專利名稱：用表面活性劑沉淀法分離提純蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)提取純化方法，特別是涉及一種用表面活性劑沉淀法分離純化蛋白質(zhì)的方法，屬生物化學(xué)、生物資源綜合利用、生物制藥等技術(shù)領(lǐng)域。
蛋白質(zhì)的分離純化是生物工程(尤其是蛋白質(zhì)工程)和生化制藥(如胰臟中提取胰島素)的重要工序。因此，蛋白質(zhì)(生物大分子)的分離提純，在實(shí)際生產(chǎn)和理論研究中均顯得十分重要。目前，從各種生物器官或發(fā)酵細(xì)菌中分離提純蛋白質(zhì)的典型過程一般包括①、組織的破粹；②、溶液抽提；③、硫酸銨或乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑分步沉淀；④、重新溶解而后再分步沉淀；⑤、分子篩或離子柱層析；⑥、冷凍干燥(張龍翔編《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》，1982年出版，北京大學(xué)出版社，P143-216)。在④分步沉淀的過程中，將要使用大量的硫酸銨(一般在溶液中的濃度達(dá)到50％以上)，或者有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑的用量濃度一般也在50％以上)；這種消耗通常是不可避免的。同時，工藝步驟也長，導(dǎo)致成本比較高。另外，一般生物組織中同時含有多種蛋白質(zhì)或生物大分子(如胰臟中含有十幾個蛋白質(zhì))，能夠同時利用的不多(一般只能聯(lián)產(chǎn)胰島素和胰酶兩個產(chǎn)品)，造成生物資源的浪費(fèi)。
本發(fā)明克服了上述方法的缺陷，其目的在于提供一種既能簡化純化步驟，又能充分利用原料的蛋白質(zhì)分離純化方法。
發(fā)明具體內(nèi)容如下對已知蛋白質(zhì)的溶液，依次采取下列步驟提取①、利用酸或堿或其它緩沖體系，調(diào)節(jié)溶液的pH大于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，控制溶液的pH小于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉淀30-60分鐘，離心，棄沉淀，即除去雜蛋白質(zhì)。
②、用酸或堿調(diào)節(jié)上清液的pH，使溶液的pH小于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，使溶液的pH大于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉淀30-60分鐘，離心，收取沉淀，即為所需蛋白質(zhì)。
上述是對于已知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)的分離提純，對于未知蛋白質(zhì)，可從pH＝0或pH＝14開始，改變?nèi)芤旱膒H，仍按上述①、②操作，即可得到未知蛋白質(zhì)；純度相同。
要利用溶液中的所有蛋白質(zhì)，對于生物組織抽提液，可從pH＝0或pH＝14開始，逐次增大或降低溶液的pH0.5-1.0個單位，仍按上述①或②操作，逐次收集沉淀，即可將溶液中的蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)的不同分為14-28個等分。
上述方法中的酸可以是硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸堿可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀等強(qiáng)堿緩沖體系是一價型的，如NaAc-HAc(醋酸鈉—醋酸)等陰離子表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉、烷基苯黃酸鈉等陽離子表面活性劑可以是溴化十二烷基三甲銨、氯化十四烷基三甲銨等上述方法所獲得的蛋白質(zhì)，其純度用SDS凝膠電泳法測定為電泳單點(diǎn)純。
本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①、步驟少。由于同一表面活性劑在某一pH下只沉淀某一等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，因此，可以一次沉淀就得到電泳單點(diǎn)純級的蛋白質(zhì)樣品(純樣品)。
②、藥品用量少。引起蛋白質(zhì)沉淀所需要的表面活性劑量很少，僅1mM濃度(大約0.5％)就可引起蛋白質(zhì)沉淀。
③、生物資源可以充分利用。溶液抽提得到的混合物，可以調(diào)節(jié)溶液為不同的PH，即把溶液按1-1.5個PH的級差分級沉淀，得到不同等電點(diǎn)的分離物。
由于上述的優(yōu)點(diǎn)，該方法在生化制約，特別是酶制劑的分離提純方面具有廣闊的前景。
實(shí)施例一分離牛血清(等電點(diǎn)為4.9)和肌酸激酶(等電點(diǎn)為6.1)混合蛋白質(zhì)配成1g/L的濃度，調(diào)節(jié)溶液的pH＝6.0(比肌酸激酶的等電點(diǎn)小0.1，比牛血清大1.1)，加十二烷基硫酸鈉(SDS，一種陰離子表面活性劑)使?jié)舛葹?000mmol/L沉淀60分鐘、離心，沉淀為牛血清。上清液調(diào)pH＝13(比肌酸激酶的等電點(diǎn)大7個pH)，加SDS30mmol/L，沉淀30分鐘，離心，沉淀為肌酸激酶。二者均為電泳單點(diǎn)純。
實(shí)施例二提取溶菌酶(等電點(diǎn)為11)雞蛋清用水調(diào)開，煮沸，取溶液(抽提液)；用堿調(diào)節(jié)溶液的pH為11.5(溶菌酶的pH為11)，加溴化十二烷基三甲銨(CMBB，一種陽離子表面活性劑)20mmol/L，沉淀40分鐘、離心，棄沉淀(為雜蛋白質(zhì))。上清液調(diào)pH為10.5，加0.1mmol/LCMBB，沉淀60分鐘、離心，收集沉淀。即為溶菌酶，純度為電泳單點(diǎn)純。
實(shí)施例三未知蛋白質(zhì)的提取對于心臟抽提液，先調(diào)溶液的pH＝0，加SDS使?jié)舛冗_(dá)30mmol/L，沉淀30分鐘、離心，收集沉淀，即為等電點(diǎn)小于0的蛋白質(zhì)組分。再調(diào)溶液的pH＝1.0，加SDS使?jié)舛冗_(dá)50mmol/L，沉淀30分鐘，離心，收集沉淀，即為等電點(diǎn)在0-1之間的蛋白質(zhì)組分。再調(diào)溶液的pH＝2，加SDS使?jié)舛冗_(dá)80mmol/L，沉淀60分鐘，離心，沉淀即為等電點(diǎn)1-2的蛋白質(zhì)組分。依次類推，得到不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)組分。
權(quán)利要求
1.一種用表面活性劑沉淀法分離提純蛋白質(zhì)的方法，其特征在于依次包括下列步驟①、利用酸或堿或其它緩沖體系，調(diào)節(jié)溶液的pH大于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，控制溶液的pH小于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉淀30-60分鐘，離心，棄沉淀，即除去雜蛋白質(zhì)。②、用酸或堿調(diào)節(jié)上清液的pH，使溶液的pH小于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陰離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-500.0mM；或者，使溶液的pH大于待提取的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)0.1-7.0個pH，加入陽離子表面活性劑，使溶液中表面活性劑單體的終濃度為0.1-1000.0mM。沉淀30-60分鐘，離心，收取沉淀，即為所需蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種用表面活性劑沉淀法分離提純蛋白質(zhì)(主要用于酶的分離和提純)的方法，該方法是通過調(diào)節(jié)待提溶液的pH為一定值再加入一定濃度的陽離子或陰離子表面活性劑使所提蛋白質(zhì)沉淀離心分離得到。該方法不僅能分離提取已知蛋白質(zhì)，還能一次提取生物組織抽提液中的一系列蛋白質(zhì)，從而充分利用資源。同時還具有操作簡單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，使其在生化制藥，特別是在提取酶制劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K1/30GK1144807SQ9610625
公開日1997年3月12日 申請日期1996年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月10日
發(fā)明者李學(xué)剛 申請人:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)