專利名稱：磷酸取代的苯并氮雜卓酮－n－醋酸衍生物、制法和藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的苯并氮雜卓酮-N-醋酸衍生物，它們于3-位被一個攜帶一個1-位甲基磷酸殘基的環(huán)戊基羰基氨基所取代，涉及其鹽和生物穩(wěn)定的酯，以及含有這些化合物的藥物制劑和制備這些化合物的方法。
由歐洲專利申請、公開號0733642已知苯基氮雜卓-、苯并噁氮雜卓-和苯并二氮雜卓-N-醋酸衍生物，它們對中性肽鏈內切酶(=NEP)具有抑制作用。
本發(fā)明的目的是，研制在治療心功能衰竭和高血壓方面具有有利作用的、新的、NEP-抑制作用的制藥學活性物質。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明新的苯并氮雜卓酮-N-醋酸-衍生物，它們于苯并氮雜卓酮-骨架的3-位被一個攜帶一個1-位甲基磷酸殘基的環(huán)戊基羰基氨基所取代，具有非常有價值的心臟作用藥理學特性，在治療心血管疾病、尤其是心功能衰竭方面具有特別有利的作用，同時還具有優(yōu)異的對中性肽鏈內切酶的抑制作用，和對內皮素轉變酶(=ECE)的抑制作用以及良好的耐受性。
本發(fā)明目的是提供通式Ⅰ的新化合物、通式Ⅰ酸的生理耐受鹽、提供制備這些化合物的方法和含有這些化合物的藥物
Ⅰ其中R1為氫或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R2為氫或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R3為氫或一個能生成生物穩(wěn)定的羧酸酯的基團。
通式Ⅰ化合物為任選經生成生物穩(wěn)定酯的基團被酯化的、含有羧酸-和磷酸基團的酸衍生物。通式Ⅰ的生物穩(wěn)定酯為游離酸的前體物。按照用藥方式，優(yōu)選生物穩(wěn)定酯或酸，而后者尤其適用于靜脈內注射。
作為能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團R1和R2，合適的有在活體內生理條件下、在釋放相應的磷酸官能團的同時可以被裂解的基團。例如在此合適的有低級烷基、任選在氧基甲基上被低級烷基取代的C2-C6-鏈烷酰氧基甲基或苯基或苯基低級烷基，其苯環(huán)任選被低級烷基、低級烷氧基或被一個結合在二個相鄰碳原子上的低級亞烷基鏈取代一次或多次。如果生成生物穩(wěn)定酯的基團R1和/或R2為或者含有低級烷基，那么它可以為分支的或直鏈的，并且含有1至4個碳原子。如果R1和/或R2為一個任選取代的鏈烷酰氧基甲基，那么它可以含有一個優(yōu)選分支的、帶有2至6個、優(yōu)選3至5個碳原子的鏈烷酰氧基，例如可以為一個新戊酰氧基甲基殘基(=叔-丁基羰氧基甲基殘基)。如果R1和/或R2為一個任選被取代的苯基低級烷基，那么它可以含有一個帶有1至3個，優(yōu)選帶有1個碳原子的亞烷基鏈。如果苯環(huán)被一個低級亞烷基鏈所取代，那么它可以含有3至4個，尤其是3個碳原子，這種被取代的苯環(huán)尤其是2,3-二氫化茚基。
作為能生成生物穩(wěn)定的羧酸酯的基團R3，合適的有在活體內生理條件下、在釋放相應的羧酸的同時可以被裂解的基團。例如在此合適的有低級烷基、任選在苯環(huán)上一次或多次被低級烷基或低級烷氧基取代的，或者被一個結合在二個相鄰碳原子上的低級亞烷基鏈所取代的苯基或苯基低級烷基、在二氧戊環(huán)上任選被低級烷基取代的二氧戊環(huán)基甲基或任選在氧基甲基上被低級烷基取代的C2-C6-鏈烷酰氧基甲基。如果生成生物穩(wěn)定的酯的基團R3為或含有低級烷基，那么它可以為分支或直鏈的，并且含有1至4個碳原子。如果能生成生物穩(wěn)定酯的基團為任選被取代的苯基低級烷基，那么它可以含有一個攜帶1至3個、優(yōu)選1個碳原子的亞烷基鏈，并且優(yōu)選為芐基。如果苯環(huán)被一個低級亞烷基鏈所取代，那么后者可以含有3至4個、優(yōu)選3個碳原子。如果R3為一個任選被取代的鏈烷酰氧基甲基，那么后者含有一個優(yōu)選分支的鏈烷酰氧基，后者帶有2至6個、優(yōu)選3至5個碳原子，例如可以為一個新戊酰氧基甲基。
按照本發(fā)明，用本質上已知的方式獲得通式Ⅰ的新化合物及其鹽，方法是a)為了制備通式Ⅳ化合物
Ⅳ其中R101和R201分別相互獨立地為氫或一個磷酸保護基、R302為一個羧酸保護基，將通式Ⅱ化合物
Ⅱ其中R101和R201具有上述含義，與通式Ⅲ化合物發(fā)生反應，
Ⅲ其中R302具有上述含義，并且，如果R101和/或R201為氫，將游離的磷酸官能團任選通過用通式Ⅴa和/或Ⅴb化合物進行酯化，R110-Y(Ⅴa)R210-Y(Ⅴb)其中R110和R210分別為一個能生成生物穩(wěn)定磷酸酯的基團，Y為羥基或一個可分裂的離去基團，轉化成一個生物穩(wěn)定的磷酸酯基團b) 如果在通式Ⅳ化合物中，保護基團R101、R201和/或R302不是所希望的能生成生物穩(wěn)定酯的基團，那么將后者同時或分別以任意的順序先后裂解掉然后任選將各個游離的酸官能團轉化成生物穩(wěn)定的酯基，方法是，將游離的磷酸官能團用通式Ⅴa或Ⅴb化合物進行酯化，和/或將游離的羧酸官能團用通式Ⅴc化合物進行酯化，R310-Y (Ⅴc)其中R310為一個能生成生物穩(wěn)定羧酸酯的基團，Y具有上述含義，以及任選將通式Ⅰ的酸轉化成生理耐受鹽，或者將通式Ⅰ酸的鹽轉化成游離的化合物。
作為通式Ⅰ酸的生理耐受鹽分別考慮其堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，例如其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或者考慮與以下胺類生成的鹽即與生理耐受的、藥理學中性的有機胺例如二乙胺、叔-丁胺或苯基低級烷基胺如α-甲基芐胺。
作為磷酸保護基R101和R201，可以選擇保護磷酸官能團所常用的保護基團，它們接著按照本身已知的方式重又裂解。作為羧酸保護基R302，可以選擇保護羧酸官能團常用的保護基，它們可以接著按照本身已知的方式重又裂解。合適的羧酸保護基例如由以下文獻已知McOmie，“有機化學中的保護基”，Plenum出版社、和Green,wuts，“有機合成中的保護基”Wiley Interscience出版。合適的磷酸保護基例如由以下文獻已知Houben,Weyl“有機化學方法”G.Thieme出版社，斯圖加特，紐約，1982年，313-341頁、以及M.Kluba,A.Zwierk，“合成”1978年，134-137頁、和McOmie，“有機化學中的保護基”，Plenum出版社。作為酸保護基還可以應用能生成生物穩(wěn)定酯的基團。在通式Ⅱ化合物與通式Ⅲ化合物的轉化反應中所獲得的通式Ⅳ化合物在此情況下已經為本發(fā)明通式Ⅰ的酯。
按照本發(fā)明，合適的磷酸保護基R101和R201有這樣一些基團，它們按照合適的方法相互獨立地、并且與在分子中尚存在的羧酸保護基R302無關地選擇性裂解或者選擇性地導入。一般來說，借助于三甲基甲硅烷基溴，在羧酸保護基存在的條件下，磷酸保護基容易選擇性地被裂解。在各種不同條件下可裂解的磷酸保護基-也可以是生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團-的舉例如下直鏈的低級烷基如乙基，它們例如容易被酸如三氟乙酸裂解，在此情況下，如果將二個磷酸官能團用低級直鏈烷基進行酯化，那么在堿性條件下，該烷基中只有一個烷基被裂解。分支的低級烷基如叔-丁基，它在酸性條件下、例如在三氟乙酸的作用下容易被裂解。任選在苯環(huán)中被取代的苯基甲基如芐基，它容易通過氫解作用被裂解。鏈烷酰氧基甲基如新戊酰氧基甲基，它容易通過例如酸如三氟乙酸被裂解。在苯環(huán)中一次或多次被低級烷氧基取代的苯基甲基，如對-甲氧基芐基，它可以在氧化條件下例如在2,3-二氯-5,6-二氰-1,4-苯并醌(=DDQ)或亞硝酸銨鹽(=CAN)的作用下容易被裂解。
