專利名稱：提高1，2-二氧環(huán)乙烷化學(xué)發(fā)光作用的方法的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有熒光化合物和穩(wěn)定態(tài)1，2-二氧環(huán)乙烷的組合物，所述1，2-二氧環(huán)乙烷可由包括酶在內(nèi)的化學(xué)試劑觸發(fā)，而產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光作用。更具體地講，本發(fā)明涉及一種大幅度提高化學(xué)發(fā)光的方法，即在一特定的集合體內(nèi)通過分子間能量轉(zhuǎn)移形成熒光化合物。所述集合體，例如膠束，它使二氧環(huán)乙烷與熒光化合物保持緊密的間隔。
1.發(fā)光的機(jī)制放熱的化學(xué)反應(yīng)過程中釋放能量。實(shí)際上在所有情況下，這種能量都是以振動(dòng)激發(fā)或熱的形式出現(xiàn)。但有少數(shù)化學(xué)過程產(chǎn)生光或化學(xué)作用，而不產(chǎn)生熱。產(chǎn)生光的機(jī)制包括高能物質(zhì)(常常是有機(jī)過氧化物，例如，1，2-二氧環(huán)乙烷)經(jīng)熱分解或催化分解產(chǎn)生呈三重線或單線電子激發(fā)態(tài)的反應(yīng)產(chǎn)物。單線激發(fā)態(tài)熒光導(dǎo)致所謂的直接化學(xué)發(fā)光作用。化學(xué)發(fā)光的量子產(chǎn)額是單線態(tài)化學(xué)激發(fā)和熒光量子產(chǎn)額的產(chǎn)物。通常用效率表示這些定量;即有效(%)＝Φ×100，可以利用從三重線態(tài)或單線態(tài)產(chǎn)物到熒光受體的能量轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生間接的化學(xué)發(fā)光作用。間接化學(xué)發(fā)光作用的量子產(chǎn)額是單線態(tài)或三重線態(tài)的化學(xué)激發(fā)，能量轉(zhuǎn)移及能量受體熒光的量子產(chǎn)額的產(chǎn)物。
2.生物發(fā)光中的二氧環(huán)乙烷中間體。
1968年，McCapra提出在包括熒火蟲在內(nèi)的各種生物發(fā)光反應(yīng)中，1，2-二氧環(huán)乙烷可能是關(guān)鍵的高能中間體。(F.McCapra，Chem.Commun.，155，(1968))。盡管這類物質(zhì)顯然很不穩(wěn)定，并且一直沒有分離出或被光譜鑒定過，但是通過O18標(biāo)記實(shí)驗(yàn)清楚地證實(shí)了它是該反應(yīng)的中間體。(O.Shimomura and F.H Johnson，Photochem.Photobid.，30，89(1979))。
3.首次合成真正的1，2-二氧環(huán)乙烷。
1969年，kopecky和Mumford報(bào)導(dǎo)通過β-溴氫過氧化物的堿催化環(huán)作用首次合成了二氧環(huán)乙烷(3，3，4-三甲基-1，2-二氧環(huán)乙烷)。(K.R.KopeckyandC.Mumford，can.J.Chem.，47，709(1969))。正如McCapra預(yù)言的那樣，該二氧環(huán)乙烷在加熱至50℃時(shí)確實(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，并分解成丙酮和乙醛。但是該過氧化物比較不穩(wěn)定，由于迅速分解而不能在室溫(25℃)下貯存。另外化學(xué)發(fā)光效率很低(低于0.1%)。
Bartlett，和Schaap，Mazur和Foote.分別開發(fā)了另一更方便的合成1，2-二氧環(huán)乙烷的途徑。在分子氧及光敏染料的存在下，將適宜取代的鏈烯光氧化，以很高的收率產(chǎn)生二氧環(huán)乙烷。(P.D.BartlettandA.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，92，3223(1970)andS.MazurandC.S.Foote，J.Amer.Chem.Soc.，92，3225(1970))。該反應(yīng)的機(jī)制包括光化學(xué)產(chǎn)生稱之為單線態(tài)氧的亞穩(wěn)定物，后者與鏈烯經(jīng)歷2+2環(huán)加成得到二氧環(huán)乙烷。研究表明，采用該反應(yīng)可以制得各種二氧環(huán)乙烷。(A.P.Schaap，P.A.Burns，andK.A.Zaklika，J.Amer.Chem.Soc.，99，1270(1977);K.A.Zaklika，P.A.Burns，andA.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，100，318(1978);K.A.Zaklika，A.L.Thayer，andA.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，100，4916(1978);K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.BurnsandA.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);andA.P.Schaap，A.L.Thayer，andK.Kees，OrganicPhotochemicalSynthesis，Ⅱ，49(1976))。在這一研究過程中，開發(fā)了一種光氧化聚合物鍵合敏化劑(apolymerboundsensitizer)。(A.P.Schaap，A.L.Thayer，E.C.Blossey，andD.C.Neckers，J.Amer.Chem.Soc.，97，3741(1975);andA.P.Schaap，A.L.Thayer，K.A.Zaklika，andP.C.Valenti，J.Amer.Chem.Soc.，101，4016(1979))。
這種新型敏化劑已獲得專利權(quán)并以商品名“SENSITORTM”出售。(美國專利4，315，998(2/16/82);加拿大專利1，044，639(12/19/79))。有關(guān)這一產(chǎn)品應(yīng)用的文獻(xiàn)已超過50篇。
4.由具有立體位阻的鏈烯制備穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷Wynberg發(fā)現(xiàn)具有立體位阻的鏈烯[如二金剛烷聯(lián)烯(adamantylideneadamantane)]經(jīng)光氧化，得到一種很穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷。(J.H.Wieringa，J.Strating;H，Wynberg，andW.Adam，TetrahedronLett.，169(1972))。Turro和Schaap的協(xié)作研究表明該二氧環(huán)乙烷的分解活化能為37Kcal/mol;室溫(25℃)半衰期超過20年(N.J.Turro，G.Schuster，H.C.Steinmetzer，G.R.Faler，andA.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，97，7110(1975))。事實(shí)上，這是迄今文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中最穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷。Adam和Wynberg最近建議可將官能化的二金剛烷聯(lián)烯1，2-二氧環(huán)乙烷用于生物醫(yī)學(xué)目的(W.Adam，C.Babatsikos，andG.Cilento，Z.Naturforsch.，39b，679(1984);H.Wynberg，E.W.Meijer，andJ.C.Hummeten，BioluminescenceandChemiluminescence，M.A.DelucaandW.D.McEtoroy(Eds.)AcademicPress，NewYork，P.687，1981;andJ.C.Hummelen，T.M.Luider，andH.Wynberg，MethodsinEnzymology，133B，531(1986))，但是，將這一異常穩(wěn)定的過氧化物用于化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記所需要的檢測(cè)溫度為150至250℃。顯然，這些條件不適宜在水介質(zhì)中測(cè)定生物分析物。McCapra，Adam，和Foote指出將螺旋稠環(huán)或多環(huán)烷基與二氧環(huán)乙烷結(jié)合有助于穩(wěn)定那些沒有龐大立體基團(tuán)時(shí)很不穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷。(F.McCapra，I.Beheshti，A，Burford，R.A.Hann，andK.A.Zaklika，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，944(1977);W.Adam，L.A.A.Encarnacion，andK.Zinner，Chem.Ber.，116，839(1983);G.G.Geller，C.S.Foote，andD.B.Pechman.TetrahedronLett.，673(1983);P.Lechtken，Chem.Ber.，109，2862(1976);andP.D.BartettandM.S.Ho，J.Amer.Chem.Soc.，96，627(1974))
5.取代基對(duì)二氧環(huán)乙烷化學(xué)發(fā)光的影響在過氧環(huán)上連接特殊的取代基可以改變二氧環(huán)乙烷的穩(wěn)定性和化學(xué)發(fā)光效率。(K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.Burns，andA.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);A.P.SchaapandS.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982);A.P.Schaap，S.Gagnon，andK.A.Zaklika，TetrahedronLett.，2943(1982);andR.S.Handley，A.J.Stern，andA.P.Schaap，TetrahedronLett.，3183(1985))。下文示出的具雙環(huán)系統(tǒng)的結(jié)果闡述了各種官能團(tuán)對(duì)二氧環(huán)乙烷性質(zhì)的巨大影響。由2，3-二芳基-1，4-二噁烯衍生的羥基取代二氧環(huán)乙烷(X＝-OH)在室溫(25℃)的分解半衰期為57小時(shí)，并在稍高溫度下加熱時(shí)，產(chǎn)生很低水平的發(fā)光作用。相反，該二氧環(huán)乙烷在-30℃與堿從θ捶3.鏨了傅睦脊狻6啊ρa(bǔ)芯勘礱鰨涸冢玻怠媯皚ブ首擁畝躉環(huán)乙烷(X＝O-)分解比質(zhì)子形式(X＝OH)快5.7×106倍。
由于兩種競(jìng)爭(zhēng)分解機(jī)制引起了這兩種二氧環(huán)乙烷的性質(zhì)差別。(K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.Burbs，and A.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);A.P.Schaap and S.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982);A.P.Schaap，S.Gagnon，and K.A.Zaklika，Tetrahedron Lett.，2943(1982);and R.S.Handley，A.J.Stern and A.P.Schaap，Tetrahedron Lett.，3183(1985))。多數(shù)二氧環(huán)乙烷的裂解方式是O-O鍵均裂并形成雙自由基。另一機(jī)制適用于帶有像O-取代基的低氧化電位的二氧環(huán)乙烷。其引發(fā)裂解的方式是電子在分子內(nèi)由取代基向過氧化物鍵的反鍵軌道轉(zhuǎn)移。
6.二氧環(huán)乙烷的化學(xué)觸發(fā)上文介紹了文獻(xiàn)中的第一個(gè)實(shí)例(A.P.SchaapandS.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982))。但是，羥基取代的二氧環(huán)乙烷和由芳基-1，4-二噁烯衍生的任何其他二氧環(huán)乙烷由于極不穩(wěn)定而沒有任何用途。它們?cè)?5℃時(shí)半衰期僅為幾小時(shí)。無論是該二氧環(huán)乙烷還是前體鏈烯都無法回避制備衍生物。少量的胺(T.Wilson，Int.Rev.Sci.Chem.，Ser.TWO，9，265(1976))和金屬離子[T.Wilson，M.E.Landis，A.L.Baumstark，andP.D.Bartlett，J.Amer.Chem.Soc.，95，4765(1973);P.D.Bartlett，A.L.Baumstark，andM.E.Landis，J.Amer.Chem.Soc.，96，5557(1974)]即可破壞這些未經(jīng)穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷，并且不能將它們用于酶觸發(fā)所需的水性緩沖液。
