專(zhuān)利名稱(chēng)：抗登革熱的多價(jià)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗黃病毒科病毒特別是抗諸如登革熱病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒的黃病毒或其他黃病毒科病毒或像丙型肝炎病毒的類(lèi)黃病毒以及它們的混合體(18)的多價(jià)亞單位疫苗。
黃病毒是蟲(chóng)媒病毒家族的病毒(舊稱(chēng)B組蟲(chóng)媒病毒)。它們是一般由嗜血節(jié)肢動(dòng)物(蚊、啤、白蛉)傳播的脊椎動(dòng)物病毒，病毒在傳播前在這些節(jié)肢動(dòng)物中復(fù)制。傳播循環(huán)的保持因而涉及脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和一個(gè)儲(chǔ)庫(kù)。某些蟲(chóng)媒病毒可能與人有關(guān)并導(dǎo)致疾病，這些蟲(chóng)媒病毒尤其見(jiàn)于熱帶地區(qū)。雖然從1930年就已存在抗黃熱病的疫苗，最近又有了抗日本腦炎和蜱傳腦炎的疫苗，但對(duì)其他黃病毒現(xiàn)在還沒(méi)有任何疫苗；對(duì)登革熱尤其如此。
現(xiàn)在有幾千萬(wàn)人感染登革熱，特別是這種疾病以不間斷的大流行橫行于熱帶地區(qū)。登革熱的病因病毒與其載體埃及伊蚊同時(shí)復(fù)制。該疾病的特征是嚴(yán)重發(fā)熱，伴有頭痛、惡心和關(guān)節(jié)及肌肉疼痛，幾天后消失。但是當(dāng)這種病與血容量減少性休克相關(guān)聯(lián)時(shí)，這些癥狀會(huì)加重，導(dǎo)致出血現(xiàn)象，有時(shí)導(dǎo)致死亡，尤其在兒童身上。登革熱的病源體是一種黃病毒科的RNA黃病毒，如同黃熱病病毒或日本腦炎病毒。已知有4個(gè)血清型。出血性登革熱可能是一種已知的不良免疫現(xiàn)象的結(jié)果，其中可能涉及一種與細(xì)胞毒性細(xì)胞免疫誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可造成多種血清型的相繼感染。缺乏動(dòng)物模型阻礙了疫苗的設(shè)計(jì)，因?yàn)檫@樣就不可能詳細(xì)探測(cè)這種病的嚴(yán)重癥狀中所涉及的因素。
抗登革熱的第一種疫苗現(xiàn)正在試驗(yàn)中。這是一種基于在細(xì)胞培養(yǎng)中病毒連續(xù)傳代而減毒的4種活血清型的疫苗。這種疫苗的主要缺陷是減毒病毒毒性回復(fù)的可能性，這是因?yàn)檫z傳回復(fù)或基因組間的重組。它還對(duì)新生兒和免疫低下者有潛在的危險(xiǎn)。另外，用四價(jià)疫苗接種的某些兒童并未顯示出對(duì)抗四種血清型的保護(hù)。
V.Deubel等(1)描述了登革熱病毒的基因組結(jié)構(gòu)和氨基酸序列(特別是血清型2的)。
登革熱病毒是一種約50納米的包被RNA病毒。正如黃熱病病毒，所有病毒蛋白是由約10.5kb的片段編碼的，該片段的結(jié)構(gòu)如下5′C-pre M/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3′結(jié)構(gòu)蛋白是C(殼體)、前基質(zhì)/基質(zhì)(pre M/M)和包膜蛋白(E)。
這些蛋白是由5′片段編碼的，隨后是由基因組其余部分編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。這些蛋白是通過(guò)由細(xì)胞信號(hào)酶和細(xì)胞及病毒的其他蛋白酶介導(dǎo)的蛋白水解加工而產(chǎn)生的。
包膜糖蛋白(E)是主要表面蛋白。Mason等(2)已描述了血清型1的結(jié)構(gòu)。
文獻(xiàn)(1)中描述了血清型2，這是4種血清型中了解較多的；Osatomi K.等(3)描述了血清型3，Zhao等(4)描述了血清型4。
已利用在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體進(jìn)行了許多償試，以開(kāi)發(fā)一般以重組肽或蛋白表達(dá)的亞單位疫苗。
實(shí)際上，桿狀病毒對(duì)這種疫苗生產(chǎn)是很有吸引力的，因?yàn)樗鼈兡苓_(dá)到高水平地遺傳表達(dá)而在人體中又無(wú)致病性。桿狀病毒已用于黃病毒蛋白的表達(dá)登革熱血清型1(5)、登革熱血清型4(DEN-4)(6)和血清型2(DEN-2)已有描述(7)、(8)、(9)，Delenda等(10)描述了血清型2和3。
該病毒4個(gè)血清型相應(yīng)的4種基因組間的序列同源性是較高的；例如這些病毒的蛋白E具有下表1所示的同源百分率
盡管如此，現(xiàn)有技術(shù)中描述的結(jié)構(gòu)沒(méi)有一種能誘導(dǎo)對(duì)抗4種血清型的有效免疫應(yīng)答所得滴度一般較低，而且所產(chǎn)生的抵抗毒性病毒攻擊產(chǎn)生感染的能力不能認(rèn)為是令人滿(mǎn)意的。