作為羧酸保護基R302合適的有這樣一些基團，它們與在分子中可能尚存在的羧酸保護基無關地、選擇性地被分裂或選擇性地被導入。在各種不同的條件下可裂解的羧酸保護基-它也可以是能生成生物穩(wěn)定的羧酸酯的基團-可以舉例如下直鏈的低級烷基如乙基，它在堿性條件下比較容易被裂解。分支的低級烷基如叔-丁基，它易于通過酸如通過三氟乙酸被裂解。任選在苯環(huán)中被取代的苯基甲基如芐基，它易于通過氫解作用或者也可以在堿性條件下被裂解。在苯環(huán)中一次或多次被低級烷氧基取代的苯基甲基如對-甲氧基芐基，它在氧化條件下、例如在DDQ或CAN的作用下比較容易被裂解。
通式Ⅰ化合物含有一個手性碳原子，也即在苯并氮雜卓-骨架的3-位上攜帶酰胺側鏈的碳原子。因此，這些化合物可以二個光學活性立體異構體的形式或作為外消旋物存在。本發(fā)明既包括外消旋混合物，也包括通式Ⅰ的異構體純的化合物。如果在通式Ⅰ化合物中R1和R2不為氫，而是分別具有不同的含義，那么磷酸基的磷原子也可以是手性的。通過手性磷原子出現(xiàn)的異構體混合物和通式Ⅰ異構體純的化合物亦為本發(fā)明目的。
通式Ⅱ的酸與通式Ⅲ的胺生成通式Ⅳ的酰胺的反應，可以按照通過氨基酰化生成酰胺的常用方法進行。作為酰化劑可以應用通式Ⅱ的羧酸或其反應性的衍生物。作為反應性的衍生物尤其考慮混合的酸酐和酰鹵。這樣，例如可以應用通式Ⅱ的酸的酰氯或酰溴、或者通式Ⅱ的酸與有機磺酸的混合酯，這些有機磺酸例如有任選被鹵素取代的低級烷基磺酸如甲醇磺酸或三氟甲醇磺酸；或者芳香族磺酸例如苯磺酸；或者被低級烷基或鹵素取代的苯磺酸例如甲苯磺酸或溴苯磺酸。可以在反應條件下呈惰性的有機溶劑中，在-20℃至室溫的溫度之間進行?；磻?。作為溶劑，合適的有鹵代烴如二氯甲烷，或芳香烴如苯或甲苯，或環(huán)醚如四氫呋喃(=THF)或二噁烷，或這些溶劑的混合溶劑。
較為合適的是，尤其是當應用通式Ⅱ酸的混合酐作為酰化劑時，在一種縛酸劑存在的條件下進行?；磻?。作為縛酸劑合適的有，例如可溶于反應混合物中的有機堿如叔式氮堿，例如叔-低級烷基胺，和吡啶，例如三乙胺、三丙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-二乙基氨基吡啶或4-吡咯烷吡啶。過量加入的有機堿同時還可以作為溶劑。
如果應用通式Ⅱ的酸本身作為酰化劑，那么通式Ⅲ的氨基化合物與通式Ⅱ的羧酸的轉化反應可有利地在由肽化學認為適于生成酰胺的、一種已知的偶聯(lián)試劑存在的條件下進行。偶聯(lián)試劑能夠促進與游離酸以下述方式生成酰胺，其方式為，它們在現(xiàn)場生成一種反應性酸衍生物的同時與酸反應，尤其可以舉例列舉的偶聯(lián)試劑有，烷基二咪唑，例如環(huán)烷基碳化二亞胺如二環(huán)己基碳化二亞胺，或N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺，羰基二咪唑，和N-低級烷基-2-鹵素吡啶鹽，尤其是鹵化物或甲苯磺酸鹽。在一種偶聯(lián)試劑存在的條件下的轉化反應可有利地在-30℃至+50℃的溫度下、在溶劑如鹵代烴和/或芳香族溶劑中、以及任選在一種上述的能結合酸的胺存在的條件下進行。
通過通式Ⅱ化合物與通式Ⅲ化合物的反應所獲得的通式Ⅳ化合物，保護基團R101、R201和R302-如果它們不是所希望的能生成生物穩(wěn)定酯的基團-可以按照本身已知的方式裂解。
如果需制備的通式Ⅰ化合物中R1、R2和R3為相同的能生成生物穩(wěn)定酯的基團，那么較為合適的是，在通式Ⅱ的起始化合物中和通式Ⅲ的起始化合物中即已選擇相同的保護基團。較為合適的是，在此選擇的保護基團同時為能生成生物穩(wěn)定酯的基團。如果需制備其R1、R2和R3分別為氫的通式Ⅰ的游離酸，那么作為保護基團R101、R201和R302，分別選擇在相同條件下，優(yōu)選在氫解條件下可裂解的基團。例如R101、R201和R302可以分別選擇芐基，它們在催化氫化條件下同時裂解為游離酸基。作為催化氫化的催化劑例如可以應用貴金屬催化劑如載于活性炭上的鈀。可以在一種反應條件下為惰性的溶劑中，例如在一種低級醇如乙醇中，或者在一種低級烷基酯如醋酸乙酯中，或者在這些溶劑的混合液中進行該反應。合適的是在2至6巴的氫壓下，和在室溫下進行催化氫化。
如果需將通式Ⅰ化合物的游離磷酸基和/或游離羧酸基酯化，在此可以按照本身已知的方式，將通式Ⅰ化合物的游離磷酸基與通式Ⅴa或Ⅴb化合物反應?？梢园凑毡旧硪阎姆绞?，將通式Ⅰ化合物的游離羧酸基與通式Ⅴc化合物反應。作為通式Ⅴa、Ⅴb或Ⅴc化合物中的離去基團Y，例如可以為鹵素、尤其是氯或溴，或低級烷醇磺酸的殘基例如三氟甲磺酰氧基，或者芳香磺酸如苯磺酸的殘基，或者被低級烷基或鹵素取代的苯磺酸如甲苯磺酸的殘基。
如果所制備的通式Ⅰ化合物中R1和R2的含義相同，而與R3具有不同的含義，較為合適的是，由R101和R201具有相同的意義的通式Ⅱ起始化合物起始，和由R302與R101和R201的含義不同的通式Ⅲ起始化合物起始。例如可以選擇在氫解條件下穩(wěn)定的磷酸保護基團R101和R201，如低級烷基，優(yōu)選乙基。同時，作為羧酸保護基R302，可以應用在氫解條件下可裂解的基團，如芐基。在催化氫化條件下，在所獲得的通式Ⅳ化合物中，只有芐基R302裂解為游離羧酸，而乙基R101和R201保持不變。需要時可以接著將游離羧酸與通式Ⅴc化合物酯化。同樣地在通式Ⅰ化合物中，磷酸保護基R101和R201為在氫化條件下為穩(wěn)定基團如低級烷基，優(yōu)選乙基，R302為可氫化裂解的基團如芐基，首先將乙基R101和R201在酸性條件下裂解，而芐基R302保持不變。需要時，然后可以將游離磷酸基團與通式Ⅴa或Ⅴb化合物，例如與新戊酰氧基氯化物酯化。接著可以將在氫化條件下可裂解的芐基R302通過在本身已知的條件下與氫進行催化還原反應進行裂解，以獲得R3為氫的通式Ⅰ化合物。
如果需要R1和R2具有不同含義的通式Ⅰ化合物，較為合適的是，由R101和R201具有不同含義的通式Ⅱ的起始化合物起始。例如可以選擇這樣的通式Ⅱ的起始化合物作為起始化合物，其中R101為氫，R201為一個在氫解條件下穩(wěn)定的磷酸保護基。例如R201可以為低級烷基，優(yōu)選為乙基。需要時，可以將所獲得的R101為氫的通式Ⅰ化合物接著再與合適的通式Ⅴa化合物轉化，以獲得R1和R2為不同的能生成生物穩(wěn)定酯的基團的通式Ⅰ化合物。例如可以由通式Ⅱ化合物，其中R101為一個在氫解條件下可以裂解的基團如芐基，在本身已知的條件下通過催化氫化，獲得R101為氫的通式Ⅱ起始化合物。
在前面所述的轉化反應中，手性碳原子在通式Ⅲ的起始化合物中沒有發(fā)生改變，所以按照起始化合物的種類不同可以獲得異構體純的通式Ⅰ化合物或異構體混合物。為了制備立體化學純的通式Ⅰ化合物，合適的是將立體化學純的通式Ⅱ化合物與立體化學純的通式Ⅲ化合物轉化。如果將不含有手性磷原子的一種通式Ⅱ化合物與一種外消旋的通式Ⅲ化合物反應，則可以獲得通式Ⅰ化合物的二種對映體的混合物。需要時，對映體混合物可以按照本身已知的方式分離，例如通過在手性分離物質上進行色譜分離，或者通過將通式Ⅰ的一種游離羧酸與一種合適的光學活性堿轉化，例如與(-)-α-甲基-芐基胺轉化，然后接著通過將所獲得的鹽分級結晶，分離光學對映體。
