專利名稱：從美麗紅豆杉莖葉中提取分離紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從天然植物中提取分離有效成分的方法，具體地說是一種從美麗紅豆杉(Taxus mairei)莖葉中提取分離紫杉醇(Taxol)的方法。
眾所周知，紫杉醇是一種雙萜類化合物。1971年由Wani等(Wani Mc，et al，J.A.C.S.93，2325，1971.)從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中首次分離得到。它對B-16黑色素瘤、L-1210和P-388白血病、MX-1乳腺癌和異種移植的CX-1結(jié)腸癌等許多腫瘤模型顯示極滿意的抗癌活性，由于它的作用機(jī)理獨(dú)特，能促使微管蛋白聚合形成微管，并在其存在下微管不再解體，使癌細(xì)胞限制在構(gòu)架組織內(nèi)而死亡[Dentsch-HM et al，J.M.C.32(4)，788，1989； Manfredi JJ，et al，Phannacol ther 25，83，1984.]。因此，它已成為國內(nèi)外科學(xué)家在抗腫瘤藥物研究中的焦點(diǎn)，并且研究進(jìn)展十分迅速。1992年12月，美國FDA批準(zhǔn)BMS公司的紫杉醇作為轉(zhuǎn)移性卵巢癌的二線治療藥；1993年12月又批準(zhǔn)該藥作為晚期乳癌治療藥。目前該藥已經(jīng)在美、英、德、法等20多個(gè)國家批準(zhǔn)上市，其年銷售量已超過3億美元。隨著該藥的上市以及它對人體黑色素瘤、白血病、小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌進(jìn)行II期和III期臨床試驗(yàn)的滿意療效，已經(jīng)使紫杉醇供不應(yīng)求。1992年美國有關(guān)專家預(yù)測，在最近二十年內(nèi)很難再找到比紫杉醇療效更高的天然藥物。并呼吁全世界都來關(guān)心和提高紫杉醇的供應(yīng)量，以緩解它的臨床需要[Chemical and Engineering，69(35)，11—18，1991；Kingston DGI，et al，J.N.P.53(1)，1，1990.]。中國藥科大學(xué)與日本岐阜藥科大學(xué)合作研究美麗紅豆杉莖皮未能得到紫杉醇；美國Purdue大學(xué)和臺(tái)灣Hinchu工業(yè)技術(shù)研究所使用研究美麗紅豆杉針葉僅僅完成HPLC定量測定該植物含有紫杉醇0.006—0.008％；中國醫(yī)科院北京藥物研究所研究了東北紅豆杉(Taxus cuspidata)枝葉，其報(bào)道紫杉醇的得率為0.0007％以下；目前國外對紅豆杉類植物莖葉中的10一去乙?；鶟{果赤霉素III等化合物的研究較廣泛，但是只見報(bào)道HPLC定量測定該植物莖葉中紫杉醇的百分含量，而未見報(bào)導(dǎo)從莖葉中制備紫杉醇。1988年法國科學(xué)家報(bào)道從歐洲紅豆杉(Taxus baccata)的針葉中分離得到?？赏ㄟ^比較簡單的半合成法轉(zhuǎn)化為紫杉醇或其它有關(guān)的活性藥物。全世界可供研究的紅豆杉共有九個(gè)種類和四個(gè)變種，而我國占有四個(gè)種類和一個(gè)變種，資源豐富。近年來，北京、上海、南京、廣州、昆明等地的一些科研單位和大專院校相繼對東北紅豆杉(Taxus cuspidata)、美麗紅豆杉[梁敬鈺等，化學(xué)學(xué)報(bào)，46，1053，1988；46，210，1988；J.-y.Zhou et al，LaternationalResearch eongress on Natural Products Halifax，N.S.，Canada July31-August4，1994，P59；佟曉杰等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，29(1)，55，1994.]和云南紅豆杉(Taxus yusanenensis)開展了研究[陳未名等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，26(10)，747，1991；Mingky，el al，Phytochem 27，1534，1988.]，但不僅得率低且提取方法尚不完善。從長期生產(chǎn)的需要出發(fā)，從莖葉中提取紫杉醇是一個(gè)較佳的途徑。采集針葉和嫩枝不會(huì)損傷植物，還可以不斷再生，將會(huì)起到保護(hù)自然資源和生態(tài)系統(tǒng)，造益于人類。因此，從天然植物中提取紫杉醇的高效、簡易的方法仍為人們探素的課題。
本發(fā)明的目的是提供一種從天然植物美麗紅豆杉中提取分離紫杉醇的方法。
