專利名稱：Fas配體融合蛋白的制作方法
本項發(fā)明涉及一種Fas配體蛋白-糖磷脂融合蛋白以及它的應(yīng)用，例如用于預(yù)防組織或器官移植物排斥反應(yīng)。
Fas配體(FasL)是一種分子量為40kDa的II型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)/神經(jīng)生長因子受體家族，在未成熟的胸腺細(xì)胞、激活的T細(xì)胞和肝臟、卵巢、心臟等的非淋巴細(xì)胞中表達(dá)。T.Suda等公開了大鼠FasL cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列〔《細(xì)胞》(Cell)，1993年12月17日，75卷(6)期，1169-1178頁〕。第1號序列(SEQID NO.1)列出了人類FasL的氨基酸序列〔Takahashi等，《國際免疫學(xué)》(Intl.Immunol)，第6卷，1567-1574頁，1994年〕。完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列按照第1至281順序進(jìn)行了編號。
已知FasL與某些組織細(xì)胞表面表達(dá)的Fas受體結(jié)合后，導(dǎo)致這些表達(dá)Fas抗原(有時也稱為Fas受體)的細(xì)胞凋亡。Mark.R.Alderson等指出活化的成熟的T細(xì)胞表面表達(dá)Fas抗原〔《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(《J.Exp.Med》)，1995年1月，第181期，71-76頁〕。
而且，已知表面表達(dá)人FasL的內(nèi)皮細(xì)胞通過與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的Fas抗原相作用，導(dǎo)致這些T細(xì)胞凋亡。T細(xì)胞參與器官的移植物排斥反應(yīng)，因此希望使侵犯移植器官或組織的T細(xì)胞特異地凋亡。
根據(jù)本項發(fā)明的一些特別發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明首先提供了1.一種hFas配體蛋白-糖磷脂融合蛋白這種蛋白將其脂類尾部與細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)膜表面結(jié)合，由此將FasL蛋白呈遞在細(xì)胞膜表面，如與存在于其它細(xì)胞上的Fas受體結(jié)合，從而導(dǎo)致這些細(xì)胞的凋亡。
這里所說的名詞“hFasL蛋白”包括全長的人Fas配體蛋白，即膜結(jié)合蛋白(由胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞外區(qū)組成)，及保持了人Fas配體的Fas受體結(jié)合特性和凋亡誘導(dǎo)特性的縮短的人Fas配體蛋白和其功能相當(dāng)?shù)淖凅w。
hFasL蛋白特征性地至少包括了人FasL配體的細(xì)胞外區(qū)。因此，hFasL蛋白優(yōu)選包含第2號序列(SEQID NO.2)或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w所示的氨基酸序列中第103至281位(包括端值)，更優(yōu)選第106至281位，最優(yōu)選第136至281位氨基酸序列組成的多肽，或其功能相當(dāng)部分、或其功能相當(dāng)變體。
在本說明書中，人Fas配體的功能相當(dāng)?shù)鞍字笣M足下列條件者(i)它具有與全長人Fas配體蛋白或下文實施例中敘述的hFasL-GPI融合蛋白相似的與人Fas受體結(jié)合的特性；(ii)當(dāng)存在于hFasL-糖磷脂融合蛋白中時，在例如實施例3敘述的體外試驗中，它能夠以與下文實施例中敘述的hFasL-GPI融合蛋白相似的程度，誘導(dǎo)攜帶Fas受體的細(xì)胞凋亡，如淋巴瘤L1210-Fas細(xì)胞。
同樣在本說明書中，人Fas配體蛋白或其部分蛋白的變體是指與第1號序列的第1至281位中的人Fas配體氨基酸序列或其相應(yīng)部分至少具有70％同源性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少80％，或更優(yōu)選至少90％，尤其是至少具有95％的同源性。此處，氨基酸序列與另一氨基酸序列之間至少有70％的同源性是指當(dāng)兩個序列最佳排列對比、將氨基酸序列中的空缺、插入、或非保守性替代記為非一致/非保守替代殘基時，其在相似位置具有至少70％的一致或保守替代的氨基酸殘基。
進(jìn)一步在本說明書的上下文中，保守性替代可以在下列幾組氨基酸組內(nèi)進(jìn)行(i)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；(ii)谷氨酸和天冬氨酸；(iii)精氨酸和賴氨酸；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺；(v)異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸；(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