可以按照本身已知的方法獲得通式Ⅱ的起始化合物。
這樣，可以這樣獲得通式Ⅱ化合物，其中將通式Ⅵ化合物
Ⅵ其中R102和R202分別為磷酸保護基，Y具有上述含義，與通式Ⅶ的環(huán)戊烷羧酸轉化，
Ⅶ需要時，接著按照本身已知的方式，將保護基R102和/或R202重又裂解。例如可以應用通式Ⅵ化合物，其中Y為一個低級烷磺酸的殘基，優(yōu)選為三氟甲烷磺酰氧基。
可以按照本身已知的方式，在親核取代的條件下，在一種反應條件下呈惰性的有機溶劑中，通過環(huán)戊烷羧酸與一種可生成環(huán)戊烷羧酸的雙陰離子物的強堿反應，接著與通式Ⅵ的磷酸酯衍生物轉化，進行該反應。作為溶劑合適的例如有開鏈的二烷基醚，如二乙醚，或者環(huán)醚，如THF。作為強堿，合適的例如有非親核有機堿金屬銨化物，如二異丙基鋰胺化物(=LDA)。合適的是，環(huán)戊烷羧酸在THF中與二個當量的LDA轉化，接著將反應混合物繼續(xù)與通式Ⅵ化合物轉化。反應溫度可以在-70℃至0℃之間。
可以按照本身已知的方式獲得通式Ⅵ化合物，例如將通式Ⅷ的磷酸二酯
Ⅷ其中R102和R202具有上述含義，與甲醛的一種來源轉化，例如與仲甲醛轉化。合適的是，在沒有溶劑的條件下，且在可溶于反應混合物中的堿的參與下進行反應。作為堿，可以應用上面所說明的、用于通式Ⅱ化合物與通式Ⅲ化合物轉化的非親核堿。合適的是在50℃至130℃之間，優(yōu)選在80℃至120℃之間的溫度下進行反應。需要時，可以將所獲得的Y為羥基的通式Ⅵ化合物接著按照本身已知的方式，轉化成Y為可分裂的離去基團的通式Ⅵ化合物。
通式Ⅷ化合物為已知或者可以按照已知的方法制備。例如可以用二個不同的生物穩(wěn)定基團制備酯化的通式Ⅷ磷酸衍生物，其中由通式Ⅷ的磷酸二酯，其中R101和R201分別為相同的基團，例如為低級烷基，在一種堿如一種堿金屬氫氧化物例如在氫氧化鈉的作用下，首先裂解二個酯基之一，然后將所獲得的單酯或其鹽接著與相應的通式Ⅴa或Ⅴb化合物轉化。為了加速反應，可以添加合適的催化劑如四低級烷基銨鹽，例如四丁基銨氫氧化物。較為合適的是，還可以添加合適的堿金屬鹵化物如堿金屬碘化物，例如碘化鈉，以加速反應過程?？梢栽谝环N偶極質子惰性的溶劑如低級烷基氰例如乙腈中，在一種低級脂族醚如二乙醚、THF或二噁烷中，在二甲基甲酰胺(=DMF)中，在二甲基亞砜(=DMSO)中，或者在這些溶劑的混合物中進行反應。對此合適的溫度是在0℃至80℃，優(yōu)選5℃至40℃之間。
通式Ⅲ化合物由歐洲專利申請，公開號0733642已知，可以按照其中說明的方法制備。
通式Ⅰ化合物及其藥理學耐受鹽具有優(yōu)越的藥理學特性。尤其是這些物質抑制內皮素轉變酶(ECE)和中性肽鏈內切酶(NEP)，并且對治療心功能不全、尤其具有有利的作用。
在心功能不全的情況下，因疾病引起的心臟排血功能降低，導致反射性周圍血管阻力增加。因此心肌泵血時必須克服增加的后負荷。這樣會以噁性循環(huán)導致心臟負荷增加而進一步噁化病情。此外通過血管活性肽內皮素的作用也增加周圍阻力。內皮素是最強大的、目前已知的自體血管收縮物質，由前體大-內皮素在ECE酶的作用下生成的。
在心功能不全的病癥中，由于心臟排血功能降低和周圍阻力增高，出現(xiàn)血液返回肺循環(huán)和心臟本身的回流現(xiàn)象。由此心房和心室內心肌的壁張力升高。在這種情況下，心臟的作用象一個內分泌性器官，還分泌肽ANP(心房排鈉利尿肽)進入血循環(huán)。由于它具有優(yōu)異的血管擴張和排鈉利尿/利尿作用，ANP不僅可以減小周圍阻力，還可以減少循環(huán)血流量。結果是明顯降低前負荷和后負荷。這是一種內源性心臟保護機制。這種有益的內源性機制是有限制性的，因為ANP在血漿中僅僅只有很短的半衰期。原因是，激素很快地被NEP分解。
本發(fā)明化合物通過抑制ECE活性，阻止內皮素的產生，因此對抗周圍阻力的升高，結果是減輕心肌負荷。本發(fā)明物質通過抑制NEP-活性，此外還導致ANP-水平提高和ANP作用時間延長。這些使ANP-引起的內源性心臟保護機制增強。尤其是這些物質在ANP-引起的利尿/排鈉利尿性活性方面具有很高的作用。
NEP不僅參與ANP的分解，而且還參與內皮素的分解。由此，單純的抑制NEP除導致所希望的ANP-水平升高以外，還導致不利的內皮素水平升高。出于這個原因，現(xiàn)認為ECE-和NEP-抑制的混合作用方式特別有利，因為不僅阻止了排鈉利尿/利尿作用的ANPs的分解(NEP-阻止)，同時還抑制了內皮素的生成(ECE-抑制)。這樣便不再出現(xiàn)NEP-抑制劑的并發(fā)副作用(內皮素水平升高)。
1．最小中毒劑量的測定250g體重(年齡5至6周)的大鼠各10只為一組，以215mg/kg受試物質的最大劑量靜脈內注射用藥(溶于0.1n氫氧化鈉水溶液，pH=7.1)。從注射藥物的時刻開始，悉心觀察動物臨床上明顯的中毒癥狀5小時。此外，每天2次觀察直至一周結束。一周結束后，對所有動物解剖，肉眼檢查所有臟器。如果觀察到死亡或明顯中毒癥狀，則給其它的大鼠逐漸減小劑量用藥，直至不再出現(xiàn)中毒癥狀。引起死亡和明顯中毒癥狀的最低劑量便作為最小中毒劑量。制備實施例2的受試物質在215mg/kg靜脈內注射劑量時，沒有明顯的中毒癥狀。
2．試管內檢測物質的NEP-抑制作用為了證實本發(fā)明物質對肽鏈內切酶(=NEP)的抑制作用，在一個試管內標準試驗中，檢測物質對由于NEP酶活性出現(xiàn)的、甲硫氨酸-腦菲肽(Met-腦菲肽)的氫解分解的抑制作用。在此測定其IC50-值作為物質抑制作用的尺度。一種酶抑制作用物質的IC50-值是該物質的某一濃度值，在此濃度下50％的NEP酶活性被抑制。
試驗實施為了實施試驗，制備含有10ng提純了的NEP(E.C.3.4.24.11)和各種劑量受試物質和20μM底物(Met-腦菲肽)和50mM崔氏緩沖液(=三(羥甲基)氨基甲烷/鹽酸，pH 7.4)的各種孵育溶液的試驗樣品，各100μl。
每種受試物質制備含有3種不同受試物質濃度的6種不同的孵育溶液分別用作雙測定。
在每一個試驗中，分別處理二種對照-孵育溶液，一種是不合有受試物質的酶對照物，另一種是既不合有酶也不含有受試物質的底物對照。
將孵育溶液在37℃下在搖振水浴中孵育30分鐘。在此，在添加底物(Met-腦菲肽)后15分鐘開始酶反應，在孵育時間終末，通過95℃下加熱5分鐘而終止。接著將終止的孵育溶液在12.000xg下離心3分鐘，然后在剩余物中測定未轉化的底物濃度和通過酶反應生成的氫解產物的濃度。在此分別將剩余物的試驗樣品通過在疏水的硅膠上進行高壓液體色譜分離(=HPLA)，在205nm波長用光測法測定酶反應的產物和沒有轉化的物質。應用含有作為反轉相分離材料的NucleosinC 18,5μ的分離柱(4.6×125mm)進行HPLA-分離。溶劑流量為1.0ml/分鐘，將柱加熱至40℃。流動劑A為5mM H3PO4,pH2.5,流動劑B為乙腈+1％mMH3PO4,pH2.5。
由各種試驗樣品中測定的氫解產物和未轉化底物的濃度，按照本身已知的方式計算出受試物質的IC50-值。制備實施例2的受試物質在試驗中對NEP-抑制的IC50-值為1.7nM，因此證實為高潛能NEP-抑制劑。