本發(fā)明的方法是以美麗紅豆杉的莖葉作原料，可以經(jīng)粉碎、溶劑浸出、濃縮得深綠色膏狀物，加入適量水稀釋，再用溶劑提取，提取液濃縮后用柱層析方法分離，除溶劑得紫杉醇粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物經(jīng)第二次柱層析分離即可獲純度為≥98％的紫杉醇，得率大于十萬分之七。
本發(fā)明中所用的浸出液是提高得率的關(guān)鍵之一。浸出液是二種或二種以上的混合溶劑。具體地說是乙醇和除乙醇外的水溶性的極性溶劑的混合物，也可以含有少量的水。它們的重量比依次為1∶0.01—0.30∶0—0.20。推薦的重量比是1∶0.01一0.10∶0—0.10。所述的水溶性的極性溶劑可以是除乙醇以外的其它水溶性的極性溶劑。如低碳鏈的酯、低碳鏈的醇，丙酮，乙腈等。低碳鏈的酯和醇可以是甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸甲酯，丙酸乙酯、甲醇、丙醇等。
在用上述混合溶劑浸出美麗紅豆杉莖葉時(shí)，至少要浸潤美麗紅豆杉莖葉，最好混合溶劑過量一些，以使浸出完全，用非常大量的混合溶劑浸出時(shí)也是有利于浸出的，但要增加濃縮或回收溶劑的工作量和能耗。通常美麗紅豆杉與混合溶劑的重量比為1∶30。采用更多的混合溶劑也是有利的。推薦采用的重量比為1∶1—5。
采用混合溶劑浸出時(shí)，最好用上述的方法用新的混合溶劑多次浸出，如浸出3—6次，以提高浸出率。更多次的浸出，對提高浸出率效果不顯著。
采用本發(fā)明的方法中，可以采用低碳鏈多氯代烷或混合多氯代烷提取，如二氯甲烷和三氯甲烷的混合液。柱層析分離可以采用硅膠柱層析，用低碳鏈的氯代烴和低碳鏈的醇混合溶劑洗脫，直至紫杉醇全部洗出。濃縮后獲粗產(chǎn)品。
粗產(chǎn)品可以用醇和水重結(jié)晶純化，再用層析分離，如正相或反相的硅膠層析分離，用極性溶劑或和水作洗脫劑，濃縮獲≥98％純度的紫杉醇，得率大于十萬分之七。
采用本發(fā)明的方法，不僅可采用高山上生長的美麗紅豆杉莖葉，如東北紫杉(又稱紅豆杉)和云南的美麗紅豆杉。而且也可采用丘陵及平地上的、生長較快的美麗紅豆杉莖葉作原料，如浙江美麗紅豆杉莖葉。這也是本發(fā)明的又一重要的內(nèi)容。
目前生產(chǎn)紫杉醇的主要原料是紅豆杉植物的樹皮，但剝樹皮會(huì)導(dǎo)致樹木的死亡，最終會(huì)影響生態(tài)平衡。而浙江美麗紅豆杉容易人工種植，生長速度較快，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該植物莖葉中紫杉醇的含量理想，是一種很有發(fā)展前途、可再生的紫杉醇的植物資源。所以，我們采用從莖葉中提出紫杉醇，不會(huì)破壞植物資源，經(jīng)濟(jì)效益顯著，造益于社會(huì)。
如上所述，采用本發(fā)明的方法，不需從紅豆杉的樹皮或根中提取紫杉醇，采用美麗紅豆杉莖葉作原料，有利于資源保護(hù)和原料不斷的提供。而且，本發(fā)明的方法簡便，原料豐富、得率高，適宜于規(guī)模生產(chǎn)。
通過下述實(shí)施例將有助于對本發(fā)明的理解，而不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例中熔點(diǎn)用Bortius熔點(diǎn)測定儀測定，未校正；旋光度用Perkin-Elmer241旋光儀測定；核磁共振譜用Bruker AMX-600型和AM-300核磁共振儀測定；質(zhì)譜用JMS-DX300和Quattro GC/ms/ms質(zhì)譜儀測定；柱層析用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，HPLC用日本島津HPLC儀測定。顯色劑為5％H2SO4乙醇溶液。
實(shí)施例1取10Kg經(jīng)室溫自然干燥的浙江美麗紅豆杉莖葉，經(jīng)粉碎后，用95％乙醇和乙酸乙酯、丙酮、乙腈、丙醇或甲醇的1∶0.01-0.3重量比的混合溶劑浸提3—6次，每次莖葉與溶劑重量比為1∶5。浸出液減壓濃縮得深綠色膏狀物，然后加入適量H2O稀釋，用CH2Cl2和CHCl3混合液萃取。合并CH2Cl2提取液，減壓濃縮得提取物400—450g。然后，將CH2Cl2提取物進(jìn)行硅膠柱層析分離，采用CH2Cl2-MeOH混合溶劑梯度洗脫，共收集80—90流份，每份300ml-400ml。用板層析檢查所有流份，合并含有紫杉醇的流份，蒸去溶劑，得809。所得粗品再次進(jìn)行硅膠柱層析，并用甲醇/水結(jié)晶純化可以得到含紫杉醇1.95g。然后采用旋轉(zhuǎn)薄層層析(正相硅膠或反相硅膠)或反相硅膠柱高效液相儀上進(jìn)行最后分離，用甲醇/水作為洗脫劑，得≥98％紫杉醇0.72g，得率為十萬分之七點(diǎn)二。
實(shí)施例2同實(shí)施例1，采用混合溶劑浸出1次。獲98％紫杉醇，得率0.0061％。
實(shí)施例3分別用云南和東北紅豆杉的莖葉作原料，其余同實(shí)施例1。分別實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次，純度為98％紫杉醇的得率均與以上類似，分別為0.0075％和0.0073％。