7.在均相溶液中涉及二氧環(huán)乙烷的能量轉(zhuǎn)移型化學(xué)發(fā)光。
Wilson和Schaap介紹了涉及二氧環(huán)乙烷的能量轉(zhuǎn)移型化學(xué)發(fā)光的第一個(gè)實(shí)例(T.WilsonandA.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，93，4126(1971))。熱分解很不穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷(順式二乙氧基二氧環(huán)乙烷)得到單線和三重線激發(fā)態(tài)的甲酸乙酯。9，10-二苯蒽和9，10-二溴蒽的加成反應(yīng)分別通過單線態(tài)一單線態(tài)和三重線態(tài)一單線態(tài)的能量轉(zhuǎn)移提高了化學(xué)發(fā)光作用。因此，許多其他學(xué)者采用這些技術(shù)確定各種二氧環(huán)乙烷經(jīng)熱分解而產(chǎn)生的化學(xué)激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的收率(例如，參見W.Adam，InChemicalandBiologicalGenerationofExicitedStates，W.AdamandG.Cilento，Eds.Ch.4，AcademicPress，NewYork，1892)。然而由于電子激發(fā)態(tài)物質(zhì)的存在期短，所以在均相溶液中轉(zhuǎn)移能量需要高濃度的能量受體。而高濃度就帶來了自身終止和重吸收的問題。本發(fā)明采用下述方法解決了這一問題，即采用1，2-二氧環(huán)乙烷和熒光能量受體(最好將兩者以膠束態(tài)結(jié)合)提供有效的能量轉(zhuǎn)移，而在本體溶液中無須高濃度的熒光物。
8.采用膠束分子間能量提高二氧環(huán)乙烷化學(xué)發(fā)光作用。
水溶液中的膠束可以加速各種化學(xué)反應(yīng)的速率(參見例如，E.H.Cordes和R.B.Dunlap，Acc.Chem.Res.，2，329(1969))。催化作用起因于膠束假相中底物的溶解作用以及靜電，疏水或極性因素。有人已將水性膠束用于增加化學(xué)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷的速率(A.P.Schaap，F(xiàn)inalTechnicalReporttotheOfficeofNavalResearch，1987，P.16)。采用諸如共表面活性劑的熒光化合物提高化學(xué)發(fā)光效率的實(shí)驗(yàn)未見報(bào)道。
有數(shù)篇報(bào)道介紹了由膠束環(huán)境內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)提高化學(xué)發(fā)光作用。但沒有一篇利用向熒光共表面活性劑的能量轉(zhuǎn)移。有關(guān)膠束中穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷尚無人研究。Goto已研究了在中性，陰離子和陽離子表面活性劑存在下的熒光素的化學(xué)氧化反應(yīng)[T.GotoandH.Fukatsu，TetrahedronLett.，4299(1969)]。提高化學(xué)發(fā)光作用的原因在于與水溶液相比，在膠束中反應(yīng)產(chǎn)物的熒光效率增加。有人報(bào)道了十六烷基三甲基胺溴化物對(duì)于9，10-二氫吖啶酯類在堿性水溶液中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9，201(1976))。但是，McCapra指出膠束環(huán)境并不“有助于激發(fā)反應(yīng)”。相反，有人認(rèn)為膠束是通過降低競(jìng)爭(zhēng)速率，不發(fā)光的水解反應(yīng)來提高發(fā)光率。同樣，Nikovauras和Gundermann分別研究了膠束對(duì)光澤精和魯米諾衍生物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響(C.M.Paleos，G.Vassilopoulos，andJ.Nikokavouras，BioluminescenceandChemiluminescence，AcademicPress，NewYork，1981，P.729;K.D.Gundermann，Ibid.，P.17)。Shinkai觀察到相對(duì)于水而言，在膠束中可以提高不穩(wěn)定的，非同位素標(biāo)記的二氧環(huán)乙烷的化學(xué)發(fā)光率(S.Shinkai，Y.Ishikawa，O.Manabe，andT.Kunitake，Chem.Lett.，1523(1981))。這些作者推論在膠束的疏水中心的激發(fā)態(tài)產(chǎn)額高于在水中的產(chǎn)額。
僅有一篇文獻(xiàn)談到了用表面活性劑提高酶促產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光作用，該文獻(xiàn)即為Kricka和Deluca關(guān)于熒火蟲蟲熒光素酶系統(tǒng)的著作(L.J.Kricka和M.Deluca，Arch.Biochem.Biophys.，217，674，(1983))。非離子去污劑和聚合物通過增加酶的周轉(zhuǎn)來提高總體發(fā)光率。陽離子表面活性劑(如十六烷基三甲基胺溴化物，CTAB)實(shí)際上導(dǎo)至蟲熒光酶催化活性的競(jìng)爭(zhēng)抑制。
一種用于提高魯米諾/過氧化酶反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光率的方法是加入6-羥基苯并噻唑衍生物或?qū)θ〈谋椒?G.H.G.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Moseley，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31，1335(1985);G.H.G.ThorpeandL.J.Kricka，MethodsinEnzymology，133，331(1986);andL.J.Kricka，G.H.G.Thorpe，andR.A.W.Stott，Pure&Appl.Chem.，59，651(1987))。該作用機(jī)制還不清楚，但它確實(shí)不包括分子內(nèi)或分子間能量轉(zhuǎn)移至共膠束熒光表面活性劑。
已將共膠束熒光探針用于研究膠束的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。(Y.Kubota，M.Kodama，andM.Miura，Bull.Chem.Soc..Jpn.，46，100(1973);N.E.SchoreandN.J.Turro，J.Amer.Chem.Soc.，96，306(1974);andG.W.Pohl，Z.Naturforsch.，31C，575(1976))。但在文獻(xiàn)中還未見采用這些熒光材料通過能量轉(zhuǎn)移程序提高膠束中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的實(shí)例。
9.化學(xué)發(fā)光的免疫測(cè)定在提交申請(qǐng)(序列號(hào)887，139)之前，未見將二氧環(huán)乙烷用作酶底物或?qū)⑺鼈冇糜诿嘎?lián)測(cè)定的報(bào)道。Wynberg采用穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷作為“熱化學(xué)發(fā)光”標(biāo)記物，用于免疫測(cè)定(J.C.HummelenT.M.Luider，andH.Wynberg，MethodsinEnzymology，133B，531(1986))。這些二氧環(huán)乙烷用來標(biāo)記蛋白質(zhì)之類的生物物質(zhì)。將該樣品加熱到100至250℃，并檢測(cè)由熱引起的化學(xué)熒光，由此測(cè)定生物物質(zhì)。這一技術(shù)不同于采用三重線態(tài)二氧環(huán)乙烷作為酶底物的技術(shù)。
已將魯米諾衍生物，吖啶鎓酯類和光澤精作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物用于抗原，抗體和半抗原。(H.R.SchroederandF.M.Yeager，Anal.Chem.，50，1114(1978);H.Arakawa，M.Maeda，andA.Tsuju，Anal.Biochem.，79，248(1979);andH.Arakawa，M.Maeda，andA.Tsuji，Clin.Chem.，31，430(1985).Forreviews，seeL.J.KrickaandT.J.N.Carter，InClinncalandBiochemicalLuminescence，L.J.KrickaandT.J.N.Carter(Eds.)，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1982，Ch.8;L.J.Kricka，Ligand-BinderAssays，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1985，Ch.7;F.McCapraandI.Beheshti，InBioluminescenceandChemiluminescenceInstrumentsandApplications，Vol.I，K.VanDyke(Ed.)，CRCPress，Inc.，BocaRaton，F(xiàn)L，1985，Ch.2，Note，inParticular，thesectionondioxetanes，P.13;andG.J.R.Barnard.J.B.Kim，J.L.Williams，andW.P.Collins，Ibid，Ch.7)。涉及用酶標(biāo)記抗原，抗體及半抗原的測(cè)定系統(tǒng)稱之為酶免疫測(cè)定。通過顏色或熒光顯現(xiàn)技術(shù)檢測(cè)上述酶標(biāo)記物。最近，用魯米諾/過氧化氫，焦棓酚/過氧化氫，Pholasdactylus熒光素，或魯米諾在堿性條件下測(cè)定過樣化酶結(jié)合物，從而奠定了發(fā)光酶免疫測(cè)定法的基礎(chǔ)。(L.J.KrickaandT.J.N.Carter，InClinicalandBiochemicalLuminescence，L.J.KrickaandT.J.N.Carter(Eds.)，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1982，Ch.8)。在本人申請(qǐng)(序列號(hào)為887，139)之前，沒有任何酶聯(lián)測(cè)定法介紹將二氧環(huán)乙烷用作酶催化底物，進(jìn)而產(chǎn)生供檢測(cè)的光。
10.發(fā)光反應(yīng)的攝影檢測(cè)。
已將瞬攝影膠片和X-線膠片用于記錄由數(shù)種化學(xué)發(fā)光作用和生物發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)射。(L.J.KrickaandG.H.G.Thorpe，MethodsinEnzymology，133，404(1986)andreferencestherein.seealsoM.M.L.Leong，C.Milstein，andR.Pannel，J.Histochem.Cytochem.，34，1645(1986);R.A.Bruce，G.H.G.Thorpe，J.E.C.Gibbons，P.R.Killeen，G.Ogden，L.J.kricka，andT.P.Whitehead，Analyst，110，657(1985);J.A.Matthews，A.Batki，C.Hynds，andL.J.Kricka，Anal.Biochem.，151，205(1985);andG.H.G.Thorpe，T.P.Whitehead，R.Penn，andL.J.Kricka，Clin.Chem.，30，806(1984)在本人的申請(qǐng)(序列號(hào)為887，139)之前，文獻(xiàn)中沒有出現(xiàn)由化學(xué)或酶觸發(fā)穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷引起的化學(xué)發(fā)光作用的攝影檢測(cè)實(shí)例。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種方法和組合物，用于提高可觸發(fā)的1，2-二氧環(huán)乙烷的化學(xué)發(fā)光作用。本發(fā)明的目的二是提供可用于免疫測(cè)定，并可以和酶聯(lián)DNA探針一起使用的方法和組合物。參照下列說明書和附圖，本發(fā)明的上述目的和其他目的則更加顯而易見。


圖1示出磷酸酯取代的二氧環(huán)乙烷2C在二甲苯中熱分解的Arrhenius圖。
圖2示出二氧環(huán)乙烷2b的堿觸發(fā)反應(yīng)的化學(xué)熒光量子產(chǎn)額與十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)濃度的函數(shù)關(guān)系圖。圖2a表示二氧環(huán)乙烷與熒光共表面活性劑和CTAB表面活性劑形成的理想化結(jié)構(gòu)。