3．活體內測定在容量負荷的大鼠體內有效物質對利尿/排鈉利尿的影響在容量負荷的大鼠體內測定活體內的活性。在這個試驗中，通過灌注等滲氯化鈉溶液導致心臟的高充盈壓，結果出現(xiàn)ANP-釋放和由此引起的利尿/排鈉利尿。
試驗實施用體重為200-400g的雄性Wistar大鼠進行試驗。在神經安定鎮(zhèn)痛(芬太尼；Hypnorm，廠商Janssen公司)下，將一導管插進右股動脈，用于背景灌注和用等滲氯化鈉溶液灌注。打開腹腔后，將第二根導管插進膀胱，并且結扎輸尿管，這樣便可以測量尿量、尿鈉和尿鉀。
重新關閉腹腔，在2小時的整個試驗時間里，給動物持續(xù)灌注氯化鈉溶液(0.5ml/100g體重)。在一個30分鐘的平衡期后，在受試物質用藥的過程中，在每10分鐘的時間段內各測量尿試驗樣品3次。該前期值(=“前藥”-值)的測定是為了監(jiān)測在試驗動物上有持續(xù)的尿流。
然后將含有受試物質的溶液給每10只一組的大鼠靜脈內用藥(團注法注射至股靜脈內)，或口服(借助于咽管)用藥。對二種用藥形式，對照組各自只用不含活性物質的安慰劑溶液。靜脈注射5分鐘后以及口服用藥120分鐘后，用容量增加的氯化鈉溶液靜脈內給藥，使大鼠負荷(于2分鐘內以2ml/100g體重的劑量)，收集60分鐘時間內的尿液。測定這個時間段析出的尿量以及其中所含有的鈉-和鉀含量。由析出的尿量可以讀取相對于前期值在容量負荷下出現(xiàn)的排尿增加值。
在下列表格中說明了在受試物質用藥后的容量負荷下出現(xiàn)的排尿量增加，以％表示，以及用安慰劑后容量負荷下出現(xiàn)的排尿量。此外還測定了受試物質用藥后的容量負荷下鈉和鉀的排泄量，用％表示，以及用安慰劑后容量負荷下鈉和鉀的排泄量。在表格1和2中的實施例號為后面的制備實施。
表1
4．活體內檢驗大鼠內有效物質的ECE-抑制作用為了證明本發(fā)明物質對內皮素轉變酶(=ECE)的抑制作用，在活體內標準試驗中檢驗該物質對由于ECE酶活性出現(xiàn)的、大-內皮素(Big-ET)相對于內皮素(=ET)的氫解分解的抑制作用。ET為自體內具強烈血管收縮作用的物質。ET-水平的升高導致血壓升高。灌注Big-ET時使血壓升高的程度相當于ECE-催化裂解的ET所形成的。測定物質對由于灌注Big-ET產生的血壓升高的抑制作用，作為物質的ECE-抑制作用的尺度。
試驗實施用體重為220-280g的Charles River Wiga公司的雄性CD-大鼠進行試驗。在氯胺酮/賽拉嗪-麻醉下，將一導管插入動物的左側頸靜脈，用以給藥，將另一導管插入左側頸動脈，用以測量血壓。維持30分鐘后，將活性物質溶液給動物靜脈內(=i.v.)或者十二指腸內(=i.d.)用藥。在用受試物質用藥后，分別以0.5nmol/kg的劑量，經靜脈內給動物以Big-ET用藥。以受試物質用藥和以Big-ET用藥之間的時間間隔為，在經靜脈內用藥時分別為5分鐘，在經十二指腸以實施例號18和22的受試物質用藥時分別為15分鐘，在經十二指腸以實施例號8和20的受試物質用藥時分別為30分鐘。在最近的30分鐘內每5分鐘記錄收縮期血壓和舒張期血壓。在未經治療的動物上，灌注0.5nmol/kg大-內皮素可重復出現(xiàn)劇烈的血壓升高，持續(xù)約5分鐘。
在后面的表格2中，說明了在用安慰劑處理的對照組動物上，和在用受試物質以各種劑量處理的動物上，以Big-ET用藥后的最大血壓升高。
表2
上述試驗結果表明，通式Ⅰ化合物對ECE和NEP具有很高的親和力，與劑量相關地抑制ET形成的ECE-活性和抑制由此引起的周圍血管阻力增加和血壓升高。試驗結果還表明，這些物質此外還通過抑制ANP-分解酶(NEP)促使血中由ANP-水平的升高和因此由此引起的利尿/排鈉利尿效應提高，而不導致大量鉀丟失。
由于前面說明的作用，通式Ⅰ化合物適合于作為藥物用于較高級哺乳動物尤其是人類，用以治療心功能不全和促進利尿/排鈉利尿，尤其是在患有心功能不全的病人。在此較為合適的是，以口服用藥的藥劑形式應用通式Ⅰ化合物及其鹽和生物穩(wěn)定酯。所應用的劑量可以因個體存在差異，自然根據(jù)待治療疾病狀態(tài)、所應用的物質和用藥方式的不同而有所不同。一般來說，適合于較大哺乳動物用藥，尤其是人類用藥的藥物形式，其活性物質含量為1至200mg每單位劑量。
作為藥物，通式Ⅰ化合物和通常的制藥學佐劑可以包含于加侖氏制劑中，例如在片劑、膠囊、懸浮液或溶液中。這些加侖氏制劑還可以按照本身已知的方法制備，應用通常的固態(tài)或液態(tài)載體物質，例如乳糖、淀粉或滑石粉或液態(tài)石蠟，和/或應用通常的制藥學佐劑，例如片劑崩解劑、溶劑調和劑或貯藏劑。
以下實施例能進一步說明本發(fā)明，但并非僅限于此。
通過光譜學檢查、尤其是通過IR-頻譜分析和任選測定光學旋度值，確定新化合物的結構。實施例1(3S)-3-(1-二芐基膦酰甲基-環(huán)戊烷-1-羰基-氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐基酯A)攪拌下將100ml亞磷酸二芐基酯、12.5g仲甲醛和6.2ml三乙胺加在一起。在緩慢加熱至55℃時，溫度上升至120℃。將此時清亮的溶液冷卻至90℃，并且在此溫度下再攪拌30分鐘。冷卻至室溫后，升壓下經1kg硅膠色譜分離(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯1∶4)。將分餾物濃縮和將剩余物在60℃下真空中干燥12小時后，得96.1g純油狀磷酸二芐基羥基甲基酯，它不用提純可以直接參與反應。
B)將17.8g磷酸二芐基羥基甲基酯溶于120ml干燥二氯甲烷中。冷卻至-50℃后，在排除濕氣的條件下，按先后順序首先滴加7.3g 2,6-盧剔啶、然后滴加10.6ml三氟甲磺酸酐。將反應混合液首先在-50℃下攪拌1小時，然后在0℃再攪拌1小時。為了處理，將該混合液澆至冰冷的水中，并且將有機相首先用稀釋的冰冷的鹽酸洗滌，然后用冰冷的水洗滌。有機相經硫酸鈉干燥和過濾后，在真空中蒸發(fā)濃縮。所獲得的粗產物在200g硅膠上色譜分離(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯3∶2)。在濃縮和干燥產物餾分后，得17.0g油狀三氟甲基磺酸二芐基膦酰基甲基酯。
C)在氮氣氛和排除濕氣的條件下，將16.5ml二異丙胺溶于100ml干燥THF中，并冷卻至-70℃。向該混合液滴加65.5ml正-丁基鋰于正-己烷中的1.6摩爾的溶液。然后在0℃下攪拌30分鐘，冷卻至-20℃，然后在此溫度下滴加5.3ml環(huán)戊烷羧酸于20ml THF中的溶液。將此反應混合液首先在-20℃下攪拌30分鐘，然后在0℃下攪拌2小時，接著冷卻至-60℃。向該溶液中緩慢滴加20.0g上面在B)中所獲得的產物于20ml THF中的溶液。添加完畢后，在-30℃下攪拌1小時，然后在-20℃下攪拌1小時。然后將反應混合液澆至冰冷的硫酸氫鉀水溶液中，用甲基-叔-丁基醚(=MTBE)萃取。將有機相分離，用飽和鹽水溶液洗滌，經硫酸鈉干燥和過濾后真空濃縮。所獲得的粗產物通過用300g硅膠色譜分離提純，用純MTBE洗脫在該MTBE中混合了5％至10％持續(xù)上升的甲醇部分。為了進一步提純，將這樣所獲得的產物重新在200g硅膠上色譜分離，得6.7g純1-二芐基膦?；谆?1-環(huán)戊烷羧酸，熔點=89-92℃。