但某些結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了良好的免疫原性，特別是如在(11)中所述，包膜糖蛋白在羧基部分缺失100個(gè)氨基酸，獲得了更高的免疫原性。但這對(duì)登革熱的其他血清型無(wú)效。
最后，Delenda等(9，10)已充分說(shuō)明在蛋白羧基端部分截短傾向于提高免疫應(yīng)答。
在異源系統(tǒng)中表達(dá)所獲的重組蛋白的純化常常產(chǎn)生所追求的收率和保持所述蛋白結(jié)構(gòu)(特別是這些糖基化基元)之間的兼容性問(wèn)題。一種有效的技術(shù)是蛋白或肽的親和純化，這些肽或蛋白與起標(biāo)記作用的短氨基酸序列(tag)偶聯(lián)。實(shí)施這種方法的技術(shù)實(shí)例有谷脫苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，在Sepharose-谷胱苷肽珠上純化(12)；蛋白MalE與麥芽糖及其衍生物結(jié)合(13)；蛋白A與免疫球蛋白柱融合(14)；或組氨酸標(biāo)記，后者與絡(luò)合金屬柱有親和力(15)。Schmidt等(16)在最近的一篇文章中描述了這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性。但應(yīng)注意，本領(lǐng)域技術(shù)人員一直尋求在純化步驟后消除組氨酸殘基，特別是利用羧肽酶A。
本發(fā)明源自這樣的發(fā)現(xiàn)一種黃病科病毒即登革熱病毒的一種蛋白中羧基端的缺失用選自組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的氨基酸殘基替代，由這樣產(chǎn)生的多肽或糖蛋白構(gòu)成的多肽或糖肽具有比沒(méi)有加入這種氨基酸的相同多肽或糖肽大得多的免疫原性特征，所述殘基具有改善抗原提呈的效果，從而引起比沒(méi)有這些殘基時(shí)大得多的細(xì)胞和體液應(yīng)答。
在上文和下文中，“多肽”一詞應(yīng)從廣義上理解，即包括含有或不含有糖基或糖脂基的至少15個(gè)氨基酸的序列，無(wú)論其一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)如何。
本發(fā)明更廣泛地講涉及源自黃病毒科的免疫原性提高的多肽，其特征在于其羧基端存在的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基含有選自組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8個(gè)氨基酸。
在本申請(qǐng)中，所述氨基酸殘基可以是同質(zhì)的，如它由2-8個(gè)組氨酸、2-8個(gè)色氨酸或2-8個(gè)半胱氨酸組成；它還可以由這些氨基酸中的2-3種的混合物組成；最后，它還可以含有一些除組氨酸、色氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸，只要其數(shù)目不超過(guò)所述殘基的25％。
這些結(jié)構(gòu)能解決源自所述病毒的某些肽缺乏免疫原性的問(wèn)題，例如登革熱病毒的某些血清型，現(xiàn)有技術(shù)不能制造對(duì)抗它們的亞單位疫苗。
本發(fā)明涉及這樣的免疫原性肽，其由源自登革熱病毒蛋白E，蛋白pre M、蛋白NS1或NS3的一種多肽構(gòu)成，并且在來(lái)自蛋白E的所述多肽中羧基端已缺失70-105個(gè)氨基酸，并由2-8個(gè)選自組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的氨基酸殘基替代。對(duì)于蛋白preM、同樣由可以在其羧基端缺失30-50個(gè)氨基酸并由相同類(lèi)型的氨基酸殘基替代。對(duì)其他蛋白，這種缺失是沒(méi)有必要的；源自NS1或NS3的本發(fā)明多肽含有2-8個(gè)選自組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的氨基酸殘基。
有利的是，本發(fā)明多肽源自蛋白E并缺失約100個(gè)氨基酸；如果所述氨基酸殘基含有2-8個(gè)組氨酸，這賦予所述肽以在二價(jià)或三價(jià)或三價(jià)陽(yáng)離子上固定的特性。本發(fā)明的多肽或肽可源自4種血清型登革熱病毒的每一種，這4種血清型間的同源性百分率很高，對(duì)于蛋白E在67％到80％之間，如上表1中所示。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的多肽混合物構(gòu)成的組合物。這些混合物可構(gòu)成多價(jià)疫苗的活性成分，該疫苗對(duì)抗同一病毒(如登革熱病毒)的不同血清型，或?qū)箤儆谕稽S病毒科或類(lèi)黃病毒科并傾向感染相同人群的不同病毒。