圖3表示在2-氨基-2-甲基-1-丙醇(221)緩沖液(PH 10∶3)中，于37℃，在100ml含堿性磷酸酶的人體血清中，濃度為10-5M的二氧環(huán)乙烷2c的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖。
圖4示出了二氧環(huán)乙烷2clog(平穩(wěn)期光強(qiáng)度)與log(血清毫升數(shù)，1-100)的關(guān)系圖。
圖5示出了二氧環(huán)乙烷2c的log(50秒光強(qiáng)度)與log(血清毫升數(shù)，1-100)的關(guān)系圖。
圖6示出了化學(xué)熒光光譜(曲線A)，不加CTAB和發(fā)光共表面活性劑3時(shí)，在221緩沖液中觸發(fā)二氧環(huán)乙烷2c產(chǎn)生的化學(xué)熒光;(曲線B)加入CTAB和3后，二氧環(huán)乙烷經(jīng)酶觸發(fā)而產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移化學(xué)熒光。
圖7示出了在3ml 221緩沖液中，在CTAB熒光劑和2.7×10-15摩爾堿性磷酸酶存在下(實(shí)驗(yàn)D)，二氧環(huán)乙烷2C光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖。無酶的試劑空白的光強(qiáng)度等于時(shí)間為0時(shí)的光強(qiáng)度。
圖8示出了在0至3分鐘內(nèi)，log(光強(qiáng)度積分值)與log(堿性磷酸酶摩爾數(shù))的關(guān)系圖。
圖9示出了在加有CTAB/熒光劑和2.3×10-17摩爾堿性磷酸酶的200ml 221緩沖液中，二氧環(huán)乙烷c的光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖。
圖10示出了在0至30分鐘內(nèi)，log(光強(qiáng)度積分值)與log(堿性磷酸酶摩爾數(shù))的關(guān)系圖。
圖11是采用ASA3000 Pdaroid Type57膠片對(duì)由二氧環(huán)乙烷2c引起的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行攝影檢測(cè)的結(jié)果。將含有堿性磷酸酶，二氧環(huán)乙烷，Mg(OAC)2，CTAB，熒光素表面活性劑3的221緩沖液(100ml)在Dynatech ImmulonTM井中，于37℃保溫1小時(shí)，然后在該溫度攝影15分鐘。堿性磷酸酶的量為A，2700渺摩爾;B，250渺摩爾;C，23渺摩爾;D，無酶(不可見)試劑對(duì)照。
圖12是采用ASA3000 Pdaroid Type57膠片對(duì)由二氧環(huán)乙烷2c引起的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行攝影檢測(cè)的結(jié)果。將含有堿性磷酸酶，二氧環(huán)乙烷，Mg(OAC)2，CTAB，熒光素表面活性劑3的221緩沖液(100ml)在Dynatech ImmulonTM井中，于37℃保溫1小時(shí)，然后在該溫度攝影30分鐘。堿性磷酸酶的量為A，250渺摩爾;B，23渺摩爾;C，2渺摩爾;和D，無酶(不可見)試劑對(duì)照。
圖13示出了再100ml含有CTAB/熒光劑，1.3ngS-抗原和堿性磷酸酶結(jié)合物抗體的221緩沖液中，二氧環(huán)乙烷2c的光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖。無酶試劑空白的光強(qiáng)度等于時(shí)間為0的光強(qiáng)度。
圖14示出了在0至15分鐘內(nèi)，log(光強(qiáng)度積分值)與log(涂敷在微井上的S-抗原ng數(shù))的關(guān)系圖。
圖15是在221緩沖液(100ml)中，用二氧環(huán)乙烷2c，Mg(OAC)2，CTAB，熒光素表面活性劑3對(duì)S-抗原進(jìn)行化學(xué)熒光測(cè)定。繼發(fā)光計(jì)實(shí)驗(yàn)后，將7支ImmulonTM井在37℃保溫30分鐘，然后用ASA 3000 Poleroid Type 57膠片在同一溫度進(jìn)行15分鐘攝影。從較低的左側(cè)向較高的右側(cè)S-抗原的量依次為112，56，28，14，7，3.5和1.3ng，在最右側(cè)的最后一支井只含有試劑(不可見)。
圖16是對(duì)S-抗原的化學(xué)發(fā)光測(cè)定。用50ng S-抗原涂敷四支井，與MABA9-C6單克隆抗原體反應(yīng)，與抗鼠IgG-堿性磷酸酶結(jié)合物反應(yīng)，然后在221緩沖液(100ml)中用二氧環(huán)乙烷2C，Mg(OAC)2，CTAB，和熒光素表面活性劑3進(jìn)行測(cè)定。將該井在45℃保溫1小時(shí)，然后，在同一溫度用ASA3000 Polardid Type 57膠片進(jìn)行30秒的攝影。中心的對(duì)照井(不可見)只含有置于CATB/熒光素緩沖液中的二氧環(huán)乙烷。
本發(fā)明涉及一種發(fā)光方法，該方法包括提供一種熒光化合物和與之以緊密間隔相聯(lián)系的下式所示穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物
式中Arox是由X-氧基取代的芳基，當(dāng)通過致活劑觸發(fā)該化合物，除去X時(shí)，它形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，該不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物隨后分解，并釋放出電能，形成光和兩個(gè)下式所示的羰基化合物
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在活性試劑的作用下可以將它除去，進(jìn)而行成不穩(wěn)定的中間體1，2-二氧環(huán)乙烷;其中A是鈍性有機(jī)基團(tuán)，它允許產(chǎn)生光并允許用致活劑分解穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷，在分解過程中，熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解時(shí)而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光，它的強(qiáng)度比單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷時(shí)產(chǎn)生的光的強(qiáng)度大。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及一種發(fā)光方法，該方法包括提供一種熒光化合物和與之緊密相鄰的下式所示穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷
式種R1和R2一起，以及R3和R4一起連接成以螺旋稠合亞烷基，后者可以含有雜原子(N，S，O或P)，和芳環(huán)，在R1和R2中或R3和R4中至少有一個(gè)是芳基，上述芳基環(huán)由X-氧基取代，當(dāng)該取代基由選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體等的致活劑觸發(fā)，除去X時(shí)，便形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷，這樣，不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，釋放出電能，形成光和兩個(gè)下式所示的含羰基化合物
式中，未經(jīng)X-氧基團(tuán)取代的R1，R2，R3或R4是含碳原子或雜原子的有機(jī)基團(tuán)所述有機(jī)基團(tuán)可為穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物提供穩(wěn)定性;式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑作用下它被除去，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體;在致活劑的作用下使穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，在分解過程中熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
本發(fā)明換涉及觸發(fā)時(shí)能產(chǎn)生光的組合物，該組合物包括熒光化合物和下式所示的穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷
式中Arox代表由X-氧基團(tuán)取代的芳基，在致活劑的作用下，觸發(fā)該化合物除去X，而形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，然后，后者分解，釋放出電能，形成光和下式所示的兩個(gè)含羥基化合物
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑的作用下可將該基團(tuán)除去，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷;式中A是允許產(chǎn)生光的鈍性有機(jī)基團(tuán);在該組合物中，在致活劑作用下，穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
該組合物所采用的優(yōu)選二氧環(huán)乙烷與所述方法相同。
本發(fā)明還涉及發(fā)光的方法，該方法包括提供一種熒光化合物和與之緊密相鄰的下式所示穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷化合物。
式中R1選自烷基，烷氧基，芳氧基，二烷基，或芳氨基，三烷基或芳基甲硅烷氧基和包括與R2螺旋稠合芳基在內(nèi)的芳基，其中R2是芳基(可包括R1)并且該R2還可以由X-氧基團(tuán)取代，后者在致活劑的作用下除去X，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物。所述致活劑選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體;結(jié)果不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，釋放出電能，形成光和下式所示兩個(gè)含羰基的化合物;
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，經(jīng)致活劑作用除去X形成不穩(wěn)定的氧化物中間體;式中R3和R4選自芳基，雜烷基和烷基，R3和R4可以以螺旋稠合多聚環(huán)烷基和多聚環(huán)芳基的形式連在一起;在致活劑的作用下，穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，其中熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
與激發(fā)態(tài)二氧環(huán)乙烷產(chǎn)物相比，任何在其單線激發(fā)態(tài)具有較低能量的熒光化合物均可用于提高化學(xué)發(fā)光效率。最好將長鏈烷烴(最好是8至20個(gè)碳原子)連接到熒光劑上，這樣它可起到共表面活性劑的作用，使該物質(zhì)能結(jié)合入所設(shè)計(jì)的系統(tǒng)中去。熒光劑的實(shí)例包括任何熒光染料;芳香化合物(包括萘類，蒽類，芘類，聯(lián)苯類);吖啶類;香豆素類;呫噸類;酞菁類;芪類;呋喃類;噁唑類;噁二唑類;和苯并咪唑類。最好采用能與所述熒光化合物形成膠束的表面活性劑，這樣可以使1，2-二氧環(huán)乙烷貼近熒光化合物。文獻(xiàn)(Chapter1，page1至8，“Catalysis·inMicellarandMacromolecutarSystems”publishedbyAcademicPress，(1975)。)介紹了可能的表面活性劑兩性離子類;陽離子類(銨鹽，吡啶鎓鹽，硫鎓鹽);陰離子(硫酸鹽，磺酸鹽，羧酸鹽);中性(聚氧乙烯衍生物，環(huán)糊精，長鏈酯，長鏈酰胺);和天然表面活性劑(類脂)。
特別是本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定的下式所示1，2-二氧環(huán)乙烷化合物的方法組合物
式中，R1選自含1至8個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，R2選自芳基，二芳基，多環(huán)芳香基稠合環(huán)(R2可以是取代或未取代的)，R3C-選自含有6至30個(gè)碳原子的多環(huán)烷基，式中OX是一取代在芳環(huán)上的氧基，該基團(tuán)由致活劑激發(fā)，除去X，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2二氧環(huán)乙烷化合物，所述致活劑選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體源;X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑的作用下可將X除，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體，其中(Ⅰ)化合物在致活劑存在下分解，產(chǎn)生光和含羰基的下式兩個(gè)化合物
