有良好的效果，尤其女性骨質(zhì)疏松癥無(wú)須使用雌激素補(bǔ)充療法。是一種副作用小的天然代替藥物。
四

圖1是本發(fā)明環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物結(jié)構(gòu)的式1-11結(jié)構(gòu)示意2是本發(fā)明環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物結(jié)構(gòu)的式12-23結(jié)構(gòu)示意圖五具體實(shí)施方式
下面，使用具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明提取方法，以及這些提取物的骨質(zhì)疏松治療作用。當(dāng)然這些提取方法并非只限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例1化合物提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定中國(guó)產(chǎn)升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的提取物的提取方法北升麻(C.dahurica)，關(guān)升麻(C.heracleifolia)和西升麻(C.foetida)]的干燥根莖及須根，粉碎，用50-70％乙醇或丙醇加熱回流，提取1-4次。合并提取液，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇或丙醇浸膏。將該浸膏溶于蒸餾水中或少量50％乙醇中，混懸于蒸餾水中，加入石油醚類溶劑1-4次萃取后，同樣的將經(jīng)石油醚提取后的浸膏蒸餾水混懸液用乙酸乙酯等酯類提取1-4次，得到酯類提取液。減壓濃縮除去這些提取液中的溶媒，得酯類提取物。酯類提取物溶于95-100％的乙醇中，通過(guò)活性炭柱層析，用95-100％乙醇沖洗(也可以將酯類提取物溶于95-100％的乙醇中，加入活性炭，回流10-60分鐘，濾紙過(guò)濾)，去黑色，再用正相和反相硅膠柱分離，純化，得到圖1和2表示的化合物化合物。
以下為三萜類化合物為環(huán)菠蘿蜜烷型(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，2)1.24-表-7，8-去氫升麻醇(24-epi-7，8-didehydrocimigenol)2.3-酮-24-表-7，8-去氫升麻醇(3-keto-24-epi-7，8-didehydrocimigenol)3.2′，4′-O-二乙?；?24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷(2′，4′-O-diacetyl-24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside)4.3′-O-乙?；?24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷(3′-O-acetyl-24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside)5.24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷(24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside)6.7，8-去氫升麻醇(7，8-didehydrocimigenol)7.25-乙?；?7，8-去氫升麻醇(25-O-acetyl-7，8-didehydrocimigenol)8.7，8-去氫-24-乙?；u基升麻醇-3-木糖苷(7，8-didehydro-24-O-acetylhydroshengmanol-3-O-β-D-xyloside)9.24-表槭素醇(24-epi-acerinol)10.大三葉升麻醇(heracleifolinol)11.25-乙?；榇?25-O-acetylcimigenol)12.25-A-3-O-β-D-木糖苷(25-anhydrocimogenol-3-O-β-D-xyloside)13a.乙酰阿科特醇-3-木糖苷(acetlyacteol-3-O-β-D-xyloside)13b.乙酰阿科特醇(acetlyacteol)14.川升麻醇(cimicinol)15.升麻雌醇(cimicifol)16.升麻酮醇(cimicidanol)17.升麻酮醇-3-木糖苷(cimicidanol-3-O-β-D-xyloside)18.升麻苷(cimicidol-3-O-β-D-xyloside)19.15-羥基升麻苷(15α-hydroxycimicidol-3-O-β-D-xyloside)20.綠升麻醇(foetidinol)21.綠升麻醇-3-木糖苷(foetidinol-3-O-β-D-xyloside)
22.15-羥基綠升麻醇-3-木糖苷(15α-hydroxyfoetidinol-3-O-β-D-xyloside)23.25-乙?；榇?25-O-acetylcimigenol)24.27-去氧乙酰阿科特醇(27-desoxyacetylacteol)以下說(shuō)明由實(shí)施例1得到的各提取物的體外生物活性試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物生物試驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例2抗骨吸收活性用Ham′s F-12培養(yǎng)液將圖1和2中的化合物配成下表所記述的3種濃度。使用生后2天的乳小鼠，皮下注射45CaCl2(2 Ci)，2天后，摘出頭蓋骨，用Ham′s F-12培養(yǎng)液，在溫度37℃，CO25％的條件下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)后，更換新培養(yǎng)液，并在此培養(yǎng)液中加入1，25二羥基活性維生素D3(1，25-(OH)2VD3，最終濃度10-10M)和各化合物(最終濃度見(jiàn)下表，200；20和2微摩爾)在與預(yù)培養(yǎng)相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天，并測(cè)定釋放到培養(yǎng)液中的45Ca的(測(cè)定值1)。更新此培養(yǎng)液，再次在與預(yù)培養(yǎng)相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天，同樣測(cè)定釋放到培養(yǎng)液中的45Ca(測(cè)定值2)。取出培養(yǎng)液中的頭蓋骨，用脫鈣液
脫鈣，并同樣測(cè)定脫鈣液中的45Ca(測(cè)定值3)。按下面的計(jì)算公式計(jì)算45Ca的釋放率(％)。
以上的實(shí)驗(yàn)得到了下表的結(jié)果