D)將24.5g外消旋3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯于54 ml乙醇中的溶液加熱至65℃，向此溶液中添加12.65g左-(+)-酒石酸于54ml加熱至65℃的乙醇中的溶液。在室溫下攪拌此混合液1小時。然后滴加1.72ml苯甲醛于1.3ml乙醇中的溶液。所獲得的懸浮液在80℃回流下煮14小時，然后冷卻至室溫。將形成的晶狀沉淀物吸濾，吸收至80ml乙醇中，重又在回流下煮8小時。然后冷卻至室溫，將晶狀物吸濾和在減壓下50℃下干燥。得23.6g酒石酸鹽，熔點為195至196℃；[α]20D=-152.0°(c=0.5于甲醇中)。
E)為了釋放出堿，將23.6g酒石酸鹽于250ml水和108ml二氯甲烷的混合液中攪拌下冷卻至0℃，通過添加氨水溶液，調節(jié)pH為9.6。將有機相分離，將水相再次用30ml二氯甲烷萃取，將有機相合并，經硫酸鈉干燥和減壓下濃縮。將剩余的沉淀物由MTBE結晶和在減壓下干燥。得12.2g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔-丁酯，熔點=113-115℃,[α]20D=-276.2°(c=0.5于甲醇中)。
F)將3.6g前面所獲得的純對映體的叔丁酯與2.8g對-甲苯磺酸和6.9ml芐基醇于60ml甲苯中加在一起。接著將這種混合液在水沉淀池中煮3小時，將甲苯在真空中吸濾和將剩余物與MTBE攪拌。潷析溶劑后，將剩余物吸收進二氯甲烷中和用冰冷的稀釋的碳酸鈉水溶液振蕩。將水相用二氯甲烷萃取，將合并的有機相用水洗滌。接著將有機相經硫酸鈉干燥和在真空中蒸發(fā)濃縮。將剩余物由MTBE中結晶和干燥。得3.2g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-芐酯，熔點=113-115℃,[α]20D=-236.8°(c=0.5于甲醇中)。
G)將5.8g上面C)中所獲得的酸吸收進148ml干燥二氯甲烷中。向所獲得溶液中先后添加4.8g前面所獲得的產物、3.7ml N-甲基嗎啉、1.84g 1-羥基苯并三唑和5.8g N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺-氫氯化物。接著將反應混合物在排除濕度下室溫下攪拌1小時。為了處理，將反應混合物用二氯甲烷稀釋，先后用水、硫酸氫鉀水溶液、水、碳酸氫鈉水溶液和重又用水洗滌。將有機相經硫酸鈉干燥，和真空中蒸發(fā)，得10.5g粗產物，將它經過200g硅膠(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯3∶7)色譜分離提純。將產物餾分蒸發(fā)和真空中干燥后，分離出6.5g純的標題化合物，為固態(tài)泡沫，IR:3400,3310,2940,1740,1650cm-1(膜)；[α]20D=-104.6°(c=0.754于甲醇中)。
實施例2(3S)-3-(1-膦酰基甲基-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸A)將1.9g(3S)-3-(1-二芐基膦?；?環(huán)戊烷-1-羰基-氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐基酯(制備參見實施例1G)溶于100ml乙醇中。對此添加1.2g 5％載于活性炭上的鈀催化劑，然后在5.5巴的氫壓下氫化3小時。為了處理，過濾催化劑、真空中蒸發(fā)濃縮和干燥。得0.9g標題化合物為泡沫狀產物，IR:3400,1720,1630cm-1(KBr)；[α]20D=-140.8°(c=0.5于甲醇中)。
B)將701mg前面所獲得的游離酸和238mg碳酸鈉溶于60ml水中，將溶液在真空中蒸發(fā)濃縮。將所獲得的剩余物吸收進MTBE中并重新在真空中蒸發(fā)濃縮。將現(xiàn)在所獲得的固態(tài)泡沫由異丙醇中結晶，將晶體與溶劑分離，真空中60℃下干燥。得700mg標題化合物的鈉鹽，熔點＞270℃；[α]20D=-159.7°(c=0.149于甲醇中)。實施例3(3S)-3-(1-芐基乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基-氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯A)在冰冷卻下，將8.0g氫氧化鈉于30ml水和30ml乙醇中的溶液滴加至27.6g亞磷酸二乙基酯中，并且在室溫下攪拌2小時。接著真空中蒸發(fā)濃縮和將含水剩余物用MTBE萃取4次。將水相在真空中蒸發(fā)，得25.0g亞磷酸乙基氫鈉鹽，為白色粉末，它不用提純可直接反應。
B)在冰冷卻下，向33.9g硫酸氫四丁基銨鹽于20ml水中的溶液中添加4.0g氫氧化鈉于22ml水中的溶液，同時保持溫度在25℃。接著在室溫下滴加溶于15ml水中的12.5g上面所獲得的產物。攪拌15分鐘后，將沉淀的硫酸鈉吸濾，將濾液分別用50ml二氯甲烷萃取4次。將合并的有機相經硫酸鈉干燥和真空中蒸發(fā)濃縮。40℃下將剩余物在真空中干燥1小時，溶于120ml無水乙腈中，然后與7.07ml芐基溴和0.4g碘化鈉反應。50℃下攪拌12小時，將溶劑真空中吸去和將剩余物吸收進正-己烷中。將固態(tài)剩余物吸濾，用正-己烷和MTBE的混合物再洗滌和干燥。將所獲得溶液真空中蒸發(fā)濃縮，將剩余物經硅膠色譜分離(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯2∶3)。得6.7g亞磷酸芐基乙基酯，為油狀物，IR:2420,1255,970cm-1(膜)。
C)按照實施例1A)中說明的方式，將18.0g以上產物與2.5g仲甲醛和1.2ml三乙胺轉化。經200g硅膠(洗脫劑醋酸乙酯)色譜分離，得16.5g磷酸芐基乙基羥基甲基酯，為油狀物，IR:3300,1230,1030cm-1(膜)。
D)按照實施例1B)中說明的方式，將12.0g前面所獲得的產物與6.2g 2,6-盧剔啶和9.0ml三氟甲磺酸酐轉化。經200g硅膠(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯2∶3)色譜分離，得油狀16.3g三氟甲磺酸芐基乙基膦酰基甲基酯，IR:1410,1245,1210,1010cm-1(膜)。
E)按照實施例1C)中說明的方法，由16.08ml二異丙胺、63.8ml 1.6摩爾正-丁基-鋰于正-己烷中的溶液、和5.3ml環(huán)戊烷羧酸制備環(huán)戊烷羧酸的雙陰離子物，并且按照其中說明的方式與16.0g上面D)中所獲得的產物轉化。將粗產物經300g硅膠(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯1∶1，然后逐漸被純醋酸乙酯代替)色譜分離，得7.1g純油狀1-(芐基乙基膦?；谆?-1-環(huán)戊烷羧酸，IR:2950,1720,1210,1175,1010cm-1(膜)。
F)按照實施例1G)中說明的方法，將3.1g前面所獲得的酸與3.2g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-芐酯(制備參見實施例1F))、3.3ml N-甲基嗎啉、1.35g羥基苯并三唑和3.8g N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺-氫氯化物轉化。經200g硅膠(洗脫劑醋酸乙酯)色譜分離，得2.3g得標題化合物，為粘稠油狀物，IR:3410,2940,1735,1660,1230,1020cm-1(KBr)；[α]20D=-121.6°(c=0.495于甲醇中)。