然而，應(yīng)認(rèn)識到保守性替代可在序列的重要區(qū)域進(jìn)行，如活性位點、結(jié)合位點和起始密碼子編碼的蛋氨酸部位。
根據(jù)本發(fā)明，hFasL蛋白通過C-端直接或間接與糖磷脂共價結(jié)合，優(yōu)選是一種磷脂酰肌醇的糖基化形式，稱為“糖基-磷脂酰肌醇”(下文中稱為“GPI”)，如M.P.Lisanti等在《膜生物學(xué)雜志》(J.Membrane Biol.)，117卷，1-10頁，1990年中所述。
在一具體實施方案中，hFasL蛋白的C-端氨基酸直接或經(jīng)過一個連接子通過酰胺鍵與乙醇胺連接，而乙醇胺則通過磷酸二酯鍵與不同組分和結(jié)構(gòu)的寡糖結(jié)合。這個聚糖的末端單糖是非N端乙?；钠咸前罚湓贑-1位與磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)上C-6位羥基連接。這個分子可進(jìn)一步包含一個甘油脂殘基作為膜結(jié)合區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明，GPI可以為自然條件下存在的GPI結(jié)合蛋白中存在的任何一種結(jié)構(gòu)，例如水解酶如堿性磷酸酶或乙酰膽堿酯酶、哺乳類動物抗原如Thy-1，Thy-3，Ly-6，CD14或CD16、原生類動物如各種錐體蟲表面糖蛋白、細(xì)胞粘附分子如LFA-3或者補(bǔ)體分子如DAF中的。
在一具體實施方案中，本項發(fā)明的FasL-糖磷脂融合蛋白由下面結(jié)構(gòu)式I表示
m是0或1；n是0或1；R是直接健或一個連接子；Ra是直接鍵或者來自選擇的GPI信號的一個或多個氨基酸殘基；R1和R2分別獨立地為一個脂肪族烴基，優(yōu)選是C4-24烷基和C4- 24鏈烯基，更優(yōu)選C12-22烷基或C12-22鏈烯基；R3是H或2Manα1；當(dāng)m是1時，R4是H，
或者4βGalNAc1當(dāng)m是0時，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是人FasL，或其保持Fas結(jié)合特性的一個片段或者一個功能相當(dāng)?shù)淖凅w；Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙酰半乳糖胺，GlcNH2則是非N-乙?；钠咸前贰?br> R可以是一個本領(lǐng)域中用來在融合蛋白中將C-端羧基與氨基相連的連接子。選擇的連接子最好使蛋白質(zhì)具有伸展性，特別對于蛋白質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)。這樣的連接子的例子包括如一段非極性氨基酸單位的序列，如3-6個非極性氨基酸單位，優(yōu)選是甘氨酸和/或丙氨酸單位，如-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-包含hFasL蛋白與糖磷脂部分間的連接子的本發(fā)明融合蛋白包括在下文中表述的“hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白”和“hFasL蛋白-GPI融合蛋白”范圍內(nèi)。
本發(fā)明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，可用化學(xué)合成方法制備，任選以適當(dāng)保護(hù)的形式，化學(xué)連接hFasL蛋白與糖磷脂部分然后需要時除去保護(hù)基團(tuán)。
然而，較方便的是通過重組DNA技術(shù)制備hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白。該方法包括含hFasL蛋白氨基酸序列的蛋白表達(dá)和表達(dá)蛋白的翻譯后修飾生成hFasL蛋白-糖磷脂融合體。在這種方法中，被表達(dá)的蛋白質(zhì)特征性含有一段信號序列，如C-端氨基酸序列，作為被表達(dá)蛋白翻譯后修飾生成hFasL蛋白-糖磷脂融合體的引發(fā)劑和位點。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步也提供了一種核苷酸序列，例如DNA序列，它編碼含有hFasL蛋白氨基酸序列和蛋白翻譯后修飾以得到相應(yīng)的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信號序列的蛋白質(zhì)。
這種DNA序列最好適于在真核細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)。
因此，本項發(fā)明也提供了真核細(xì)胞或細(xì)菌的表達(dá)載體，它包含的DNA序列編碼含hFasL蛋白氨基酸序列和蛋白翻譯后修飾以得到相應(yīng)的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信號序列的蛋白質(zhì)。
除了編碼蛋白質(zhì)的序列外，典型的表達(dá)載體還具有適宜的表達(dá)控制序列，包括合適的啟動子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點和其它適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列。表達(dá)載體還包含1個或更多可供選擇的標(biāo)記物。可以通過各種刺激誘導(dǎo)啟動子，如暴露于一種化學(xué)物質(zhì)或者改變溫度。啟動子還具有細(xì)胞特異性或者細(xì)胞周期的特異性。