數(shù)據(jù)表示為Mean±SE。與1，25二羥基活性維生素D3組相比有有意差，*，p＜0.05；**，p＜0.01.
結(jié)果清楚的表明圖1和2中的三萜類化合物除化合物1，20外，在高濃度下均對(duì)1，25二羥基活性維生素D3引起的骨吸收亢進(jìn)有顯著的抑制作用。而異阿魏酸無(wú)活性。
實(shí)施例3抗骨吸收活性實(shí)施例2中的化合物與實(shí)施例2同樣配成下表所記述的3種濃度，200；20和2微摩爾。
與實(shí)施例2同樣檢測(cè)其抗骨吸收活性，得到以下結(jié)果。

數(shù)據(jù)表示為Mean±SE。與1，25二羥基活性維生素D3組相比有顯著差別，*，p＜0.05；**，p＜0.01.
結(jié)果清楚的表明圖1和2中的化合物3，5，8、13a，17，19的混合物與對(duì)1，25二羥基活性維生素D3引起的骨吸收亢進(jìn)有很強(qiáng)的抑制作用。與各個(gè)化合物單獨(dú)的活性相比，混合物的活性要強(qiáng)得多，提示該化合物之間有活性相乘作用。因此，與使用升麻單個(gè)三萜皂苷相比，三萜皂苷混合物為好。
實(shí)施例4抗OLCs活性的測(cè)定用小鼠骨髓細(xì)胞(Bone Marrow Cell，BMC)的和類成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)法，測(cè)定了化合物3、5、8、13a、17、18對(duì)由1，25-二羥基維生素D3[1，25-(OH)2D3]誘導(dǎo)的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phospharase，TRAP)陽(yáng)性多核巨細(xì)胞[類破骨細(xì)胞(Osteoblast-like cels，OLCs)]形成的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中采用了臨床上已經(jīng)應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥依降鈣素做為陽(yáng)性對(duì)照。
六周齡的小鼠三只，脊椎脫臼，70％酒精消毒后，摘出脛骨，剝離骨的軟組織。將骨兩端切除，用吸入1mL含10％FBS的-MEM培養(yǎng)基的注射器從骨的遠(yuǎn)心端慢慢注入，從近心端收集液體。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基充分混合后，在2000rpm下離心15min，吸去上層液體后，加入8mL含10％FBS的-MEM培養(yǎng)基，計(jì)算有核細(xì)胞，得到骨髓細(xì)胞。用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL。產(chǎn)后1天的新生小鼠20匹用70％酒精消毒后，摘出頭蓋骨，把頭蓋骨放入50mL的離心管中，加入10mL消化液，37℃下，收集細(xì)胞浮游液。重復(fù)4次，合并4次的細(xì)胞浮游液，在1000rpm下離心5min，收集細(xì)胞。用含10％FBS的-MEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至3.3×105個(gè)/mL，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，得到類成骨細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞0.1mL(105個(gè)細(xì)胞/孔)和類成骨細(xì)胞0.5mL(104個(gè)細(xì)胞/孔)放入24孔培養(yǎng)板中，加入0.4mL 50μM的樣品溶液(含2.5×10-8M的1，25-二羥基維生素D3)后，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)溶液。培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞倒去培養(yǎng)溶液，用1mL含有10％福爾馬林的PBS溶液固定10min，用1∶1的乙醇-丙酮溶液各2mL脫水1min，自然干燥。干燥后，用染色液各0.5mL染色，室溫放置12min。除去染色液后，用2mL蒸餾水洗凈，顯微鏡下計(jì)算有三個(gè)核以上的紅色細(xì)胞數(shù)目。