本發(fā)明還涉及適于刺激易感染登革熱病毒個(gè)體的免疫力的組合物，其特征在于它包含至少3種本發(fā)明的多肽或糖肽。一種優(yōu)選的組合物將含有源自4種血清型登革熱病毒每一種的一種蛋白的至少一種本發(fā)明多肽；蛋白E是良好的選擇它具有病毒感染必需的功能，還是病毒和細(xì)胞受體間的中介，蛋白E似乎還是被感染宿主中保護(hù)性免疫應(yīng)答的必要靶子，其中它誘導(dǎo)中和性抗體和免疫細(xì)胞的反應(yīng)。
本發(fā)明的組合物特別有利地為3種4種如上所述的多肽或糖肽的混合物，所述肽部分來(lái)自4種血清型每一種的蛋白E，其中缺失一些氨基酸并以共價(jià)形式連接含2-8個(gè)組氨酸的殘基，優(yōu)選來(lái)自所述病毒每種已知血清型的肽之混合物。
為了使本發(fā)明的免疫原性組合物對(duì)所述3種或4種血清型或甚至出現(xiàn)新血清時(shí)都有效，其中所含的每種肽或糖肽占組合物總肽的重量比為10-50％，優(yōu)選每種肽的百分比基本相同。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可以由內(nèi)源自蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽的混合物組成，其中至少含有登革熱病毒3種亞型的3種抗原，每種都帶有所述羧基端氨基酸殘基。
更廣義的講，本發(fā)明涉及由源自登革熱病毒蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽或糖肽的混合物構(gòu)成的免疫原性組合物，其中含有該病毒3種血清型的至少3種抗原，更廣義地為相應(yīng)于每一已知血清型的一種抗原，不一定在羧基端包含所述的氨基酸殘基，但其特征在于每一肽、多肽或糖肽都具有誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的能力。
本發(fā)明的組合物另外可含有來(lái)自其他黃病毒的多肽、糖肽或蛋白，如來(lái)自黃熱病病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、丙型肝炎病毒或更廣義地非洲、亞洲或美洲熱帶地區(qū)中出現(xiàn)的出血熱的其他黃病毒科病毒、以及必要時(shí)源自其他病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲(chóng)抗原的肽，只要它們?cè)谄漪然┒司哂腥缟纤x的氨基酸殘基。
本發(fā)明還涉及編碼黃病毒科的尤其是登革熱病毒的免疫原性肽的重組核酸序列，其中3′端缺失210-315個(gè)核苷酸，并在3′端加入了編碼上文所述的2-8個(gè)選自組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的氨基酸的序列。本發(fā)明的核酸序列更具體地講編碼來(lái)自登革熱病毒血清型1、2、3或4之蛋白E的糖肽，且3′端加入的序列優(yōu)選為編碼含6個(gè)組氨酸的序列。
本發(fā)明還涉及適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的核酸載體；這種載體除含如上所述的一種核酸序列外，還含有與蛋白編碼序列同源或異源的信號(hào)序列，并一起處于能在所述真核細(xì)胞內(nèi)被活化的一啟動(dòng)子的控制之下。一種優(yōu)選的真核細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，尤其是草地夜蛾SF9細(xì)胞。所述載體是一種穿梭載體pVLD，其可與桿狀病毒進(jìn)行同源重組，并在信號(hào)序列上游帶有桿狀病毒內(nèi)源基因啟動(dòng)子，如polyédrine的啟動(dòng)子。
所述桿狀病毒可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)獲得，但特別有利的技術(shù)是利用大腸桿菌和桿狀病毒之間穿梭載體的同源重組技術(shù)。
按在以下實(shí)驗(yàn)部分更詳細(xì)描述的這種技術(shù)獲得的表達(dá)載體已保存在CNCM，其中-一重組桿狀病毒于1994年12月1日以I-1497號(hào)保存在CNCM，其帶有編碼下述肽的序列該肽由羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸取代的第2血清型登革熱病毒蛋白E構(gòu)成；-一重組桿狀病毒于1995年10月11日以I-1624號(hào)保存在CNCM，其帶有編碼下述肽的序列該肽由羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸取代的第4血清型登革熱病毒蛋白E構(gòu)成；-一重組桿狀病毒于1995年10月11日以I-1625號(hào)保存在CNCM，其帶有編碼下述肽的序列該肽由羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸取代的第3血清型登革熱病毒蛋白E構(gòu)成；-一重組桿狀病毒于1995年10月11日以I-1626號(hào)保存在CNCM，其帶有編碼下述肽的序列該肽由羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸取代的第1血清型登革熱病毒蛋白E構(gòu)成。