本發(fā)明還涉及使用式(Ⅱ)所示穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物的方法和組合物，式(Ⅱ)為
式中Arox是螺旋稠合的芳基，該基團(tuán)含有一個(gè)環(huán)取代的X-氧基團(tuán)，其中，在致活劑作用下觸發(fā)Arox除去X形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，所述致活劑選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體;X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑的作用下可將X除，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷，這樣不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，形成光和兩個(gè)下式所示的含羰基衍生物R3C＝O和-OArc＝O其中，R3C-選自含有6至30個(gè)碳原子的多環(huán)烷基。在該結(jié)構(gòu)中，R1和R2是連在一起的。
就下式所示結(jié)構(gòu)而言
(1)當(dāng)R1不與R2結(jié)合時(shí)，該基團(tuán)最好是烷基，烷氧基，二烷基或芳氨基，三烷基或芳基甲硅氧基。所述烷基最好含有1至8個(gè)碳原子。R1也可以是含有6至14個(gè)碳原子的脂肪環(huán)或芳香基，其中包括稠合芳環(huán)化合物。當(dāng)R1與R2結(jié)合時(shí)，它們提供了含有6至30個(gè)碳原子的芳基。
(2)R2是由X-氧(OX)基團(tuán)取代的芳基，該芳基可以是苯基，聯(lián)苯基，稠合苯基或其他芳基;R2可以含有6至30個(gè)碳原子，并且也可以包括其他取代基。X是在致活劑作用下可以被除去的任何易變基團(tuán)，例如，-OX基團(tuán)可以選自羥基，烷基或芳基羧基酯，無機(jī)含氧酸鹽，特別是磷酸鹽和硫酸鹽，烷基或芳基甲硅氧基和氧吡喃糖苷基團(tuán)。
(3)R3和R4可以與R1相同。在下列實(shí)施例中，R3和R4結(jié)合在一起形成多環(huán)亞烷基(為了便于合成和比較尤為如此);但是可以使用任何有機(jī)基團(tuán)。該多環(huán)亞烷基最好含有6至30個(gè)碳原子。
即使穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物可被致活劑觸發(fā)，但它們?cè)谑覝?20-35℃)下具有相當(dāng)長的半衰期。所有的先有技術(shù)化合物要么在室溫下不穩(wěn)定，要么其熱分解溫度高達(dá)50℃或更高，因此，對(duì)大多數(shù)應(yīng)用目的而言，它們是不適用的。
所述致活劑可以是化學(xué)致活劑或酶致活劑。在某些情況下，需要(F-)1當(dāng)量，而在其他情況(酶促)下，僅需要極少量即可。在有關(guān)該題目的任何標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)論著中都介紹了這類致活劑，其中包括酸，堿，鹽，酶和其他無機(jī)及有機(jī)催化劑。所采用的試劑取決于被致活的穩(wěn)定1，2-二氧環(huán)乙烷所處的條件及1，2-二氧環(huán)乙烷上X基團(tuán)的易變程度。可采用電子授體除去X，這些電子授體包括還原劑及其他電子源。
1，2-二氧環(huán)乙烷分解，形成兩個(gè)含羰基的化合物和光。不穩(wěn)定1，2-二氧環(huán)乙烷中間體的結(jié)構(gòu)式為
一般，通過氧加成于適宜的鏈烯形成-Arox取代的1，2-二氧環(huán)乙烷。通過烷基和/或芳基取代的下式所示含羰基化合物合成這些鏈烯化合物
在極性有機(jī)溶劑(尤其是四氫呋喃)中，在氫化鋁鋰或其他金屬氫化物存在下，上述物質(zhì)與過渡態(tài)鹵代金屬鹽(尤其是氯化鈦)和叔胺堿反應(yīng)。該反應(yīng)一般在回流的四氫呋喃中進(jìn)行，一般在約4至24小時(shí)內(nèi)完成該反應(yīng)。
穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷的制備及化學(xué)觸發(fā)已發(fā)現(xiàn)通過化學(xué)和酶促方法可以觸發(fā)熱穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷，進(jìn)而產(chǎn)生所要求的化學(xué)發(fā)光作用(A.P.Schaap，專利申請(qǐng)序號(hào).887，1397月17日提交，A.P.Schaap，R.S.Handley，andB.P.Giri，TetrahedronLett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，andB.P.Giri.TetrahedronLett.，1155(1987);andA.P.Schaap，M.D.Sandison，andR.S.Handley，TetrahedronLett.，1159(1987))。為此，推出了具有下述幾個(gè)關(guān)鍵特征的用于生產(chǎn)二氧環(huán)乙烷的新合成方法(1)利用螺旋稠合金剛烷基的穩(wěn)定效應(yīng)制得了在環(huán)境溫度下“存放壽命”達(dá)數(shù)年的二氧環(huán)乙烷;(2)將某一殘基摻入該結(jié)構(gòu)，使該羰基裂解產(chǎn)物具有直接化學(xué)發(fā)光作用;(3)得到了觸發(fā)穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷分解導(dǎo)致其化學(xué)發(fā)光的新方法。
在THF中，采用三氯化鈦/LAH，使2-金剛烷酮與芳香酯或酮反應(yīng)，制得了所需要的鏈烯(A.P.Schaap，1986年7月17日提交的專利申請(qǐng)書，序號(hào)為887，139)。該申請(qǐng)是采用McMurry法，由酮和酯進(jìn)行分子間縮合形成乙烯基酯的首篇報(bào)道。盡管McMurry早就研究過酮和酯官能團(tuán)的分子反應(yīng)，但他僅用該方法制得了環(huán)酮，而未制得乙烯酯(J.E.McMurryandD.D.Miller，J.Amer.Chem.Soc.，105，1660(1983))。
使這些乙烯酯光氧化，得到易于操作的二氧環(huán)乙烷，這些化合物具有理想的熱穩(wěn)定性。例如，下文所示的二氧環(huán)乙烷的活化能為28.4Kcal/mol，25℃半衰期是3.8年。該二氧環(huán)乙烷存于鄰二甲苯中的樣品在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置了幾個(gè)月，但仍未檢測(cè)到其分解。
在室溫下，通過用氟離子除去甲硅烷保護(hù)基，可以方便地觸發(fā)該二氧環(huán)乙烷化學(xué)發(fā)光分解。產(chǎn)生不穩(wěn)定的芳基氧化物，后者裂解產(chǎn)生很強(qiáng)的蘭光。芳基氧化物取代的二氧環(huán)乙烷的半衰期在25℃時(shí)是5秒鐘。在DMSO中，其化學(xué)發(fā)光光譜在470nm處呈現(xiàn)最大吸收，該最大吸收值相同于在這些條件下，酯(3-羥基本甲酸甲酯)裂解產(chǎn)物陰離子熒光及廢棄二氧環(huán)乙烷溶劑熒光的最大吸收值。顯然沒有來自金剛烷酮熒光的化學(xué)發(fā)光作用。相對(duì)于魯米諾標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的該氟觸發(fā)分解的化學(xué)發(fā)光量子定額為0.25(或化學(xué)發(fā)光效率為25%)。在這些條件下，(φF＝0.44)，校正酯的熒光量子定額，得到形成單線激發(fā)態(tài)酯的效率為57%，這是迄今報(bào)導(dǎo)的在實(shí)驗(yàn)室制得的二氧環(huán)乙烷的最高單線態(tài)化學(xué)激發(fā)效率。
酶促觸發(fā)1，2-二氧環(huán)乙烷。
生物測(cè)定(例如，涉及酶的免疫測(cè)定及核酸探針)廣泛地利用各種底物，這些底物通過與酶反應(yīng)，要么生色，要么產(chǎn)生熒光。序列號(hào)為887，139的申請(qǐng)書介紹了第一個(gè)可以起到化學(xué)發(fā)光酶底物作用的二氧環(huán)乙烷(A.P.Schaap，1986年7月17日提交;A.P.Schaap，R.S.Handley，andB.P.Giri，TetrahedronLett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.Desilva，andB.P.Giri，TetrahedronLett.，1155(1987);TetrahedronLett.，1159(1987))。在生物系統(tǒng)中采用這些過氧化物要求二氧環(huán)乙烷在酶促反應(yīng)溫度下表現(xiàn)為熱穩(wěn)定，并且在含水緩沖液中不會(huì)很快出現(xiàn)自發(fā)分解反應(yīng)。在前一短落中介紹的螺旋稠合金剛烷基二氧環(huán)乙烷滿足了這些要球。已制備了帶有官能團(tuán)的1，2-二氧環(huán)乙烷，該化合物經(jīng)酶促修飾可形成芳基氧化物。這一不穩(wěn)定中間體分解可產(chǎn)生熒光。已合成的1，2-二氧環(huán)乙烷可被各種酶觸發(fā)，其中包括芳基酯酶，乙酰膽堿酯酶，堿性磷酸酶。鑒于磷酸酶十分廣泛地用于酶聯(lián)免疫測(cè)定和核酸探針，因此該酶具有十分重要的意義。
例如，采用由3-羥基-9H-呫噸-9-酮和2-金剛烷酮制得的磷酸取代1，2-二氧環(huán)乙烷，可以觀察到堿性磷酸酶引起的酶促觸發(fā)作用。該二氧環(huán)乙烷是熱穩(wěn)定的，活化能為30.7Kcal/mol，25℃時(shí)半衰期為12年。該二氧環(huán)乙烷不僅在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，而在水性緩沖液中也僅呈現(xiàn)很慢的自發(fā)分解作用。
采用取自牛腸粘膜的堿性磷酸酶[每毫升3.2M硫酸銨溶液含5.3mg蛋白(1100單位/mg蛋白)的混懸液]和在0.75M2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液中的磷酸酯保護(hù)的二氧環(huán)乙烷，PH10.3進(jìn)行觸發(fā)實(shí)驗(yàn)。將50ul等份(0.013umol)的磷酸酯-二氧環(huán)乙烷原液加到3ml 37℃的緩沖液中，由此得到最終濃度為4.2×10-6M的二氧環(huán)乙烷溶液。將1ul(最終蛋白濃度＝1.8ug/ml)堿性磷酸酶注入上述溶液，即可導(dǎo)致突然發(fā)光，該發(fā)光作用經(jīng)歷3分鐘后衰退。在這一期間，來自緩沖液中二氧環(huán)乙烷緩慢的無酶促水解的對(duì)照熒光僅為酶促方法所產(chǎn)生熒光的0.2%?？傮w光發(fā)射與二氧環(huán)乙烷濃度呈線性關(guān)系。發(fā)射衰退率是酶濃度的函數(shù)，而由于酶的反轉(zhuǎn)，總體光發(fā)射與酶濃度無關(guān)。在緩沖液中，于室溫下，得到了磷酸酶催化分解的化學(xué)發(fā)光光譜。將這一化學(xué)發(fā)光光譜與在緩沖液中廢棄反應(yīng)混合物的熒光光譜及羥基呫噸酮裂解產(chǎn)物的熒光光譜作一比較表明由于酶促二氧環(huán)乙烷中磷酸酯基裂解，進(jìn)而產(chǎn)生不穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷芳基氧化物，后者產(chǎn)生羥基呫噸酮的單線激發(fā)態(tài)陰離子，由此引起光發(fā)射。
1，2-二氧環(huán)乙烷化合物和熒光表面活性劑的合成
(a)X＝H(b)X＝Ac(c)X＝PO3Na2儀器除另有說明外，核磁共振(NMR)光譜由Nicolt NT300TM型或General Electric QE300TM型光譜儀測(cè)得，以CDCl3作溶劑，用四甲基硅甲烷作內(nèi)標(biāo)物。紅外線(IR)光譜由NicoletTM或Beckman Acculab8TM光譜儀測(cè)得。質(zhì)譜由KratosTM或AEI MS-90TM儀測(cè)得。由Varian Cary 219TM分光光度計(jì)測(cè)得紫外光譜和可見光吸收光譜。由Spex FluorologTM熒光分光光度計(jì)記錄熒光光譜。采用Spex熒光計(jì)測(cè)得化學(xué)發(fā)光光譜。由本實(shí)驗(yàn)室制做的照度計(jì)測(cè)得化學(xué)發(fā)光作用的動(dòng)力學(xué)及量子產(chǎn)額數(shù)據(jù)。將采用RCA A-31034A砷化象光電倍增管(冷至-78℃)的儀器和Ortec光子計(jì)數(shù)電子儀聯(lián)接于Apple Ⅱ.TM和MacintoshTM計(jì)算機(jī)。使用Midwest Microlabs，Indianapolis進(jìn)行元素分析。用Thomas HooverTM毛細(xì)管熔點(diǎn)測(cè)定儀(未經(jīng)校正)測(cè)定熔點(diǎn)。用Cahn 4700/TM型電子天枰精確稱重。
材料.