實施例4(3S)-3-(1-芐基乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基-氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯A)將5.0g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔-丁酯(制備參見實施例1E))和3.75g對-甲苯磺酸于80ml甲苯中，在水沉淀池中煮2.5小時。然后分批地添加總共200ml乙醇，將所形成的反應混合物回流下蒸煮3.5小時。接著將混合物真空中濃縮和將剩余物用二氯甲烷吸收。然后用冰冷的碳酸鈉溶液振蕩和將有機相用水洗滌。將有機相經硫酸鈉干燥，真空中蒸發(fā)和將剩余的殘渣干燥。得3.6g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯，熔點=106.5-108℃；IR=3350,3300,2930,1735,1660cm-1(膜)；[α]20D=-288.4°(c=0.5于甲醇中)。
B)按照實施例1G)中說明的方法，將3.1g 1-(芐基乙基膦酰基甲基)-1-環(huán)戊烷羧酸(制備參見實施例3E))，與2.6g前面所獲得產物、3.3ml N-甲基嗎啉、1.35g羥基苯并三唑和3.8g N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺-氫氯化物轉化。經200g硅膠(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯1∶1，然后逐漸轉變成組成3∶7)色譜分離，得3.7g標題化合物，為油狀物，IR:3410,2950,1735,1660cm-1(膜)；[α]20D=-113.6°(c=0.639于甲醇中)。
實施例5(3S)-3-(1-乙基膦酰基甲基-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯將3.2g(3S)-3-(1-芐基乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基-氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯(制備參見實施例4)與1.0g 5％載于活性炭上的鈀催化劑混合，在2.2巴氫壓下按照實施例2)中說明的方法進行氫化。處理后得2.4g標題化合物，為泡沫樹脂，IR:3400,2950,1740,1650cm-1(KBr)；[α]20D=-162.0°(c=0.324于甲醇中)。實施例6(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基-乙基膦?；谆?-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯將0.6g(3S)-3-(1-乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯(制備參見實施例5)在排除濕度下溶于20ml DMF中，接著與1.86ml三乙胺、0.88ml新戊酰氧基甲基氯化物和0.1g二甲基氨基吡啶混合。將反應混合物繼續(xù)攪拌過夜，在減壓下蒸發(fā)溶劑，將剩余物吸收進二氯甲烷中。將有機相用水洗滌和接著經硫酸鈉干燥。真空中濃縮得粗產物，將它經50g硅膠(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯3∶7，然后逐漸提高酯成份至100％)色譜分離。得188mg標題化合物，為油狀物，IR=1740,1650cm-1(CH2Cl2)；[α]20D=-124.1°(c=0.228于甲醇中)。實施例7(3S)-3-[1-(5-2,3-二氫化茚基乙基膦?；谆?-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯將480mg(3S)-3-(1-乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯(制備參見實施例5)溶于10ml干燥二氯甲烷中，與0.28ml三乙胺混合。將溶液冷卻至-50℃，然后添加0.09ml草酰氯。接著在-50℃下與200mg 2,3-二氫化茚-5-醇(5-indanol)混合，加熱至0℃和室溫下再攪拌5小時。將有機相用水洗滌，分離，經硫酸鈉干燥和在減壓下蒸發(fā)濃縮。經80 g硅膠(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯1∶1，溶劑比例逐漸改變成1∶4)色譜分離，真空中干燥，得220mg標題化合物，為粘稠樹脂，IR:1740,1655cm-1(CH2Cl2)；[α]20D=-135.1°(c=0.205于甲醇中)。實施例8(3S)-3-(1-芐基乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸叔-丁酯按照實施例1G)說明的方法，將5.0g 1-(芐基乙基膦酰基甲基)-1-環(huán)戊烷羧酸(制備參見實施例3E))與5.15g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔-丁酯(制備參見實施例1E))、4.1ml N-甲基嗎啉、2.0g羥基苯并三唑和6.3g N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺-氫氯化物轉化。將所得粗產物經200g硅膠(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯1∶1，然后是純乙酯)色譜分離。得2.6g標題化合物，為泡沫樹脂，IR=3410,3350,1735,1655cm-1；[α]20D=-118.1°(c=0.609于甲醇中)。
實施例9(3S)-3-(1-乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯A)將3.5g 1-(芐基乙基膦酰基甲基)-1-環(huán)戊烷羧酸(制備參見實施例3E))溶于150ml乙醇中，與1.0g5％載于活性炭上的鈀催化劑混合。然后在2.1巴的氫壓下氫化4小時。將催化劑過濾2次，真空中蒸發(fā)和真空中干燥。得2.60g油狀1-乙基-膦?；谆?1-環(huán)戊烷羧酸，它不需提純可直接反應。
B)將所獲得的產物在排除濕氣下溶于100ml二氯甲烷中，與3.5g羰基二咪唑和3.56g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-芐酯(制備參見實施例1F))，混合并且攪拌過夜。接著灌注至飽和硫酸氫鉀水溶液上，將有機相用水中性洗滌和干燥過夜。將所獲得粗產物經150g硅膠色譜分離(洗脫劑首先醋酸乙酯，逐漸混合二氯甲烷直至溶劑比例為1∶1)。將產物餾分真空中干燥后，得1.4g固態(tài)泡沫標題化合物，IR:3410,1740,1645cm-1(KBr)；[α]20D=-130.7°(c=0.339于甲醇中)。