結(jié)構(gòu)鑒定紫杉醇，分子式為C47H51NO14白色針狀或白色粉狀結(jié)晶(H2O—MeOH或H2O-CH3CN)，mp217—218℃，[α]D20—48.5·(CO.20，MeOH)，薄層顯紫色，IR(KBr)CM-13460(OH，NH)，1730，1720，1710(C＝0)，1650(NHC＝0)。FAB—MS m/z854(MH+)，794(MH+—HOAC)，569(MH+—CH16H15O4N)。490，430，404，324，307，105(基峰)。1HNMR(CD3Cl，600MHz)δ(ppm)1.16(3H，s，17-CH3)，1.25(3H，s，16-Me)，1.69(3H，s，19-Me)，1.81(3H，s，J＝1.1，18-CH3)，1.87(1H，m，6β-H)，2.24(3H，s，OAc)，2.30(2H，m，14-H2)，2.39(3H，s，OAc)，2.55(1H，ddd，J＝6.6，9.7，14，9Hz，6α-H)，3.81(1H，d，J＝7.0，3H)，4.20和4.31(each 1H，d，J＝8.5，20-H2)，4.40(1H，dd，J＝6.6，10.8，7-H)，4.79(1H，brs，Z′-H)，4.94(1H，dd，J＝2.1，9.5，5-H)，5.68(1H，d，J＝7，2-H)，5.78(1H，d，J＝8.8Hz，3′-H)，6.23(1H，brt，J＝8.3Hz，13-H)，6.28(1H，s，10-H)，7.00(1H，s，J＝8.8Hz，NH)，7.40(5H，m，Ar-H)，7.50(4H，m，Ar-H)，7.61(2H，t，J＝7Hz，Ar-H)，7.76(2H，d，J＝7.2Hz，Ar-H)，8.14(2H，d，J＝7.2Hz，Ar-H)，上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)記載相一致。
實(shí)施例4國內(nèi)外比較本發(fā)明的結(jié)果與國內(nèi)外比較的結(jié)果列于表中
權(quán)利要求
1.一種從美麗紅豆杉(Tarus mairei)莖葉中提取紫杉醇的方法，包括溶劑浸出、濃縮、加入適量水稀釋，溶劑提取，提取液用柱層析分離和濃縮，其特征在于采用乙醇、除乙醇外的水溶性極性溶劑和水的混合溶劑浸出，重量比依次為1∶0.01—0.3∶0—0.20。
2.一種如權(quán)利要求1所述的的從美麗紅豆杉莖葉中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的乙醇、除乙醇外的水溶性極性溶劑和水的混合溶劑重量比依次為1∶0.01—0.10∶0—0.10。
3.一種如權(quán)利要求1所述的的從美麗紅豆杉莖葉中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的水溶性極性溶劑是丙酮、乙腈、低碳鏈的酯或除乙醇外的醇。
4.一種如權(quán)利要求1所述的從美麗紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是用所述的混合溶劑提取3—6次。
5.一種如權(quán)利要求1所述的從美麗紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是用低碳鏈的多氯代烷或混合多氯代烷提取，經(jīng)硅膠柱層析。
6.一種如權(quán)利要求1所述的從美麗紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是再經(jīng)重結(jié)晶和層析分離。
7.一種如權(quán)利要求1、2、3或4所述的從美麗紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征是所述的美麗紅豆杉莖葉是浙江產(chǎn)的美麗紅豆杉的莖葉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從美麗紅豆杉莖葉中提取紫杉醇的方法，采用混合溶劑浸出、濃縮、溶劑提取、硅膠柱層析后獲粗產(chǎn)品，再經(jīng)重結(jié)晶純化和柱層析分離可獲≥98％純度的紫杉醇，得率十萬分之七左右。本發(fā)明方法可選用資源豐富的浙江紅豆杉莖葉為原料。本方法不僅簡易、且產(chǎn)物純度和得率高，資源豐富，適于規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07D305/00GK1124735SQ9411404
公開日1996年6月19日 申請日期1994年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月17日
發(fā)明者盧立晃, 梁奕和, 邱毅華, 盧立修, 俞超美, 李榕, 賀小群 申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院