啟動子可以是大腸桿菌中有活性的任何一種，如噬菌體T7啟動子，表達(dá)載體可以是質(zhì)粒。在大腸桿菌中表達(dá)可用R1和CO1-E1質(zhì)粒來源的載體。包含病毒啟動子的載體如pXMT2或pXMT3可以用于真核細(xì)胞的表達(dá)。本發(fā)明也提供了用hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白之編碼序列或以上敘述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或真核的宿主細(xì)胞。任何合適的細(xì)菌宿主都可以使用，最好是大腸桿菌。合適的真核宿主細(xì)胞是瞬時表達(dá)的COS細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞。
糖磷脂(如GPI)部分的附加就是翻譯后修飾，通常發(fā)生于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(EP)。糖磷脂(例如GPI)附加的結(jié)果是從新生蛋白羧基端去掉一個疏水序列。這個疏水序列通常是翻譯后修飾信號序列的必要部分。一對CAS(裂解/附加部位)，如Ser-Ser，Ser-Gly，Ser-Ala，與疏水的羧基端結(jié)合通常提供了糖磷脂(如GPI)附加的必要的最小序列。在FasL蛋白序列和翻譯后修飾信號序列之間最好有5-20個，更優(yōu)選7-14個氨基酸的間隔。疏水功能區(qū)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能夠方便地減慢或暫時終止新生蛋白穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，使GPI部分的附加能夠進(jìn)行。
假如被表達(dá)的蛋白質(zhì)包含了一個合適的翻譯后修飾信號序列，在大多數(shù)的宿主細(xì)胞中糖磷脂如GPI的附加都可以進(jìn)行。
編碼含hFasL蛋白氨基酸序列和翻譯后修飾信號序列的蛋白質(zhì)的DNA，可以通過hFasL蛋白編碼序列與編碼信號序列的DNA序列的適當(dāng)連接而得到。
在具體實施方案中，hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用包括以下步驟的方法制備a)通過聚合酶將2個重疊的寡核苷酸補(bǔ)平，產(chǎn)生一個GPI附加信號序列。每個寡核苷酸的5’端和3’端都包含了限制酶切位點。聚合產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體如pXMT3中。b)以含人Fas-配體cDNA的克隆為模板，擴(kuò)增人Fas-配體的細(xì)胞外區(qū)，如包含人Fas-配體序列第136至281位氨基酸的片段。設(shè)計的3’寡核苷酸可編碼所需的連接子和3’端的限制酶切位點。5’端最好不含有限制酶切位點，但需與人Fas蛋白的信號序列有數(shù)個核苷酸如14個核苷酸重疊。人Fas信號序列可通過聚合酶把2個寡核苷酸補(bǔ)平后產(chǎn)生。非編碼的寡核苷酸可以數(shù)個核苷酸，如10-20個，最好是22個核苷酸與Fas-配體重疊。Fas-配體PCR產(chǎn)物以及補(bǔ)平的Fas信號序列典型地通過重疊PCR技術(shù)剪切、消化并克隆到包含GPI信號序列的質(zhì)粒中。相應(yīng)的hFasL-GPI構(gòu)建物如

圖1所示。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白的純化和分離可采用目前任何已知的方法，只要不引起融合蛋白實質(zhì)的降解。例如，親和層析、免疫親和層析、高壓液相層析(HPLC)和快速蛋白液相層析(FPLC)均為適用方法。
本發(fā)明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用于誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，特別是T淋巴細(xì)胞死亡。在移植組織的細(xì)胞表面攜帶了外來的組織相容性抗原時，這些抗原激活受體的細(xì)胞毒T細(xì)胞，經(jīng)過連續(xù)的激活過程破壞了供體細(xì)胞。hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用于治療急性移植物排斥反應(yīng)。常規(guī)治療急性移植物排斥反應(yīng)的方法會嚴(yán)重抑制受體的免疫功能。hFasL蛋白-GPI融合蛋白則能夠特異性針對激活的T淋巴細(xì)胞，而不是免疫系統(tǒng)的所有T淋巴細(xì)胞，即針對攻擊移植組織或器官上表達(dá)Fas抗原的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行更特異地治療。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白還可用于治療慢性移植物排斥反應(yīng)，包括自體移植和異體移植的排斥反應(yīng)。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明提供了2、將hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白引入組織或器官的內(nèi)皮細(xì)胞的方法，該方法包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或與組織一起孵育。