所用的鄰二甲苯來自BurdickandJackson實(shí)驗(yàn)室，并符合動(dòng)力學(xué)測(cè)定及光譜測(cè)定的使用要求。經(jīng)過用氫化鈣進(jìn)行真空蒸溜，得到無水DMF和DMSO。由Aldrich化學(xué)公司購得重水，1，4-二噁烷-d8，氯仿-d，熒光素胺(異構(gòu)體1)和其他化學(xué)試劑。由Sigma化學(xué)公司購得堿性磷酸酶樣品。從各種市場(chǎng)渠道購得氧化硅，氧化鋁和其他固體載體，并且不用進(jìn)一步純化直接使用。
鏈烯類的合成。金剛烷(1a)給500ml的燒瓶裝上回流冷凝器，125ml的加料漏斗和通氮管。采用熱空氣槍和吹氮法使該裝置干燥。加入40ml無水THF，并在冰浴中冷卻該燒瓶。迅速地加入TiCl3(1.5g，10mmol)，然后在攪拌下分次加入LAH(0.19g，5mmol)。除去冷卻浴，使該黑色混合物溫?zé)嶂潦覝?。將三乙?0.7ml，5mmol)加到該攪拌混懸液中，并回流15分鐘，此后，在15分鐘內(nèi)向該回流混合物滴加3-羥基苯甲酸甲酯(152mg，1mmol)和2-金剛烷酮(300mg，2mmol)的20ml無水THF溶液。在反應(yīng)混合物冷卻至室溫后再繼續(xù)回流15分鐘，并用100ml蒸溜水稀釋。用3×50ml份的乙酸乙酯提取上述水溶液。合并有機(jī)層，用水洗滌，用MgSO4干燥，濃縮，經(jīng)硅膠層析，用15%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到240mg(87%)1a，為白色固體，m.p.133-4℃。1H NMR(CDCL3)δ 1.64-1.96(M，12H)，2.65(S，1H)，3.24(S，1H)，3.32(S，3H)，5.25(S，1H，OH用D2O交換)，6.70-7.30(M，4H)，13C NMR(CDCL3)δ 28.45，30.36，32.36，37.30，39.18，39.33，57.82，114.60，116.16，122.19，129.24，137.24，155.62;MSm/e(relintensity)271(20，M+1)，270(100，M)，253(7.3)，213(35.1)，121(41.7)，93(9.4);精確分子量計(jì)算值270.1619，測(cè)定值270.1616。 金鋼烷(1b)在通氮下，將羥基鏈烯la(0.75g，2.8mmol)溶于10ml CH2Cl2和吡啶(5.2g，65.8mmol)。將該溶液在水中冷卻，然后用注射器滴加乙酰氯(2.6g，33mmol)的1ml CH2Cl2溶液。經(jīng)硅膠TLC(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)表明la完全被乙?；?。除去溶劑后，用30ml醚洗滌固體殘留物。用水(3X25ml)洗滌醚液，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物經(jīng)硅膠層析，用20%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到0.45g油狀的1b 1H NMR(CDCl3)δ 1.79-1.96(m，12H)，2.27(s，3H)，2.66(s，1H)，3.26(s，1H)，3.29(s，3H)，6.99-7.36(m，4H);13C NMR(CDCl3)δ 20.90，28.13，30.07，31.99，36.99，38.99，39.01，57.59，120.34，122.14，126.55，128.66，132.19，136.90，142.59，150.42，169.04;MS m/e(rel intensity)312(100，M)，270(25)，255(19.3)，213(20.7)，163(12.2)，121(30.7)，43(30)，IR(neat)3006，2925，2856，1725，1600，1438，1362，1218，1100cm-1;元素分析按C29H24O3計(jì)算值C，76.92;H，7.69，測(cè)定值C，76.96;H，7.85。 金剛烷二鈉鹽(1C)。
將羥基烯1a(500mg，1.58mmol)溶解在5ml無水吡啶(用堿性氧化鋁干燥)中。將該溶液慢慢加到由三氯氧磷(1ml，10.7mmol)和5ml吡啶組成的冷卻混合物，其加料速度應(yīng)將反應(yīng)溫度維持在5℃下。三十分鐘后，終止反應(yīng)，并將二氯磷酰化產(chǎn)物倒在由20g冰和1ml 10N氫氧化鈉組成的混合物上，將該混合物移至分液漏斗中，用5X30ml CH2Cl2進(jìn)行洗滌。在冰箱內(nèi)過夜冷卻后，從水溶液中沉淀出產(chǎn)物。先用3X10ml冷水洗滌固體產(chǎn)物，然后將該白色固體在減壓下干燥，得到400mg(1.02mmol 64%)磷?；?s1H NMR(D2O/P-二噁烷-d8)δ1.67-1.83(m，12H)，2.50(s，1H)，3.04(s，1H)，3.19(s，3H)，6.7-7.2(m，4H);13C NMR(D2)δ 28.29，30.44，32.45，36.99，38.89，57.98，120.16，120.85，123.74，128.89，133.15，136.11，142.68，154.45;31p NMR(D2O/P-二噁烷-d8)δ 1.586。
熒光素表面活性劑的合成5-(N-十四烷?；被?熒光素(3)于室溫，攪拌下，將肉豆蔻酰氯(2.18g，8.83mmol)的THF溶液滴加到熒光素胺-異構(gòu)體1(Aldrich化學(xué)公司出口)(3.07g，8.85mmol)的無水吡啶(經(jīng)堿性氧化鋁干燥)溶液中，滴加時(shí)間是12小時(shí)。硅膠薄板層析(20%MeOH/苯作展開劑)表明轉(zhuǎn)化為極性較低的產(chǎn)物。將該反應(yīng)物倒入冰水中，過濾分離固體沉淀，得到4g橙色固體，經(jīng)柱層析(用10%MeOH/苯洗脫)得到500mg純凈的產(chǎn)物，為橙色固體;mp.185-190℃，1H NMR(CDCl3)δ 0.88(t，3H)，1.27(m，20H)，1.74(m，2H)，2.42(t，2H)，6.54-8.32(m，9H);13C NMR(CDCl3)δ 13.05，22.27，25.34，28.90，29.01，29.17，29.31，31.61，36.65，101.00，110.25，112.43，114.93，124.41，126.58，127.86，128.77，140.41，147.00，152.89，160.28，169.96，173.65;MS(FAB)m/e(rel intensity)558(10，M+1)，402(14.7)，388(14.2)，374(12.5)，348(28.1)，302(35，2)，213(36.4)，165(36.4)，133(50)。
3的性質(zhì)與MelecularProbes，Inc.出品的市售產(chǎn)品所介紹的性質(zhì)相符。
1-十六烷?；?6-羥基-2-苯并噻唑酰氨(4)的合成。
將6-羥基-2-苯并噻唑羧酸甲酯(60mg，0.30mmol)[見F.McCapraandZ.Razani，Chem.Commun.，153(1976)]和1-十六烷胺(430mg，1.8mmol)溶于甲醇中。將該溶液回流兩天后，薄層層析(用40%乙酸乙酯/己烷作展開劑)顯示苯并噻唑羧酸酯轉(zhuǎn)化為較小極性的物質(zhì)。蒸除甲醇，殘留物經(jīng)層析(2%乙酸乙酯/己烷洗脫)純化，以除去過量的1-十六烷胺。然后再進(jìn)行層析，用50%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到白色固體狀的433mg(27%);mp.82-4℃;
1H NMR(丙酮-d6)δ 0.83(t，3H)，1.32(br.26H)，1.66(m，2H)，3.43(t，2H)，7.10-7.88(m，3H)，8.15(br，1H，OH用D2O交換;13C NMR(苯-d6)δ 14.29，23.05，27.08，29.58，29.66，29.75，29.86，30.13，32.28，39.98，(丙酮-d6)δ 107.51，117.69，125.61，139.33，147.80，157.63，160.48，162.12，MS(m/e(rel.intensity)418(M+，33.7)，360(14.1)，240(61.1)，178(77.3)，151(39.1)，97(28.6)，83(34.7);Exact masscalcd.418.2653，found 418.2659 for C24H38N2O2S。
1，2-二氧環(huán)乙烷的制備，光氧化方法.