本發(fā)明還涉及用于在易感染登革熱病毒的宿主中誘導(dǎo)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的組合物，其含有分別編碼本發(fā)明多肽的核酸的混合物，所述本發(fā)明多肽即為源自登革熱病毒蛋白如蛋白E、preM、NS1或NS3并在其羧基端帶有選自組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的2-8個(gè)氨基酸的殘基的多肽，或更廣義的講所述核酸編碼源自其他黃病毒科病毒如黃熱病病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒或其他類(lèi)黃病毒如丙型肝炎病毒的多肽。事實(shí)上，人們已證明給動(dòng)物注射含有蛋白或多肽表達(dá)必需序列的質(zhì)粒可在宿主中引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，在某些動(dòng)物模型中保護(hù)了動(dòng)物對(duì)抗致死性病毒攻擊；這種結(jié)果已由J.A.Wolff等(1990)，在《科學(xué)》(Science)2471465-1468或由E.F.Fynan等(1993)，在《DNA細(xì)胞生物學(xué)》(DNA cell biol.)12785-789中做了描述。包含這種核酸序列的這些免疫原性組合物和這些組合物必要時(shí)與佐劑一起形成的疫苗也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還涉及抗登革熱病毒、特別是抗所述病毒4種血清型的多價(jià)亞單位疫苗，其含有如上所述的免疫原性組合物，和必要時(shí)的免疫接種佐劑，后者特別為帶有二價(jià)或三價(jià)離子的佐劑如氫氧化鋁或磷酸鈣，或弗氏佐劑型的佐劑，胞壁酰肽衍生物或“ISOM”(免疫刺激復(fù)合物)(19)。本發(fā)明組合物的免疫原效應(yīng)可能是本發(fā)明多肽或糖肽被二價(jià)或三價(jià)離子捕獲的結(jié)果以及可能的多聚體形成的結(jié)果，它們具有比文獻(xiàn)中描述(參考文獻(xiàn)3、7、8、9)的源自登革熱病毒的多肽有更高的致免疫能力。
本發(fā)明的亞單位疫苗也可以由適于引導(dǎo)抗其他黃病毒科病毒之免疫反應(yīng)的組合物構(gòu)成。它們可用于預(yù)防或治療一種病毒的感染或多種病毒的同時(shí)感染。
含有1-4種本發(fā)明的免疫原性多肽或糖肽并必要時(shí)與源自其他黃病毒或出血熱病毒之免疫原性糖肽結(jié)合的本發(fā)明的亞單位多價(jià)疫苗，同時(shí)具有與免疫原活性成分抗病毒不同血清型之效果相關(guān)的多價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，和完全接種的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際上，現(xiàn)存在基于病毒培養(yǎng)連續(xù)傳代而減毒的4種血清型活病毒的抗登革熱疫苗，但如我們?cè)谏衔乃吹降?，這種疫苗有時(shí)對(duì)免疫低下的人或新生兒有危險(xiǎn)，并且對(duì)登革熱的不同血清型特別是4種血清型不總有效。向現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中的疫苗中加入1、2、3或4的種本發(fā)明多肽，也構(gòu)成本發(fā)明的疫苗。
下文詳細(xì)描述一種利用血清型1-4蛋白E(DEN1-DEN4)的具體實(shí)施方案，用于非限定性地說(shuō)明本發(fā)明多肽、多肽組合物和疫苗的結(jié)構(gòu)和功能特性。


圖1代表感染的Sf9細(xì)胞上清中分泌的重組多肽E DEN1到DEN4的電泳圖。放免沉淀的蛋白用內(nèi)切葡糖苷酶F(F)或H(H)處理或不處理(O)。
I.重組桿狀病毒的構(gòu)建
1.制備編碼登革熱病毒包膜蛋白E的基因片段已用于E基因克隆的登革熱病毒株記載在下表2中表2<
2.制備表達(dá)登革熱病毒截短蛋白的重組桿狀病毒用從不同病毒感染的Aedes pseudoscutellaris AP61蚊細(xì)胞提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT/PCR)，制備E基因。蛋白E在其C末端缺失100個(gè)氨基酸后(EΔ100)所具有的氨基酸長(zhǎng)度示于表2最左邊一攔中。