3、一種誘導(dǎo)靶組織或器官的內(nèi)皮細(xì)胞Fas介導(dǎo)死亡的方法，包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或與組織一起孵育。
4、一種預(yù)防或治療組織或器官自體或異體移植物排斥反應(yīng)的方法，包括用純化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注供體的器官，或與供體的組織一起孵育。
根據(jù)以上3-4敘述的方法，本發(fā)明中的融合蛋白特別適于預(yù)止與急性或慢性、器官或組織、自體或異體移植物排斥反應(yīng)有關(guān)的癥狀，特別是移植的血管病變，如移植物動脈粥樣硬化。移植器官包括心臟、肺、心肺、肝臟、腎臟、胰腺(全部或部分的胰腺，如Langerhans島)、皮膚、角膜和骨髓。
本發(fā)明還可提供5、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白在上述2-4敘述的任何方法中的應(yīng)用；6、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白用于制備用于上述2-4敘述的任何方法的藥物組合物的應(yīng)用；7、用于上述2-4敘述的任何方法的組合物，其中包含hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特別是hFasL蛋白-GPI融合蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑和載體。
下面給出的實施例將進(jìn)一步說明而不是限制本發(fā)明。在本發(fā)明的精神內(nèi)，可以作很多變動。實施例1 編碼hFasL-GPI融合蛋白的DNA的質(zhì)粒構(gòu)建和克隆通過Klenow聚合酶將2個重疊的寡核苷酸補(bǔ)平，產(chǎn)生一個來源于人CD16的GPI附加信號序列。5’端包含PstI和SpeI位點，3’端是EcoRI位點。聚合產(chǎn)物磷酸化(通過T4激酶)，凝膠純化并連接到PstI/EcoRI消化的pXMT3表達(dá)載體上。寡核苷酸如下Pst SpelGPI5′GTC ACT AGT TTG GCA GTG TCA ACC ATC TCA TCA TTC TCTCCA CCT GGG TAC CAA GTC TCT TTC TGC TTG GTG ATG GTA(SEQ ID No.3)EcoRIGPI3″GTC GAA TTC TCA AAT GTT TGT CTT CAC AGA GAA ATA TAGTCC TGT GTC CAC TGC AAA AAG GAG TAC CAT CAC CAA GCAGAA (SEQ ID No.4)以含人Fas-配體cDNA的克隆為模板，擴(kuò)增人Fas-配體的細(xì)胞外區(qū)，其中包含了已發(fā)現(xiàn)的人Fas-配體序列的第136至281個氨基酸。設(shè)計的3’寡核苷酸(Fas4)編碼附加的6個甘氨酸基團(tuán)，3’端還有SpeI位點。5’寡核苷酸(Fas3)不含有任何限制酶切位點，但與人Fas蛋白有14個核苷酸重疊。人Fas信號序列通過Klenow聚合酶把2個寡核苷酸(Fas1，F(xiàn)as2)補(bǔ)平后產(chǎn)生。非編碼寡核苷酸有22個核苷酸與Fas-配體重疊。Fas-配體PCR產(chǎn)物以及補(bǔ)平物Fas信號序列通過重疊PCR技術(shù)剪切、凝膠純化、用PstI和SpeI消化并克隆到與上述同樣被消化的包含GPI信號序列的質(zhì)粒中。寡核苷酸如下
FAS1TCT CTG CAG ATG CTG GGG ATC TGG (SEQ ID No.5)FAS2GGG TGG AGC AAC AGA CGT AAG AAC CAG AGG TAG GAG GGTCCA GAT GCC CAG CAT CTG CAG AGA (SEQ ID No.6)FAS3TTA CGT CTG TTG CTC CAC CCC CTG AAA AAA AGG AG(SEQ ID No.7)SpeIFAS4CAA ACT AGT GCC ACC ACC GCC TCC ACC GAG CTT ATA TAAGCC GAA AAA CG (SEQID No.8)整個構(gòu)建物通過Pharmacia Biotech生產(chǎn)的T7測序試劑盒(產(chǎn)品目錄號27-168201)測序。實施例2 純化重組融合蛋白通過T.Suda和Nagata描述的方法，用Fas-Fc親和柱(或者抗FasL抗體親和柱)進(jìn)行純化〔《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med)，1994年，179卷，873-879頁〕。得到內(nèi)毒素游離融合蛋白。實施例3 hFasL-GPI在COS細(xì)胞中的瞬時表達(dá)9×105個細(xì)胞接種于60mm的平皿中，內(nèi)含DMEM和10％FCS，置于37℃，5％CO2中孵化過夜。