一般將5-10mg鏈烯樣品溶解在置于光氧化管中的5ml二氯甲烷中。加入約40mg聚苯乙烯鍵合的RoseBengal(sensitoxI)[此類敏化劑參見A.P.Schaap，A.L.Thayer，E.C.BlosseyandD.C.Neckers，J.Amer.Chem.Soc.，97，3741(1975)]，并與氧氣噴嘴連接。緩慢地向該溶液中通入5分鐘氧氣，并將該裝置浸漬在含干冰/2-丙醇的半鍍銀Dewar燒瓶中。在連續(xù)通入氧氣泡的同時(shí)，用250瓦或1000瓦鈉燈(GeneralElectricLucalox)及紫外濾光片照射該樣品。用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。一般可檢測(cè)到高度穩(wěn)定二氧環(huán)乙烷的點(diǎn)，其Rf值低于鏈烯。在室溫下過濾金鋼烷取代的二氧環(huán)乙烷，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)，并用適宜的溶劑重結(jié)晶。
4-(3-羥基苯基)-4-甲氧基螺[1，2-二氧環(huán)乙烷-3，2′-金鋼烷](2a)在Sensitox I存在下，于-78℃，在8ml二氧甲烷中，用1000瓦的鈉燈照射羥基鏈烯1a(100mg)。鏈烯和二氧環(huán)乙烷在TLC(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)中呈現(xiàn)相同的Rf值。因此，在出現(xiàn)痕量的裂解產(chǎn)物時(shí)即停止反應(yīng)。過濾除去光敏劑，并將溶劑蒸發(fā)。采用1H NMR控測(cè)已被氧化的所有起始原料。用戊烷/苯將二氧環(huán)乙烷2a重結(jié)晶，得到一白色固體MP 135C1H NMR(CDCl3)δ 1.04-2.10(m，12H)，2.21(s，1H)，3.04(s，1H)，3.24(s，3H);6.48(s，1H，OH用D2O交換)，6.93-7.30(m，4H).13C NMR(CDCl3)δ 25.81，25.95，31.47，31.57，32.27，32.86，33.07，34.58，36.30，29.83，95.88，112.08，116.46，129.34，136.11，156.21.
4-(3-乙酰氧基苯基)-4-甲氧基螺[1，2-二氧環(huán)乙烷-3，2′-金鋼烷](2b)采用1000瓦的高壓鈉燈和400mg Sensitox I，在30ml CH2Cl2中，于-78C，使鏈烯1b(140mg，0.45mmol)光氧化。在硅膠上進(jìn)行TLC分析(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)表明在2.5小時(shí)內(nèi)，轉(zhuǎn)化為極性更強(qiáng)的物質(zhì)。過濾，并除去溶劑，得到油狀的2b1H NMR(CDCl3)δ 0.90-1.90(m，12H)，2.15(s，1H)，2.31(s，3H)，3.30(s，1H);3.32(s，3H)，6.61-7.45(m，4H)，13C NMR(CDCl2)δ 21.00，25.82，25.97，31.50，31.65，32.21，32.80，33.09，34.71，36.32，49.92，95.34，111.50，122.58，129.16，136.42，150.72，169.11。
4-甲氧基-4-(3-磷酸酰苯基)螺[1，2-二氧環(huán)乙烷-3，2′-金鋼烷]，二鈉鹽(2c)采用1000瓦的高壓鈉燈和Sensitox I，在2ml D2O/P-二噁烷-d8(1∶1 V/V)中，于10C，將鏈烯1c(50mg)光氧化。1H′NMR分析表明在45分鐘內(nèi)明顯地轉(zhuǎn)化為二氧環(huán)乙烷2c。濾除光敏劑，將濾液作為原液用于化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)。1H NMR(D2O/P-二噁烷-d8δ 0.91-1.70(m，12H)，2.08(s，1H)，2.80(s，1H)，3.07(s，3H)，7.00-7.26(m，4H);13C NMR(D2O/P-二惡烷-d8)δ 28.95，30.95，32.98，37.65，39.53，58.31，120.62，121.64，123.55，129.31，132.45，136.57，143.98，155.30.
化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)方法。
由通氣溶液的化學(xué)發(fā)光作用的衰變來監(jiān)測(cè)穩(wěn)定二氧環(huán)乙烷的熱分解速率。給裝有磁力攪拌棒的Pyrex小瓶裝入3-4ml反應(yīng)溶劑，用Teflon-線螺旋帽將該瓶封住，并將它置于測(cè)量化學(xué)發(fā)光照度計(jì)的恒溫樣品槽中。通過外循環(huán)水浴控制溫度，選擇合適凳訂器放大值及光狹縫。在達(dá)到熱平衡(約，3分鐘)時(shí)，加入等份的二氧環(huán)乙烷原液，其加入量應(yīng)足以達(dá)到最終濃度(不超過10-4M)，加入方法是通過打開照度計(jì)頂部用移液管加入，或者用注射器通過直接蓋在上述小瓶上的避光用橡膠隔膜加入。用Teflon線螺旋帽將小瓶封死，以避免在采用高溫時(shí)出現(xiàn)蒸發(fā)。打開開關(guān)開始測(cè)量信號(hào)，一般至少要記錄化學(xué)發(fā)光衰變的3個(gè)半衰期。通過采用處理標(biāo)準(zhǔn)方差的計(jì)算機(jī)程序，由In(強(qiáng)度)對(duì)時(shí)間計(jì)算一級(jí)速率常數(shù)(K)。相關(guān)系數(shù)(r)一般至少為0.999，在各重復(fù)樣品之間K的變化應(yīng)小于5%。
由InK對(duì)1/T(Arrhenius方程)或Ink/t對(duì)1/T(Eyring方程)作圖，通過標(biāo)準(zhǔn)方差線性回歸分析計(jì)算二氧環(huán)乙烷分解作用的活化參數(shù)。測(cè)定在80-120℃之間的5至10個(gè)溫度下的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明是一條直線，其相關(guān)系數(shù)為0.99或更好。例如，圖1表示磷酸酰取代二氧環(huán)乙烷2c在鄰二甲苯中熱分解的Arrhenius圖，Ea＝32.5kcol/mol，r＝0.999，由Arrhenius方程計(jì)算得到2c在25℃的半衰期為19年。二氧環(huán)乙烷在二甲苯中熱分解作用的活化能。
二氧環(huán)乙烷(X) Ea Log A K(sec-1)at 25℃ t1/2at 25℃2a(OH) 28.3 12.5 5.38X10-94.1 yrs2b(OAC) 30.4 13.6 1.73X10-913 yrs2c(PO3Na2) 32.5 14.9 1.19X10-919 yrs上述結(jié)果表明在用適宜的化學(xué)試劑或酶觸發(fā)之前，這些類型的二氧環(huán)乙烷呈現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性(很長的半衰期)。
化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額的測(cè)定二氧環(huán)乙烷分解作用的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額(φCL)的定義是，所發(fā)射的化學(xué)發(fā)光衰變與二氧環(huán)乙烷分解摩爾數(shù)之比。在反應(yīng)期間，由反應(yīng)焓(△HR)加上Arrhenius活化能(Ea)所釋放出的能量，足以使羰基裂解產(chǎn)物之一呈單線激發(fā)態(tài)。因此，量子產(chǎn)額最大值是1.0。另一有意義的參數(shù)是化學(xué)激發(fā)量子產(chǎn)額(φCE)，其定義為所形成的激發(fā)態(tài)與所分解的二氧環(huán)乙烷之比。根據(jù)方程φCL＝φCEXφF，通過二氧環(huán)乙烷裂解的發(fā)光量子產(chǎn)額(φF)，使化學(xué)激發(fā)量子產(chǎn)額與化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額相聯(lián)系。
為測(cè)定化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額，通過下列修正采用與測(cè)定衰變動(dòng)力學(xué)相同的方法。將精確等份的已知濃度二氧環(huán)乙烷原液加到3ml預(yù)先恒溫的有機(jī)溶劑或水性緩沖液中。然后加入適宜的化學(xué)試劑或酶觸反應(yīng)物。采用冷卻至-78℃的RCAA-31034A砷化鎵PMT的光子計(jì)數(shù)照度計(jì)收集總光強(qiáng)度。根據(jù)魯米諾與堿在通氣DMSO中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的已知精確量子產(chǎn)額，參照其標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為光子數(shù)。經(jīng)測(cè)定魯米諾反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額為0.011(1.1%)(J.LeeandH.H.Seliger，photochem.photobiol.，15，227(1972);P.R.MichaclandL.R.Faulkner，Anal.Chem.，48.1188(1976))。
探測(cè)化學(xué)發(fā)光光譜。
采用Spex Fluorolog熒光光度計(jì)，在室溫下，使反應(yīng)在樣品槽的1-cm2石英透明小容器中進(jìn)行，由此測(cè)得由化學(xué)或酶觸發(fā)的二氧環(huán)乙烷的化學(xué)發(fā)光光譜。在波長掃描期間校正化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的衰變，其方法是以比例的模式累積光譜，使來自輔助檢測(cè)器(EMI9781B)的信號(hào)將所觀察到的光譜分開，該輔助檢測(cè)器以時(shí)間為函數(shù)測(cè)量總信號(hào)。該單色器譜帶通道一般為18nm。就弱發(fā)射樣品而言，要進(jìn)行幾次相同掃描，并疊加借以改善信噪比。
二氧環(huán)乙烷的化學(xué)觸發(fā)。
1.用堿觸發(fā)羥基取代二氧環(huán)乙烷2a的化學(xué)發(fā)光。
在室溫下，用過量的四正丁基銨氫氧化物處理溶于DMSO中的10-4的二氧環(huán)乙烷2a溶液，由此導(dǎo)致深蘭色的化學(xué)發(fā)光，該發(fā)光作用經(jīng)數(shù)分鐘衰變。該化學(xué)發(fā)光的發(fā)射最大值是470nm。裂解產(chǎn)物(3-羥基苯甲酸甲酯，MHB)陽離子的熒光相同于上述化學(xué)發(fā)光光譜。這些結(jié)果表明所述化學(xué)發(fā)光過程包括(a)堿觸發(fā)得到不穩(wěn)定芳基氧化物形式的二氧環(huán)乙烷，(b)然后該物質(zhì)裂解產(chǎn)生單線激發(fā)態(tài)MHB，(c)MHB發(fā)光，得到總量子產(chǎn)額(＊Cl)為0.25的熒光。
2.在水性膠束中催化乙酰氧基-取代二氧環(huán)乙烷2a的堿觸發(fā)化學(xué)發(fā)光通過分子間能量轉(zhuǎn)移提高化學(xué)發(fā)光效率。
可將陽離子表面活性劑，[如十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)]用于提高適宜的取代二氧環(huán)乙烷在水溶液中化學(xué)發(fā)光的化學(xué)觸發(fā)速率。例如，CTAB催化乙酰氧取代二氧環(huán)乙烷2b的堿誘發(fā)熒光裂解。二氧環(huán)乙烷在表面活性劑形成的膠束中是可溶的，加入氫氧化鈉即可引起化學(xué)發(fā)光。陽離子部份與氫氧根陰離子的靜電吸引作用產(chǎn)生明顯的膠束催化作用。一般實(shí)驗(yàn)所采用的濃度為[2b]＝9.1X10-5M，[CTAB]＝2X10-3M，和[OH]＝9.1×10-5M，溫度為37℃。
膠束環(huán)境可以導(dǎo)致更高的化學(xué)發(fā)光效率。