對(duì)照組細(xì)胞與1，25-二羥基維生素D3(10-8M)共同培養(yǎng)，對(duì)照組被作為100％，其他數(shù)據(jù)均表示為相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)值。與對(duì)照組相比有顯著差異，*p＜0.05，**p＜0.01。
所有的化合物在所有的濃度都顯示了對(duì)由1，25二羥基活性維生素D3誘導(dǎo)的類破骨細(xì)胞的分化的抑制作用，提示活性成分應(yīng)為三萜類化合物。另外，與各個(gè)化合物單獨(dú)的活性相比，混合物的活性要強(qiáng)，提示該化合物之間有活性相乘作用。因此，與使用升麻單個(gè)三萜皂苷相比，三萜皂苷混合物為好。
實(shí)施例513a，17，19混合物對(duì)低鈣食物引起的高血鈣的治療作用利用70g左右的Wistar大鼠，給予低鈣食物，一周后，絕食12小時(shí)，口服灌胃給予上述混合物25mg/kg，給要后，3、6、10小時(shí)，眼部采血，測(cè)定血中鈣的含量。

*p＜0.05.
如表所示，混合物在6小時(shí)時(shí)對(duì)由低鈣食物引起的高血鈣具有抑制作用。本結(jié)果與升麻的提取物的作用一致。
實(shí)施例6將8周齡的小鼠分成5組，4組卵巢摘除組和1組偽手術(shù)組。卵巢摘除組的小鼠在苯巴比妥的麻醉下實(shí)施兩側(cè)卵巢摘除手術(shù)(OVX)。偽手術(shù)組的小鼠同樣用苯巴比妥麻醉，但不摘兩側(cè)除卵巢，只用攝子接觸兩側(cè)卵巢，實(shí)施偽手術(shù)(Sham)。將化合物18和化合物13a，17，18的混合物，將陽(yáng)性對(duì)照藥乙炔基雌二醇(Ethin ylestradiol)混懸于蒸餾水中，經(jīng)口灌胃給前述各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品。對(duì)照組和偽手術(shù)組直接給同量的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)5周，每周測(cè)定小鼠體重，5周后用雙能量射線吸收法(DXA，Dual EnergyX-rav Absorptionmetry)測(cè)定小鼠的第二腰椎到第四腰椎的平均骨密度(BMD，BoneMineral Density)。另外，摘出小鼠子宮，迅速稱重。
以下為實(shí)施例4的結(jié)果。

數(shù)據(jù)表示為Mean±SE。與對(duì)照組相比有有意差，*，p＜0.05；**，p＜0.01。
利用小鼠兩側(cè)卵巢摘除模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠實(shí)施兩側(cè)卵巢摘除手術(shù)后骨密度顯著降低，而19和化合物13a，17，19的混合物對(duì)(25毫克/公斤/天)與陽(yáng)性對(duì)照組(乙炔基雌二醇)一樣，對(duì)由此引起的骨密度降低有明顯的抑制作用。從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了升麻三萜類化合物對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。前面的離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了三萜化合物之間的相乘作用，雖然化合物13a，17，19的混合物對(duì)骨密度比化合物19有增加，但是未發(fā)現(xiàn)有意差，可能是由于實(shí)驗(yàn)期間較短的原因。