位于待擴(kuò)增基因5′端的寡核苷酸引物具有一個(gè)限制性位點(diǎn)(除登革熱2之外)，起始密碼子ATG，其后有編碼每一蛋白的15氨基酸信號(hào)序列中前6個(gè)氨基酸的核苷酸。位于待擴(kuò)增基因3′端的寡核苷酸的引物具有相應(yīng)于蛋白E6個(gè)氨基酸的序列和其后的6個(gè)組氨酸密碼子，一個(gè)終止碼子和一個(gè)限制位點(diǎn)。這些寡核苷酸的序列如下所示5′末端(有義)登革熱15′CGGGATCCATGGGGATCATTTTCATTTTGCTGATG-3′登革熱25′-GGCCTTGATTTTCATCTTAC-3′登革熱35′-CGGGATCCATGGTGGTTATTTTTATACTATTAATG-3′登革熱45′-CGGGATCCATGACTGTCTTCTTTGTCCTAATG-3′3′末端(反義)登革熱15′-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCTTTCTTGAACCAGCTTAG-3′登革熱25′-GGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCTTTCTTAAACCAGTTG-3′登革熱35′-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCCTTCTTGTACCAGTTAAT-3′登革熱45′-CGGAGCTCAATGATAATGATAATGATACCCTTTCCTGAACCAATGGAG-3′然后將從Aedes pesudoscutellaris AP61細(xì)胞提取的病毒RNA所擴(kuò)增的片段克隆到穿梭載體pVL-poly(17)中。
D(1、2、3或4)EΔ100 His6指在其羧基端已缺失100個(gè)氨基酸并加入了6個(gè)組氨酸殘基的血清型1、2、3或4的蛋白E。
這樣就將編碼蛋白D(1、2、3或4)EΔ100His6和其信號(hào)序列的基因置于polyédrine啟動(dòng)子的控制之下，含于啟動(dòng)子末尾和起始密碼子之間的核苷酸數(shù)目為42(登革熱1、3或4)或50(登革熱2)個(gè)核苷酸。
通過(guò)穿梭載體pVL.D(1、2、3或4)EΔ100 His6和在單Bsu361位點(diǎn)線(xiàn)性化的桿狀病毒AcRP231acZ之間在草地夜蛾Sf9中的同源重組獲得了重組桿狀病毒Ac.D(1、2、3或4)EΔ100His6。通過(guò)平板(plage)方法連續(xù)進(jìn)行3次克隆，篩選了這些重組桿狀病毒。
3.所得重組蛋白的結(jié)構(gòu)特征圖1顯示了相應(yīng)于登革熱病毒1、2、3或4的4種重組蛋白的電泳圖。用內(nèi)切葡糖苷酸F或H處理的蛋白的遷移表明均在一個(gè)或兩個(gè)糖基化位點(diǎn)含有糖基，因?yàn)榉肿恿恐畈怀^(guò)4000道爾頓。
II.蛋白DEΔ100His6的表達(dá)和純化1)Sf9細(xì)胞的感染100億個(gè)Sf9懸浮細(xì)胞由重組桿狀病毒AcD(1、2、3或4)EΔ100His6以感染復(fù)數(shù)2-5感染。感染時(shí)間為28℃下1小時(shí)。然后取接種物，細(xì)胞在2升無(wú)胎牛血清的TC100培養(yǎng)基(GIBCO)中28℃培養(yǎng)3天。
2)感染細(xì)胞上清液的制備感染后3天，于4℃ 2500rpm離心30分鐘，收集2升細(xì)胞培養(yǎng)上清液。4℃攪拌下3-14小時(shí)內(nèi)向上清液中加入400克/升醋酸銨。4℃ 10000rpm 20分鐘離心沉淀，重溶在含有終濃度20μg/ml的抑蛋白酶肽和終濃度1mM的苯基甲磺酰氟的1/20原始體積(100ml)的色譜緩沖液中(0.5MNaCl；20mM Tris-HCl pH7.9)。然后將濃縮的上清液對(duì)100體積的色譜緩沖液透析2次。
3)層析透析液中加入終濃度5mM的咪唑，然后在實(shí)驗(yàn)室溫度下在5ml TALON樹(shù)脂(Clontech)存在下溫育30分鐘(溫和攪拌下)。用含有10mM咪唑的層析緩沖液30ml洗滌樹(shù)脂三次。然后將樹(shù)脂裝入柱中，用10體積的層析緩沖液洗滌，用10ml含50mM咪唑的層析緩沖液洗脫蛋白。用部分收集儀收集各1ml的級(jí)份。用含有100mM咪唑的層析緩沖液進(jìn)行第二次洗脫。合并的含蛋白E級(jí)份用小鼠抗E抗體和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠聯(lián)合抗體、或用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的Ni-NTA聯(lián)合抗體(Qiagen)進(jìn)行斑點(diǎn)印跡來(lái)測(cè)定。
4)純度檢查將每個(gè)級(jí)份的樣品上載于聚丙烯酰胺凝膠上。通過(guò)Western印跡在用硝酸銀染色后驗(yàn)證目的蛋白的存在。
免疫原將5μg純蛋白濃度的病毒蛋白與100μg氫氧化鋁(Alu-gel-S，Serva)混合，并通過(guò)腹膜內(nèi)途徑接種瑞士小鼠。用于免疫接種的登革熱病毒株在AP61細(xì)胞上測(cè)定滴度(通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定病毒灶)并以每只小鼠103個(gè)空斑形成單位(PFU)的比例接種。以含有蛋白E最后三個(gè)氨基酸(KKG)后接6個(gè)組氨酸的肽(KKG His6)作為對(duì)照抗原注射給小鼠。每次注射的接種量含有與Alu-gel混合的100μg肽。