實施例10(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?1-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯A)按照實施例1A)中說明的方法，將69.05g亞磷酸二甲基酯與14.5g仲甲醛和6.96ml三乙胺轉化。得66.02g磷酸二乙基羥基甲基酯，它在真空中干燥后不需提純可以直接轉化。
B)按照實施例1B)中說明的方式，將21.02g前面所獲得的磷酸酯、15.0g 2,6-盧剔啶和21.8ml三氟甲烷磺酸酐轉化。得32.5g油狀三氟甲基磺酸二乙基膦?；谆ァ?br> C)按照實施例1C)中說明的方法，將30.0g前面所獲得的磺酸三氟甲基酯與133ml 1.6摩爾正-丁基鋰于正-己烷中的溶液和10.8ml環(huán)戊烷羧酸轉化。得11.1g二乙基膦酰基甲基-1-環(huán)戊烷羧酸，IR:2970,1730,1240,1030cm-1(膜)。
D)按照實施例1G)中說明的方法，將5.74g前面所獲得的羧酸衍生物與7.05g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-芐酯(制備參見實施例1F))轉化。將所獲得的粗產物經硅膠色譜分離(洗脫劑醋酸乙酯)提純。得7.95g標題化合物，IR=3400,1745,1650cm-1(膜)；[α]20D=-130.3°(c=0.538于甲醇中)。
實施例11(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸將5.3g(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?1-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯(制備參見實施例10)溶于250ml乙醇中，與1.5g 5％載于活性炭上的鈀催化劑混合和按照實施例2說明的方法氫化。得4.3g標題化合物，IR=3390,1730,1650cm-1(KBr)；[α]20D=-156.6°(c=0.514于甲醇中)。
實施例12(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯將2.34g(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸(制備參見實施例11)在排除濕度下溶于二氯甲烷中，與1.6 ml N-甲基嗎啉、0.63g羥基苯并三唑、2.0g N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺-氫氯化物和0.6ml乙醇混合，以及室溫下攪拌4小時。接著將反應混合液按照順序用水、硫酸氫鉀溶液、水、碳酸氫鈉溶液和用水洗滌。然后將有機相分離，經硫酸鈉干燥和真空中蒸發(fā)濃縮。將所形成的產物經200g硅膠色譜分離(洗脫劑起初為醋酸乙酯，然后用5％甲醇混合添加)，將產物餾分濃縮和真空中干燥。得1.6g標題化合物，IR=3410,1740,1650,1200,1030cm-1(膜)；[α]20D=-126.1°(c=0.584于甲醇中)。實施例13(3S)-3-(1-膦酰基甲基-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯將1.3g(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯(制備參見實施例12)在氮氣氛下溶于13ml干燥二氯甲烷中。冰冷卻下添加0.5ml溴三甲硅烷和0.4ml三乙胺，并且攪拌過夜。將過量溶劑真空中吸濾和將剩余物在水溶性丙酮中攪拌15分鐘。將蒸發(fā)掉溶劑后剩余的殘渣吸收進添加了少許二氯甲烷的MTBE中，并且與0.53g(S)-(-)-α-甲基芐胺混合。將沉淀的固態(tài)物質由乙醇中結晶一次，同時得標題化合物，為α-甲基-芐銨鹽，其熔點=210-213℃。IR=2940,1750,1650,1200,1045,cm-1(KBr)；[α]20D=-141.0°(c=0.2于甲醇中)。實施例14(3S)-3-(1-膦酰基甲基-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯將3.8g(3S)-3-(1-二乙基膦?；谆?1-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯(制備參見實施例10)溶于10ml二氯甲烷中，冰冷卻下與10.3ml三氟乙酸混合，接著在室溫下攪拌18小時。將溶劑在真空中吸濾去，將剩余的殘渣多次用甲苯吸收并且每次都重又蒸發(fā)濃縮。將所獲得的粗產物溶于二氯甲烷中，和用水洗滌3次，然后將有機相分離，經硫酸鈉干燥，和將溶劑真空中蒸發(fā)濃縮。真空中干燥后得3.0g標題化合物，為油狀物，IR=3400,2950,1745,1640 cm-1(KBr)；[α]20D=-146.5°(c=0.2于甲醇中)。實施例15(3S)-3-(1-二異丙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸芐酯A)按照實施例1A)中說明的方法，將50.0g亞磷酸二異丙基酯、8.5g仲甲醛和4.0ml三乙胺轉化。將粗產物經硅膠色譜分離(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯1∶4)得37.5g磷酸二異丙基甲基酯，為油狀物，它不需提純可以直接反應。
B)按照實施例1B)中說明的方式，將19.6g前面所獲得的化合物與17.4ml三氟甲烷磺酸酐和11.96g 2,6-盧剔啶轉化。將粗產物經硅膠色譜分離(洗脫劑正-己烷/醋酸乙酯3∶7)得37.4g油狀二異丙基膦?；谆谆撬猁}，IR=2980,1410,1205,1000cm-1(膜)。
C)按照實施例1C)中說明的方法，將27.4g前面所獲得的化合物、10.05ml環(huán)戊烷羧酸和120ml 1.6摩爾正-丁基鋰于正-己烷中的溶液轉化。將粗產物經硅膠色譜分離(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯3∶7，逐漸上升乙酯成份至100％)得10.6g二異丙基膦?；谆?1-環(huán)戊烷羧酸，其熔點=53-57℃。
D)按照實施例1G)中說明的方法，將2.05g前面所獲得的化合物與2.24g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-芐酯(制備參見實施例1F))轉化。得3.5g油狀標題化合物，IR=3410,1735,1650,1240,1180 cm-1(膜)；[α]20D=-127.5°(c=0.287于甲醇中)。
實施例16(3S)-3-(1-芐基異丙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯A)按照實施例3A)中說明的方法，將92.0ml亞磷酸二異丙基酯和22.2g氫氧化鈉轉化。得88.0g亞磷酸異丙基氫化鈉，它不用提純可直接轉化。
B)類似于實施例3B)中說明的方法，將88.0g前面所得化合物和34ml芐基溴轉化。得46.3g油狀亞磷酸芐基異丙基酯，它不用提純可直接轉化。
C)按照實施例1A)中說明的方式，將46.3g前面所得化合物與6.1g仲甲醛和2.87ml三乙胺轉化。得24.0g磷酸芐基異丙基羥基甲基酯，為油狀物，IR=3300,1230,995cm-1(膜)。