數(shù)據(jù)表示為Mean±SE。與對(duì)照組相比有有意差，**，p＜0.01.
結(jié)果清楚的表明實(shí)施兩側(cè)卵巢摘除手術(shù)給乙炔基雌二醇的大鼠的子宮重量明顯增大，而化合物19和化合物13a，17，19的混合物對(duì)的混合物沒(méi)有引起子宮重量增加，說(shuō)明升麻三萜皂苷無(wú)雌激素樣副作用的。
所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，可以制備成湯劑，口服液、片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、散劑、溶液劑或丸劑。幾種升麻中均有本發(fā)明分離出較純的物質(zhì)的含量。
權(quán)利要求
1.升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在抗骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的用途，從北升麻C.dahurica，關(guān)升麻C.heracleifolia和西升麻C.foetida的干燥根莖及須根，粉碎，用50-70％乙醇或丙醇加熱回流，提取1-4次；合并提取液，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇或丙醇浸膏；將該浸膏溶于蒸餾水中或少量50％乙醇中，混懸于蒸餾水中，加入石油醚類溶劑1-4次萃取后，同樣的將經(jīng)石油醚提取后的浸膏蒸留水混懸液用乙酸乙酯酯類提取1-4次，得到酯類提取液；濃縮除去這些提取液中的溶媒，得酯類提取物；酯類提取物溶于95-100％的乙醇中，通過(guò)活性炭柱層析，用95-100％乙醇沖洗，再用正相和反相硅膠柱分離，純化，得到下述三萜類化合物，化合物為環(huán)菠蘿蜜烷型(1).24-表-7，8-去氫升麻醇24-epi-7，8-didehydrocimigenol，(2).3-酮-24-表-7，8-去氫升麻醇3-keto-24-epi-7，8-didehydrocimigenol，(3).2′，4′-O-二乙酰基-24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷2′，4′-O-diacetyl-24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside，(4).3′-O-乙?；?24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷3′-O-acetyl-24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside，(5).24-表-7，8-去氫升麻醇-3-木糖苷24-epi-7，8-didehydrocimigenol-3-O-β-D-xyloside，(6).7，8-去氫升麻醇7，8-didehydrocimigenol，(7).25-乙?；?7，8-去氫升麻醇25-O-acetyl-7，8-didehydrocimigenol，(8).7，8-去氫-24-乙酰基羥基升麻醇-3-木糖苷7，8-didehydro-24-O-acetylhydroshengmanol-3-O-β-D-xyloside，(9).24-表槭素醇24-epi-acerinol，(10).大三葉升麻醇heracleifolinol，(11).25-乙酰基升麻醇25-O-acetylcimigenol，(12).25-A-3-O-β-D-木糖苷25-anhydrocimogenol-3-O-β-D-xyloside，(13a).乙酰阿科特醇-3-木糖苷acetlyacteol-3-O-β-D-xyloside，(13b).乙酰阿科特醇acetlyacteol，(14).川升麻醇cimicinol，(15).升麻雌醇cimicifol，(16).升麻酮醇cimicidanol，(17).升麻酮醇-3-木糖苷cimicidanol-3-O-β-D-xyloside，(18).升麻苷cimicidol-3-O-β-D-xyloside，(19).15-羥基升麻苷15α-hydroxycimicidol-3-O-β-D-xyloside，(20).綠升麻醇foetidinol，(21).綠升麻醇-3-木糖苷f(shuō)oetidinol-3-O-β-D-xyloside，(22).15-羥基綠升麻醇-3-木糖苷15α-hydroxyfoetidinol-3-O-β-D-xyloside，(23).25-乙?；榇?5-O-acetylcimigenol，(24).27-去氧乙酰阿科特醇27-desoxyacetylacteol，其特征是上述環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物和保健品中應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的，其特征在于含有生理有效量的升麻環(huán)菠蘿蜜烷三萜類化合物單體或混合物和/或藥物可接受的載體，所述升麻環(huán)菠蘿蜜烷三萜類化合物是上述1到24化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，其特征在于所述環(huán)菠蘿蜜烷三萜類化合物的單體或混合物在組合物中的重量比例為1-99％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，其特征是在關(guān)生麻中以化合物3，5，8或西升麻中以化合物13a，17，19中之一的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物中應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，其特征是在關(guān)生麻中以化合物3，5和8為主的混合物或西升麻中以化合物13a，17和19為主的混合物在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，其特征是制備成湯劑，口服液、片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、散劑、溶液劑或丸劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物的用途，其特征是在通過(guò)藥物或保健品中應(yīng)用。
全文摘要
升麻環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物在抗骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的用途，從北升麻C.dahurica，關(guān)升麻C.heracleifolia和西升麻C.foetida的干燥根莖及須根，粉碎，用50－70％乙醇或丙醇加熱回流，提取1－4次；合并提取液，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇或丙醇浸膏；并經(jīng)石油醚提取再用乙酸乙酯酯類提取1－4次，得到酯類提取液；通過(guò)活性炭柱層析，用95－100％乙醇沖洗，再用正相和反相硅膠柱分離，純化，得到下述24種三萜類化合物，化合物為環(huán)菠蘿蜜烷型，用于在治療骨質(zhì)疏松及更年期綜合癥的藥物和保健品中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K36/71GK101057854SQ20061004076
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者李建新 申請(qǐng)人:南京大學(xué)