攻擊劑量(does d’épreuve)的計(jì)算給5天齡的幼鼠腦內(nèi)接種0.02ml不同稀釋度的病毒懸液，分析登革熱病毒的致死性。用Reed-Muench的方法計(jì)算殺死50％小鼠的致死劑量(LD 50)。
小鼠的免疫接種給三周齡的小鼠在第3周、4周和6周時(shí)腹膜內(nèi)注射相應(yīng)于登革熱4種血清型之產(chǎn)物(DEΔ100His6或病毒)的混合物進(jìn)行接種，最后一次注射后一周從每只動(dòng)物采血。陰性對(duì)照的接種肽與4種血清型相同。對(duì)每種同源病毒滴定這些血清的中和抗體。這些血清在被動(dòng)轉(zhuǎn)入幼鼠后用于保護(hù)試驗(yàn)。
中和試驗(yàn)在存在Vero細(xì)胞上的50PFU同源病毒的24孔板中，通過(guò)血清中和測(cè)定接種小鼠的抗體滴度。借助抗病毒蛋白抗體和用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG偶合抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，中和抗體滴度相當(dāng)于中和80％病毒灶的稀釋度。
幼鼠保護(hù)試驗(yàn)給前夜接受了0.05ml免疫小鼠血清腹膜內(nèi)注射(被動(dòng)轉(zhuǎn)移)的一組5天齡幼鼠接種100 LD50的病毒。每組被動(dòng)轉(zhuǎn)移的幼鼠接受病毒4種血清型之一的攻擊劑量。觀察這些小鼠三周，記錄麻痹癥狀或死亡。
結(jié)果所得結(jié)果列于下表3中。
該表中綜合了中和抗體滴度和上述條件下毒性病毒攻擊后存活幼鼠百分率的結(jié)果。
對(duì)于每種血清型，比較用含組氨酸殘基的本發(fā)明肽、用活病毒、和用含組氨酸殘基的肽KKG His6所得的結(jié)果，抗原劑量分別為5μg、103Pfu和100μg。
對(duì)注射三次抗原后7周時(shí)采集的血清測(cè)定中和滴度。中和滴度相當(dāng)于導(dǎo)致VERO細(xì)胞上同源病毒株的成灶單位(UFF)減少80％的血清稀釋度的倒數(shù)。這些同源病毒用于中和試驗(yàn)和攻擊試驗(yàn)。
在所示3種情形下，小鼠用四價(jià)混合物免疫接種。
表3
這些結(jié)果顯示這種含有4種重組蛋白的制品誘導(dǎo)針對(duì)病毒所有4種血清型的中和抗體。
因而這種混合物可構(gòu)成抗登革熱多價(jià)亞單位疫苗的基本成分或活性成分。
注射5μg蛋白3天后所產(chǎn)生的中和抗體的高滴度是引人注目的。以前制備的無(wú)組氨酸重組蛋白中沒(méi)有一種能誘導(dǎo)如此高的中和抗體滴度。提出了兩種解釋這些結(jié)果的假說(shuō)一種是以前的蛋白純度不好，含有免疫抑制成分；另一種是含于本發(fā)明蛋白中的6個(gè)組氨酸的序列在由二價(jià)或三價(jià)離子形成的微粒存在下，使其以多聚體形式空間呈現(xiàn)，從而具有特別的免疫原性。
III.四種血清型之一的重組包膜蛋白對(duì)中和抗體的誘導(dǎo)1.每一病毒血清型的包膜蛋白缺失(Δ)其C末端100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸片段(His6)構(gòu)成其C末端，它們通過(guò)桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)并由于其組氨酸尾而在鈷柱上層析純化。將接種抗原以單價(jià)形式注射給小鼠，并且為了進(jìn)行比較，將注射四價(jià)形式后所獲得的結(jié)果列在下表III中的4×DEΔ100 His6一行中。PBS一行代表PBS緩沖液的對(duì)照組。
小鼠的免疫接種
每組10只的各組三周齡BALB/c小鼠D1、D7和D21天用與100μg普通佐劑氫氧化鋁聯(lián)合的5μg重組抗原免疫接種。在D28天從小鼠采血，并測(cè)定對(duì)200成灶單位的每種參照毒株的血清中和(登革熱1夏威夷1944；登革熱2新幾內(nèi)亞C，1944；登革熱3H87，菲律賓1956；登革熱4H251，菲律賓1951)。滴度相應(yīng)于中和50％以上灶的稀釋度的倒數(shù)。
列于下表4中的結(jié)果顯示免疫原D2EΔ100His6和D3EΔ100His6都誘導(dǎo)抗登革熱血清型2的中和抗體的形成，而登革熱血清型3和4分別只被重組蛋白D3EΔ100His6和D4EΔ100His6所中和。最后，D1EΔ100His6沒(méi)有任何中和作用。
表4<
源自血清型D2、D3和D4的重組蛋白看來(lái)特別令人感興趣，用一種純化重組包膜蛋白免疫的猴血清中中和抗體的滴度與用減毒病毒所得的滴度進(jìn)行了比較，結(jié)果列在下表5中。
表5對(duì)登革熱2免疫接種并用一種野生病毒株感染的cynomolgus猴的免疫應(yīng)答