通過保護(hù)哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega公司)，細(xì)胞用6μg質(zhì)粒DNA(hFasL-GPI)進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染。如圖2所示，轉(zhuǎn)染36小時后用抗人Fas-配體第一單克隆抗體(NOK-1系，Pharmingen公司)和藻紅素標(biāo)記的抗鼠IgG第二抗體，通過FACS作細(xì)胞分析。pXMT3模擬轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞作為陰性對照，用包含人Fas-配體cDNA的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞作為陽性對照(圖3)。圖2 hFasL-GPI表達(dá)構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的FACS分析圖3 陽性和陰性對照使用本發(fā)明的hFasL-糖磷脂融合蛋白灌注的或孵育最好在4℃-37℃溫度下進(jìn)行，持續(xù)2-20小時完成。可將hFasL-糖磷脂融合蛋白加到通常用于移植前保存供體組織或器官的溶液或制品中，如一種所謂的“威斯康星大學(xué)溶液”。另外，融合蛋白還可用在任選緩沖的鹽溶液中，如磷酸鹽緩沖鹽溶液，或者生理鹽水中。hFasL-糖磷脂融合蛋白的濃度不一，最好灌注或孵育溶液的濃度是10-40mg/ml。
本發(fā)明的hFasL-糖磷脂融合蛋白的實用性例如可按下述方法證明。體外試驗COS細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染實施例1的構(gòu)建物，或者編碼整個hFasL蛋白(沒有糖磷脂成分)的對照物構(gòu)建物。這會導(dǎo)致通過跨膜區(qū)與細(xì)胞膜的結(jié)合并在細(xì)胞表面表達(dá)。比較上述細(xì)胞、天然COS細(xì)胞和與純化的hFasL-GPI一起孵育的COS細(xì)胞對Cr標(biāo)記的淋巴瘤L1210和淋巴瘤L1210-FAS〔淋巴瘤細(xì)胞系SchulzM.等，《歐洲免疫學(xué)雜志》，(Eu r.J.Immunol)25474-480，1995年〕的細(xì)胞凋亡效果。由于Fas-L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，淋巴瘤L1210-Fas的細(xì)胞死亡數(shù)比轉(zhuǎn)染實施例1構(gòu)建物的COS細(xì)胞明顯地高。體外試驗A。小鼠心臟灌注小鼠心臟用含有25mg/ml hFasL-GPI的威斯康星大學(xué)溶液(Eurocollins溶液)37℃下灌注8小時。心臟的石蠟切片用生物素化的hFasL抗體探測，以測定hFasL的包埋。B。血管化的異位心臟移植供體動物肝素化同時放血以后，切開氣管塞入冰塊。準(zhǔn)備供體的心臟，結(jié)扎并且分離供體心臟的上腔靜脈、下腔靜脈、左肺動脈和右肺靜脈。結(jié)扎主動脈并且直接分離到在第一叉(右頸總動脈和鎖骨下動脈)被分開的支氣管干部位。另外，通過支氣管殘端注入冷的肝素化鹽水。用實施例2的重組hFasL-GPI融合蛋白灌注器官。剩余的肺靜脈結(jié)扎后，心臟移入冷鹽水中。
心臟植入到受體的腹腔靜脈用11/0 Ethilon(Ethicon，Norderstedt，德國)連續(xù)縫線，從支氣管干到主動脈，右肺動脈到下腔靜脈施行端-邊吻合術(shù)。用6/0 Vicryl(Ethicon公司產(chǎn)品)的二塊敷料覆蓋創(chuàng)面，保暖直到動物完全蘇醒。整個缺血時間在40-50分鐘內(nèi)，其中25-35分鐘是4℃進(jìn)行。吻合期間(10-15分鐘)，要保持移植物為冷的狀態(tài)。
移植以后，通過每日心跳的評定(觸摸)監(jiān)控移植物的功能。心臟停跳為完全的移植物排斥反應(yīng)。在全部試驗中，移植物排斥反應(yīng)通過移植物的組織學(xué)檢查證實。與對照的動物(移植前未用hFasL-GPI灌注)比較，移植前用hFasL-GPI灌注的心臟功能顯著增強(qiáng)。
本發(fā)明的融合蛋白用于預(yù)防或治療移植物排斥反應(yīng)時，可以與免疫抑制治療合并進(jìn)行，例如在移植后給受體免疫抑制劑如環(huán)胞菌素A、環(huán)胞菌素G、FK506、來氟米物或其類似物、咪唑立賓、麥考酚酸、mycophenolate mofetil、免疫抑制性單克隆抗體例如白細(xì)胞受體如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、CTLA4、B7、CD45或CD58或它們的配體的單抗。
序列表(1)一般資料(i)申請者人(A)名稱Sandoz有限公司(B)街道Lichtstrasse 35(C)城市Basel(D)州BS(E)國家瑞士(F)郵政編碼CH-4002(G)電話061-324-2327(H)傳真061-322-7532(A)姓名Sandoz專利公司(B)街道Humboldtstrasse 3(C)城市Loerrach(E)國家德國(F)郵政編碼D-79539(A)名稱Sandoz-Erfindungen Verwaltungs-gesellschaft MBH(B)街道Brunner Strasse 59(C)城市維也納(E)國家奧地利(F)郵政編碼A-1230(ii)發(fā)明名稱Fas配體融合蛋白(iii)序列數(shù)8