盡管2a和2b與堿在DMSO中作用，光產(chǎn)量相當(dāng)高，可達(dá)0.25，但這些二氧環(huán)乙烷在水中的光產(chǎn)量僅為8.9×10-6。造成其大幅度降低的根本原因是該裂解產(chǎn)物(MHB)在水只有很弱的發(fā)光作用。但是，正如下述實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，通過在膠束中觸發(fā)二氧環(huán)乙烷，可以提高其熒光產(chǎn)量。除CTAB的濃度在0至5×10-3M范圍內(nèi)變化外，堿觸發(fā)2b的條件與前述條件相同。圖2說明，當(dāng)高于CTAB的臨界膠束濃度(cmc≌1×10-3M)時(shí)，化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額(φCL＝1.7×10-4)提高19倍。在膠束環(huán)境中增加化學(xué)發(fā)光效率的原因在于φF和/或φCE增加。
在共表面活性劑膠束中摻入熒光首基，無論是對(duì)化學(xué)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷還是對(duì)酶促觸發(fā)二氧環(huán)乙烷，均可大幅度提高化學(xué)發(fā)光產(chǎn)量。由于(如圖2a所示)在膠束中將可觸發(fā)二氧環(huán)乙烷和能量受體(熒光劑)緊密地束縛在一起，從激發(fā)態(tài)裂解產(chǎn)物到熒光表面活性劑之間的能量轉(zhuǎn)移是十分有效的。
例如，在水溶液中按下列最終濃度制得了含熒光素表面活性劑3和二氧環(huán)乙烷2b的CTAB膠束體CTAB(1.5×10-3M)，3(9×10-5M)和2b(9×10-5M)。在37℃加入堿即可產(chǎn)生很強(qiáng)的黃色光(化學(xué)發(fā)光)而不是發(fā)射一般的蘭光，其化學(xué)發(fā)光效率是1.4%(φCL＝0.014)，比2b在不加CTAB和3時(shí)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)500倍。
用苯并噻唑酰胺表面活性劑4進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)?；瘜W(xué)發(fā)光效率是0.3%，λmax是506nm。
酶促觸發(fā)生磷酸酰取代二氧環(huán)乙烷2c。
1.用人體血清堿性磷酸酶觸發(fā)2c的化學(xué)發(fā)光。
通過將1c在二噁烷/水(V/V1∶1)中進(jìn)行光氧化制得二氧環(huán)乙烷2c的原液。從健康供體中采集新鮮血樣，離心除去紅血細(xì)胞，得到實(shí)驗(yàn)用血清。將3ml濃度為10-5M的2c溶液[溶劑是0.75M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇(221)緩沖液(PH10.3)]在37℃用100μl血清處理，得到了圖3所示典型的強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的關(guān)系圖，圖3中在時(shí)間為零時(shí)注入血清。在這些條件下，光強(qiáng)度達(dá)到接近2.3×104計(jì)數(shù)/秒的恒定水平。2c在無酶促水解時(shí)所產(chǎn)生的對(duì)照熒光信號(hào)還不到酶促值的0.05%。采用100至1μl血清進(jìn)行凳;系列實(shí)驗(yàn)表明(圖4)停滯期的光強(qiáng)度與酶濃度直接成正比。也可以方便地采用在任何其它時(shí)間位點(diǎn)的光強(qiáng)度直接測(cè)量酶濃度(圖5)。
2.用來自牛小腸粘液的堿性磷酸酶觸發(fā)2c化學(xué)發(fā)光。
牛小腸檢液堿性磷酸酶由Sigma Chemical Co.得到，為每毫升3.2M(NH4)2SO4溶液含5.1mg蛋白質(zhì)的混懸液。在普通實(shí)驗(yàn)中，將50μl濃度為2.56×10-3M二氧環(huán)乙烷2c原液的221緩沖液加到含8.0×10-4Mg(OAc)2的221緩沖液(0.75M，PH9.1)中，使二氧環(huán)乙烷的最終濃度達(dá)4.3×10-5M。在37℃將10μl稀釋酶注入該溶液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，其量子產(chǎn)額為3.1×10-5。為了便于與化學(xué)觸發(fā)相比較，加入CTAB(1.13×10-3M)，使φ1中度增加至2.1×10-4。加入表面活性劑后酶促觸發(fā)動(dòng)力無明顯改變。
3.用堿性磷酸酶觸發(fā)2c的化學(xué)發(fā)光在水性膠束中通過分子間能量轉(zhuǎn)移提高化學(xué)發(fā)光效率。
在膠束中摻入熒光素表面活性劑3可以戲劇性地提高酶觸發(fā)光的效率。在37℃用3ml含有下列物質(zhì)的溶液進(jìn)行堿性磷酸酶與二氧環(huán)乙烷2c反應(yīng)的試驗(yàn)2c(4.3×10-5M)，221緩沖液(0.75M，PH0.91)，Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，熒光素表面活性劑3(5.6×10-5M)。加入堿性磷酸酶(Sigma，牛小腸粘液)使蛋白最終濃度達(dá)12Pg/ml，由此產(chǎn)生長達(dá)45分鐘的化學(xué)發(fā)光。將整個(gè)發(fā)光過程的光強(qiáng)度積分，得到φCl＝0.015(1.5%化學(xué)發(fā)光效率，與不加CTAB和3的酶促反應(yīng)相比，增加了500倍)。另外與化學(xué)觸發(fā)2b相比，該化學(xué)發(fā)光光譜從正常發(fā)射蘭光(圖6，曲線A)位移至典型的熒光素發(fā)射光譜(圖6，曲線B)，由此證明涉及能量轉(zhuǎn)移過程。
為了檢驗(yàn)該化學(xué)發(fā)光方法對(duì)評(píng)價(jià)溶液中堿性磷酸酶濃度的敏感性，采用將購自Sigma的樣品稀釋制得的酶原液進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。根據(jù)對(duì)樣品中酶濃度的保守估計(jì)，假設(shè)每ml樣品中的5.1mg蛋白是100%純的堿性磷酸酯酶。另外將酶的分子量按140.000計(jì)算。反應(yīng)條件如上所述，采用2c，CTAB，熒光劑3，所不同的是在3ml溶液中最終酶的量分別是A＝3.6×10-12摩爾B＝3.3×10-13摩爾C＝3.0×10-14摩爾D＝2.7×10-15摩爾E＝2.5×10-16摩爾F＝2.3×10-17摩爾在上述條件下，2c在緩沖液/共膠束環(huán)境無酶促水解而產(chǎn)生的對(duì)照化學(xué)發(fā)光相當(dāng)慢，由此而產(chǎn)生的恒定信號(hào)僅為幾個(gè)計(jì)數(shù)/秒(圖7)。圖7示出了用3ml中磷酸酶濃度為2.7×10-15M的酶進(jìn)行酶促觸發(fā)時(shí)一般的強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的關(guān)系圖(實(shí)驗(yàn)D)。在30-60分鐘內(nèi)，隨著濃度增加光強(qiáng)度增加。此后光強(qiáng)度保持恒定，直到消耗完二氧環(huán)乙烷為止。如果在用照度計(jì)分析儀前，將含有二氧環(huán)乙烷和酶的樣品在37℃-45℃保溫?cái)?shù)分鐘，可以省去預(yù)穩(wěn)定時(shí)間。
無論是總體光強(qiáng)度還是在某一特定時(shí)間的強(qiáng)度與酶量的關(guān)系圖均有很好的相關(guān)性。例如，圖8示出了log(從零時(shí)至3分鐘總分體酶促熒光)與log(堿性磷酸酶摩爾數(shù))的關(guān)系圖。每一過程的重復(fù)性好于4%，如圖8所示。相關(guān)系數(shù)＞0.99。
如上所述的酶促發(fā)實(shí)驗(yàn)也可在購自Dynatech，Inc，由透明聚苯乙烯制得的ImmumlonTM微滴井中進(jìn)行。單獨(dú)使用該井，并將其置于可恒溫加熱的避光容器中。采用光導(dǎo)纖維技術(shù)使井底與如前所述的光子計(jì)數(shù)照度計(jì)相連，由此檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。這一實(shí)驗(yàn)裝置可采用十分小的反應(yīng)體積。例如，所進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)中，在200μL221緩沖液中，二氧環(huán)乙烷2c，CTAB和3與堿性磷酸酶反應(yīng)的量僅為5X10-15至2X10-18摩爾(或2阿摩爾)。圖9示出了用2.3X10-17摩爾酶進(jìn)實(shí)驗(yàn)的光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的關(guān)系圖。對(duì)酶樣品純度更實(shí)際的估計(jì)應(yīng)為10%。在這些條件下，從圖10中可以看出采用二氧環(huán)乙烷2c的這一化學(xué)發(fā)光技術(shù)能夠檢測(cè)到濃度低于0.2阿摩爾的堿性磷酸酶。
采用X-線膠片及瞬時(shí)膠片(instant film)攝影也可以檢測(cè)由酶促觸發(fā)2c產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。例如，圖11和12示出了在ASA300 PolaroidTMType 57膠片上記錄的化學(xué)發(fā)光。將含有二氧環(huán)乙烷2c(4.3×10-5M)，Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，熒光素表面活性劑3(5.6×10-5M)的221緩沖液(100μl，0.75M，PH9.1)，采用前述相同的酶原液，在不同量堿性磷酸酶存在下，于DynatechImmalon井中保溫。在37℃將該井保溫一小時(shí)，然后將該井直接置于避光保溫器中的膠片上，在同一溫度攝影15分鐘。記錄在膠片上的光強(qiáng)度顯然可用于測(cè)量酶濃度。
4.化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)測(cè)定酶促觸發(fā)適宜取代的二氧環(huán)乙烷為酶聯(lián)生物測(cè)定提供了超敏感的檢測(cè)方法。例如，用堿性磷酸酶作為測(cè)定標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫測(cè)定及DNA探針可以采用磷酸酰取代二氧環(huán)乙烷2c。前述檢測(cè)方法是利用與該酶反應(yīng)產(chǎn)生顏色或發(fā)熒光的底物。對(duì)于視網(wǎng)膜蛋白，半抗原的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)說明了采用二氧環(huán)乙烷2c的化學(xué)發(fā)光技術(shù)的敏感性。采用L.A.Donoso的方法(L.A.Donoso，C.F.Merryman，K.E.Egelberg，R.Naids，and C.Kalsow，Investigation Ophthalmology & Visual Science，26，561(1985))，用不同量半抗原(112，56，28，14，7，3，1.3ng)涂敷7支一組的ImmulonTM井，并使之與鼠體生長的單克隆抗體(MA6A9-C6)反應(yīng)，最后與抗-鼠IgG偶合的堿性磷酸酶反應(yīng)。然后在每支井中加入100μl含有Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，熒光素表面活性劑3(5.6×10-5M)的221緩沖液(0.75M，PH9.1)，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定。將該井置于微量照度計(jì)中，并在3分鐘內(nèi)平衡至37℃，注入10μl于221緩沖液的二氧環(huán)乙烷2c原液，使2c的最終濃度達(dá)1.36×10-4M。圖13示出了典型的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖。試劑的對(duì)照熒光很低并且恒定在15-20計(jì)數(shù)/秒(圖13)。如圖14所示，整體光強(qiáng)度與涂敷在井上的抗原量相關(guān)。在用照度計(jì)實(shí)驗(yàn)之后，將含有相同溶液的井進(jìn)行攝影檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(圖15)。將7支井置于一容器中，并在37℃保溫30分鐘，然后在一避光保溫器中，用ASA300 PolaroidTMType 57膠片在相同溫度下攝影15分鐘。如圖15所示，記錄在膠片上的光強(qiáng)度也與涂敷在井上半抗原的量相關(guān)。圖16說明了該攝影測(cè)定的可重復(fù)性。用上述緩沖液和二氧環(huán)乙烷處理50ng抗原涂敷的4支井，在45℃保溫1小時(shí)，然后在同一溫度用膠片攝影30秒。應(yīng)該注意到在兩種攝影測(cè)定中，只含有緩沖液和二氧環(huán)乙烷的對(duì)照井是看不到的，另外還說明由非酶促水解二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的對(duì)照相當(dāng)?shù)汀?br> 5.在發(fā)光膠束存在下，用脲酶對(duì)羥基取代的二氧環(huán)乙烷2a進(jìn)行酶促觸發(fā)采用160mgCTAB和12.4mg熒光素表面活性劑3在200mg蒸餾水中制成一溶液。將200mg脲素溶解在100ml蒸餾水中，并加入EDTA使最終濃度達(dá)0.4mM，由此制得一脲素溶液。將10ml各原液混合得到用于脲酶實(shí)驗(yàn)的底物溶液。