D)按照實施例1B)中說明的方式，將24.0g前面所獲得的化合物與18.01ml三氟甲烷磺酸酐和13.57ml 2,6-盧剔啶轉化。得32.5g油狀三氟甲基磺酸芐基異丙基-膦?；谆?，IR=2980,1410,1245,1000cm-1(膜)。
E)按照實施例1C)中說明的方法，將32.5g前面所獲得的化合物、9.65ml環(huán)戊烷羧酸和13.4ml 1.6摩爾正-丁基鋰于正-己烷中的溶液轉化。將粗產物經硅膠(洗脫劑首先是正-己烷/醋酸乙酯1∶1，然后純乙酯，然后是帶有5容積％異丙醇的醋酸乙酯)色譜分離，得7.0g 1-芐基異丙基膦?；谆?1-環(huán)戊烷羧酸，它不用提純可直接轉化。
F)按照實施例1G)中說明的方法，將1.25g前面所獲得的化合物與1.06g(3S)-3-氨基-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯(制備參見實施例4A)轉化。得0.68g標題化合物，IR:2400,1735,1655,1200,985cm-1(膜)；[α]20D=-123.0°(c=0.1于異丙醇中)。
實施例17(3S)-3-(1-乙基膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯按照實施例2中說明的方法，將2.2g(3S)-3-(1-芐基乙基膦?；谆?-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸乙酯-叔丁酯(制備參見實施例8)與1.0g 5％載于活性炭上的鈀催化劑在2.5巴氫壓下氫化。得1.7g標題化合物，IR:3400,1735,1650,cm-1(膜)；[α]20D=-158.2°(c=0.515于甲醇中)。
實施例18(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基-乙基膦酰基甲基)-環(huán)戊烷-1-羰基氨基]-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯按照實施例6中說明的方法，將0.6g(3S)-3-(1-乙基膦酰基甲基-環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯(制備參見實施例17)與1.73ml三乙胺、0.86ml新戊酰氧基甲基氯化物和0.1g二甲基氨基吡啶轉化。經硅膠(洗脫劑醋酸乙酯)色譜分離，得329mg標題化合物，為粘稠樹脂，IR=1740,1650cm-1(CH2Cl2)；[α]20D=-122.9°(c=0.257于甲醇中)。
至實施例20(3S)-3-[1-膦?；谆?環(huán)戊烷-1-羰基氨基)-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯鹽形式A)將961mg上述游離磷酸與212mg碳酸鈉和20ml水混合。將所形成的混合物過濾，將獲得的濾液真空中蒸發(fā)濃縮。將獲得的剩余物由乙醇中結晶，將晶體在60℃下真空中干燥1天。得750mg標題化合物的鈉鹽，熔點＞270℃,[α]20D=-141-5°(c=0.25于甲醇中)。
B)將961mg上述游離磷酸溶于20ml MTBE中，并且與0.42ml叔-丁胺混合。將所形成的溶液真空中蒸發(fā)濃縮，將所獲得的剩余物吸收至MTBE/正-己烷的混合液中。將在該溶劑混合液中所形成的結晶分離和60℃下真空中干燥。得950 mg標題化合物的銨鹽，熔點=215-220℃；[α]20D=-149.8°(c=0.26于甲醇中)。
按照在前面的實施例中說明的方法，還可以制備在下面表3中給定的通式Ⅰ化合物。
表3
ET=乙基；tBu=叔-丁基；POM=新戊酰氧基甲基；Ind=2,3-二氫化茚-5-基；Bn=芐基；ipr=異丙基實施例Ⅰ含有(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基-乙基膦?；谆?-環(huán)戊烷-1-羰基氨基]-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯的膠囊按照每粒膠囊含有以下組成成份制備膠囊(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基-乙基膦?；谆?-環(huán)戊烷-1-羰基氨基]-2,3,4,5-四氫-2-氧代-1H-1-苯并氮雜卓-1-乙酸-叔丁酯20mg玉米淀粉 60mg乳糖 301mg醋酸乙酯 q.s.
將活性物質、玉米淀粉和乳糖借助于醋酸乙酯處理成一種勻質的糊狀混合物=將糊劑粉碎，將形成的粒劑置于一個合適的金屬板上，在45℃下干燥以去除溶劑。將干燥的粒劑通過粉碎機，然后在混合器中與以下其它佐劑混合滑石粉5mg硬脂酸鎂 5mg玉米淀粉 9mg然后充填進可含400mg的膠囊中。
權利要求
1．通式Ⅰ化合物和通式Ⅰ酸的生理耐受鹽，
Ⅰ其中R1為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R2為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R3為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的羧酸酯的基團。
2．按照權利要求1的化合物，其中R3為氫或低級烷基。
3．藥物，它含有藥理作用劑量的按照權利要求1化合物和常用制藥學佐劑和/或載體物質。
4．通式Ⅰ化合物以及通式Ⅰ酸的生理耐受鹽的制備方法
Ⅰ其中R1為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R2為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的磷酸酯的基團，R3為氫、或一個能生成生物穩(wěn)定的羧酸酯的基團，其特征為，a)為了制備通式Ⅳ化合物
Ⅳ其中R101和R201分別相互獨立地為氫或一個磷酸保護基，R302為一個羧酸保護基，將通式Ⅱ化合物
Ⅱ其中R101和R201具有上述含義，與通式Ⅲ化合物發(fā)生反應，
Ⅲ其中R302具有上述含義，并且，如果R101和/或R201為氫，將游離的磷酸官能團任選通過用通式Ⅴa和/或Ⅴb化合物進行酯化，R110-Y(Ⅴa)R210-Y(Ⅴb)其中R110和R210分別為一個能生成生物穩(wěn)定磷酸酯的基團，Y為羥基或一個可裂去的離去基團，成為一個生物穩(wěn)定的磷酸酯基團b) 如果在通式Ⅳ化合物中，保護基團R101、R201和/或R302不是所希望的能生成生物穩(wěn)定酯的基團，那么將它們同時或分別以任意的順序先后裂解然后任選將各個游離的酸官能團轉化成生物穩(wěn)定的酯基，方法是，將游離磷酸官能團用通式Ⅴa或Ⅴb化合物進行酯化，和/或將游離的羧酸官能團用通式Ⅴc化合物進行酯化，R310-Y(Ⅴc)其中R310為一個能生成生物穩(wěn)定羧酸酯的基團，Y具有上述含義，以及任選將通式Ⅰ的酸轉化成生理耐受鹽，或者將通式Ⅰ酸的鹽轉化成游離的化合物。
全文摘要
本文說明了具有NEP－抑制作用的通式Ⅰ化合物、通式Ⅰ酸的生理耐受鹽、以及含有這些化合物的藥物,其中R
文檔編號C07D223/00GK1217334SQ9812414
公開日1999年5月26日 申請日期1998年11月10日 優(yōu)先權日1997年11月12日
發(fā)明者H·沃爾德克, J·梅爾, D·索爾馬蘭, M·伍爾 申請人:索爾瓦藥物有限公司