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每組2只的各組猴接受了各種免疫原制劑日本腦炎疫苗(A)；九肽KKG H6(B)；重組包膜蛋白D2EΔ100His6(C)；PBS(D)；減毒登革熱2疫苗(E)。PRNT空斑減少中和試驗(yàn)(參考文獻(xiàn)10)。這些制劑在D0天(A和E)或在采血樣后D0、D28、D56天注射。然后在D83天給猴子皮內(nèi)注射登革熱2病毒(牙買(mǎi)加1983株)的2×105個(gè)感染性顆粒進(jìn)行攻擊。然后在D98天采血。
免疫原的獲取試驗(yàn)猴按月接受三次接種，每次為使用1mg鋁佐劑的100μg肽(B組)。接種三次與1mg鋁佐劑混合的100μg登革熱2重組包膜蛋白(C組)；接種三次與佐劑混合的PBS緩沖液(D組)或接種一次由巴斯德梅奧血清和疫苗公司(PASTEUR MERIEUXSERUM &amp; VACCINS)制造的THAI型減毒的登革熱2活疫苗0.5ml(E組)。
最后一次接種后4周收集血清，并測(cè)定其對(duì)200空斑形成單位(PFU)的牙買(mǎi)加登革熱2同源株的中和抗體。其滴度相應(yīng)于中和50％空斑的血清稀釋度。表5表明了源自登革熱血清型2的重組蛋白在cynomolgus猴中誘導(dǎo)中和抗體的特異性，其應(yīng)答比用減毒病毒所獲得的至少大4倍。
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權(quán)利要求
1.免疫原性多肽或糖肽，其特征在于其由源自一種黃病毒科病毒特別是源自登革熱病毒蛋白E、或pre M、或NS1或NS3的一種多肽或糖肽組成，所述多肽在其羧基端帶有選自組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8個(gè)氨基酸的殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或糖肽，其特征在于所述糖肽由羧基端缺失70-105個(gè)氨基酸的包膜蛋白E組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽或糖肽，其特征在于羧基端序列由6個(gè)組氨酸的殘基組成，該序列使所述多肽具有固定在二價(jià)或三價(jià)陽(yáng)離子上的特性。
4.適用于刺激易受登革熱病毒感染之個(gè)體免疫力的組合物，其特征在于其含有至少一種權(quán)利要求1-3之一的多肽或糖肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于所述糖肽源自登革熱病毒的糖蛋白E。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物，其特征在于所述多肽或糖肽是登革熱病毒至少3種血清型的根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的至少3種多肽的混合物，優(yōu)選每種已知血清型的多肽混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6之一的組合物，其特征在于其含有多肽D3EA100His6和/或多肽D2EΔ100His6。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7之一的組合物，其由源自登革熱病毒蛋白E或preM或NS1或NS3優(yōu)選源自蛋白E的多肽或糖肽組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，其特征在于相對(duì)于所述組合物的總肽，每種肽以10-50％重的比例存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9之一的組合物，其特征在于其還含有來(lái)自其他黃病毒如黃熱病病毒、日本腦炎病毒或丙型肝炎病毒的多肽、糖肽或蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-9之一的組合物，其特征在于其還含有在羧基端帶有選自組氨酸、色氨酸和半胱氨酸的2-8個(gè)氨基酸殘基的病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲(chóng)抗原。
12.核酸序列，其由編碼登革熱病毒一種蛋白的序列組成，且缺失3′端210-315個(gè)核苷酸，并已添加了編碼選自組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8個(gè)氨基酸的3′序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的核酸序列，其特征在于該序列編碼登革熱病毒血清型1、2、3或4的蛋白E。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的核酸序列，其特征在于該3′序列編碼6個(gè)組氨酸。