(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.25版(EPO)(2)有關(guān)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度281個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vi)來源(A)物種人類(xi)序列描述SEQ ID No.1Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp1 5 10 15Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys20 25 30Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro35 40 45Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro50 55 60Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly65 70 75 80Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly85 90 95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala100 105 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu115 120 125Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg130 135 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr165 170 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr180 185 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser195 200 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met210 215 220Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225 230 235 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His245 250 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser260 265 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu275 280(2)有關(guān)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度146個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vi)來源(A)物種人類(xi)序列描述SEQ ID No.2Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly1 5 10 15Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly20 25 30Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile35 40 45Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly50 55 60Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn65 70 75 80Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser85 90 95Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala100 105 110Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu115 120 125Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr130 135 140Lys Leu145(2)有關(guān)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度78個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.3GTCACTAGTT TGGCAGTGTC AACCATCTCA TCATTCTCTC CACCTGGGTA CCAAGTCTCT 60TTCTGCTTGG TGATGGTA 78(2)有關(guān)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度81個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.4GTCGAATTCT CAAATGTTTG TCTTCACAGA GAAATATAGT CCTGTGTCCA CTGCAAAAAG 60GAGTACCATC ACCAAGCAGA A 81(2)有關(guān)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ IDNo.5TCTCTGCAGA TGCTGGGGAT CTGG 24(2)有關(guān)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.6GGGTGGAGCA ACAGACGTAA GAACCAGAGG TAGGAGGGTC CAGATGCCCA GCATCTGCAG 60AGA 63(2)有關(guān)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.7TTACGTCTGT TGCTCCACCC CCTGAAAAAA AGGAG 35(2)有關(guān)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID No.8CAAACTAGTG CCACCACCGC CTCCACCGAG CTTATATAAG CCGAAAAAACG 50
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，包含-人Fas配體蛋白(hFasL)，或縮短的人Fas配體蛋白或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w，它保持了人Fas配體蛋白與Fas受體結(jié)合、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特性，而且直接或間接地在其C-端連接-糖磷脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中的糖磷脂是糖基-磷脂酰肌醇(GPI)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其具有以下結(jié)構(gòu)式I
m是0或1；n是0或1；R是一直接鍵或一個連接子；Ra是一直接鍵或來自選擇的GPI信號的氨基酸殘基；R1和R2分別是一個脂肪族烴基；R3是H或2Manα1；當(dāng)m是1時，R4是H，
或4βGalNAc1當(dāng)m是0時，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是如權(quán)利要求1中所定義的人FasL，Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙?；肴樘前?，GlcNH2則是非N-乙酰化的葡糖胺。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項的蛋白質(zhì)，其中的hFasL是一種含有hFasL第136至281位氨基酸序列的人可溶性多肽。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項的蛋白質(zhì)，其中的糖磷脂通過連接子與hFasL的C-端連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其中連接子是-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-。
7.編碼含hFasL蛋白的氨基酸序列和蛋白翻譯后修飾以得到權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的信號序列的蛋白質(zhì)的一段核苷酸序列。
8.制備權(quán)利要求1蛋白質(zhì)的方法，包括a)任選以被保護(hù)的形式，化學(xué)連接hFasL蛋白與糖磷脂部分，如果需要則去除保護(hù)性基團(tuán)，或者b)重組DNA方法，包括含hFasL蛋白氨基酸序列的蛋白表達(dá)和所表達(dá)蛋白的翻譯后修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)用于制備一種預(yù)防或治療組織或器官自體或異體移植物排斥反應(yīng)的藥物組合物的應(yīng)用。
10.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
全文摘要
一種蛋白質(zhì),包含:－人Fas配體蛋白(hFasL)或縮短的人Fas配體蛋白,或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w,它們保持了hFasL與Fas受體結(jié)合、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的特性,而且直接或間接地在其C－端連接－糖磷脂。它可以用于預(yù)防或治療組織或器官的移植物排斥反應(yīng)。
文檔編號C07K7/00GK1202200SQ96198369
公開日1998年12月16日 申請日期1996年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月16日
發(fā)明者T·布勒 申請人:諾瓦提斯公司