15.適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的核酸載體，其特征在于其含有權(quán)利要求12-14之一的核酸序列，該序列在5′端帶有與所述序列的蛋白編碼序列同源或異源的信號(hào)序列，它們一起處于可在所述真核細(xì)胞中被活化的啟動(dòng)子控制下。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其特征在于所述真核細(xì)胞為一種昆蟲(chóng)細(xì)胞，特別是草地夜蛾SF9，所述載體為一種易于與桿狀病毒載體實(shí)現(xiàn)同源重組的并在信號(hào)序列上游帶有桿狀病毒內(nèi)源基因的特別是polyedrine的啟動(dòng)子的穿梭載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體，其特征在于它是于1994年12月1日以I-1497號(hào)保藏在CNCM的重組桿狀病毒，其帶有下述肽的編碼序列羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸替代的登革熱病毒血清型2的蛋白E。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1624號(hào)保藏在CNCM的重組桿狀病毒，其帶有下述肽的編碼序列羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸替代的登革熱病毒血清型4的蛋白E。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1625號(hào)保藏在CNCM的重組桿狀病毒，其帶有下述肽的編碼序列羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸替代的登革熱病毒血清型3的蛋白E。
20.根據(jù)權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1626號(hào)保藏在CNCM的重組桿狀病毒，其帶有下述肽的編碼序列羧基端缺失100個(gè)氨基酸并由6個(gè)組氨酸替代的登革熱病毒血清型1的蛋白E。
21.適用于在易感染登革熱病毒的宿主中誘導(dǎo)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的組合物，其特征在于其含有編碼權(quán)利要求1-3之一的多肽的核酸。
22.權(quán)利要求1-4之一的多肽或糖肽的制備方法，其特征在于其包括在與所述2-8個(gè)氨基酸的序列有親和性的載體上進(jìn)行親和層析的步驟。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于所述載體是含有二價(jià)或三價(jià)離子特別是鎳、銅、鈷或鋅的對(duì)富電子組氨酸、色氨酸或半胱氨酸具有親和力的柱子。
24.抗登革熱病毒的多價(jià)疫苗，其特征在于其含有根據(jù)權(quán)利要求4-11和21之一的免疫原性組合物，必要時(shí)還有任何疫苗佐劑，特別是帶有二價(jià)或三價(jià)離子的佐劑如氫氧化鋁或磷酸鈣，或弗氏佐劑類(lèi)型的佐劑，或胞壁酰肽衍生物或免疫刺激復(fù)合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的多價(jià)疫苗，其特征在于其還含有來(lái)自其它黃病毒如黃熱病病毒或日本腦炎病毒、或蜱傳腦炎病毒或丙型肝炎病毒的免疫原性多肽或糖肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的多價(jià)疫苗，其特征在于其含有相應(yīng)于登革熱病毒每種血清型的4種肽或糖肽，及含有二價(jià)或三價(jià)離子的佐劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的多價(jià)疫苗，其特征在于它含有據(jù)權(quán)利要求1-3之一的1、2、3或4種肽或糖肽以及減毒病毒。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的多價(jià)疫苗，其特征在于它除含有根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的多肽外，還含有一種或多種病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲(chóng)抗原。
29.一種多價(jià)疫苗，其特征在于它含有攜帶權(quán)利要求1-3之一多肽之編碼序列的核酸的混合物。
30.由源自登革熱病毒蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽或糖肽組成的抗原組合物，其特征在于它含有該病毒三種不同血清型的至少3種抗原，優(yōu)選含4種血清型中每一種的抗原。
全文摘要
抗黃病毒科特別是抗登革熱病毒的多價(jià)亞單位疫苗,其含有源自每一血清型的重組肽,該肽羧基端用含2—8個(gè)組氨酸、色氨酸或半胱氨酸的肽取代。
文檔編號(hào)C07K14/18GK1202201SQ9619831
公開(kāi)日1998年12月16日 申請(qǐng)日期1996年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月14日
發(fā)明者V·狄尤貝爾, I·斯塔羅波利 申請(qǐng)人:巴斯德研究所