將脲酶(Sigma)在室溫下保溫0.5至2小時(shí)以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后注入10μl3×10-3M二氧環(huán)乙烷2a，用照度計(jì)和瞬時(shí)膠片監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光，根據(jù)該熒光強(qiáng)度即可測(cè)定脲酶的濃度。
在優(yōu)選方法和組合物中，二氧環(huán)乙烷的用量在約10-2至10-6M之間;表面活性劑用量大于約10-4M，共表面活性劑熒光素表面活性劑用量在約10-3至10-6M之間。當(dāng)在溶液中只使用共表面活性劑時(shí)，其本身失活。二氧環(huán)乙烷對(duì)熒光化合物的摩爾比，無論是在溶液中還是在固體組合物中一般是在約1000∶1至1∶1之間。
為獲得最佳酶活性，采用緩沖液調(diào)節(jié)PH值。就磷酸酰(如X-氧基)取代的二氧環(huán)乙烷而言，PH值在9和10之間，這樣磷酸?；姆敲复偎饨抵磷畹?，產(chǎn)生很低的對(duì)照熒光。2-甲基-2-氨基-1-丙醇是優(yōu)選的緩沖劑，其他緩沖劑是三(羥甲基)氨基甲烷和碳酸鹽。也可以采用無機(jī)鹽(如Mg(OAc)2)使酶活化。選擇緩沖系統(tǒng)應(yīng)為酶提供最大催化活性，并為由二氧環(huán)乙烷裂解而產(chǎn)生的X-氧基(如磷酸酰基)提供一受體。
本發(fā)明在特定的分子集合體，例如膠束中恰到好處地?fù)饺敕€(wěn)定的二氧環(huán)乙烷和發(fā)光能量受體，使產(chǎn)生有效的能量轉(zhuǎn)移。這些方法適用于包括反向膠束，脂質(zhì)體，微乳劑，膠片，單層體和聚合物。
最好將二氧環(huán)乙烷和受體置于溶液中或置于像膠片之類的固體上。固＝相有利于使這些分子定位在一起。
應(yīng)當(dāng)指出前述說明書僅用于說明，只有下文的權(quán)利要求書限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生光的方法，該方法的特征在于(a)提供一種淡光化合物和與之緊密間隔相聯(lián)系的下式穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物
式中Arox是由X-氧基團(tuán)取代的芳基，當(dāng)用活化劑觸發(fā)該化合物除去X時(shí)，它形成不穩(wěn)定的氧化物中間體-1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，這樣該不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，釋放出電能，形成光和兩個(gè)下式所示的羰基化合物
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑的作用下可以將它除去，進(jìn)而形成不穩(wěn)定的中間體1，2-二氧環(huán)乙烷；其中A是鈍性有機(jī)基團(tuán)，它允許產(chǎn)生光，(b)用致活劑分解穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷，在分解過程中，熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
2.一種產(chǎn)生光的方法，其特征在于(a)提供一種熒光化合物和與之以緊密間隔相鄰的下式所示穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物
式中R1和R2一起，以及R3和R4一起連接成螺旋稠合亞烷基，后者可以含有除碳原子外的雜原子(N，S，O或P)，和芳環(huán)，在R1和R2或R3和R4中至少有一個(gè)是芳基，該芳基由X-氧基取代，當(dāng)該取代基由選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體等的致活劑觸發(fā)時(shí)，除去X，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體，后者分解，釋放出電能，形成光和兩個(gè)下式所示的含羰基化合物
式中，未經(jīng)X-氧基團(tuán)取代的R1，R2，R3或R4是含碳或雜原子的有機(jī)基團(tuán)，所述有機(jī)基團(tuán)可為穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物提供穩(wěn)定性，式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑作用下至被除去，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體，(b)，在致活劑作用下使穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，其中熒光化合物接受由于不穩(wěn)定氧化物中間體分解的產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
3.一種產(chǎn)生光的方法，其特征在于(a)提供一種與下式穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物緊密相鄰的熒光化合物，所述二氧環(huán)乙烷為
式中R1選自烷基，烷氧基，芳氧基，二烷氨基，三烷基或芳基甲硅烷氧基和包括與R2螺旋稠合芳基在內(nèi)的芳基，其中R2是芳基(可包括R1)，并且該R2還可由X-氧基取代，后者墼致活劑的作用下除去X形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，所述致活劑選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體等，這樣，不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，釋放出電能，形成光和下式所示兩個(gè)含有羰基的化合物
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，經(jīng)致活劑作用除去X，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體;式中R3和R4選自芳基，雜烷基和烷基，R3和R4可以以螺旋稠合多聚烷基和多聚環(huán)芳基的形式連在一起;(b).在致活劑作用下，穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，其中熒光化合物接受由于不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
4.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，由生物源酶作為除去X的致活劑，進(jìn)而使1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解。
5.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為X-氧基的磷酸?；退雒甘菈A性磷酸酶。
6.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為OX基團(tuán)的乙酰氧基，所述酶是乙酰膽堿酯酶。
7.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為OX基團(tuán)的乙酰氧基，所述酶是芳基酯酶。
8.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于該方法可起到免疫測(cè)定或核酸探針的作用。
9.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，R3和R4結(jié)合在一起形成含有6-30個(gè)碳和雜原子(N，O，S或P)的多環(huán)多亞烷基。
10.權(quán)利要求9所述方法，其特征在于R2選自含有X-氧基的萘基和苯基，并且R1是甲氧基。
11.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于X-氧基選羥基，三烷基或芳基甲硅氧基，無機(jī)含氧酸鹽，氧-吡喃糖苷，芳基羧基酯和烷基羧基酯，并且由致活劑除去X。
12.權(quán)利要求11所述方法，其特征在于X-氧基是磷酸?；?，并且在作為致活劑的磷酸酶作用下除去該磷酸?；?br> 13.權(quán)利要求11所述方法，其特征在于X-氧基選自烷基和芳基羧基酯，并且由酯酶除去羧基。
14.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，作為致活劑的生物源酶除去X使所述1，2-二氧環(huán)乙烷分解。
15.權(quán)利要求14所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為X-氧基的磷酸?；⑶宜雒甘菈A性磷酸酶。
16.權(quán)利要求14所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為X-氧基的乙酰氧基，并且所述酶是乙酰膽堿酯酶。
17.權(quán)利要求13所述方法，其特征在于，1，2-二氧環(huán)乙烷含有作為X-氧基的乙酰氧基，并且所述酶是芳基酯酶。
18.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于該方法可起到免疫測(cè)定或核酸探針的作用。
19.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于R1是烷氧基。
20.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于R1是甲氧基，R2是由X-氧基取代的苯基，并且R3和R4連接在一起構(gòu)成金鋼烷基。
21.權(quán)利要求20所述方法，其特征在于X-氧基選自羥基，乙酰氧基，磷酸?；脱?吡喃糖苷。
22.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于熒光化合物與1，2-二氧環(huán)乙烷呈混合物的形式使用。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于陽離子表面活性劑和熒光化合物與1，2-二氧環(huán)乙烷呈混合物的形式使用。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述表面活性劑是十四烷基三甲基銨鹽。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述熒光化合物是一熒光素化合物。
26.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述熒光化合物是5-(N+四碳-壬胺基-熒光素)，它既起到表面活性劑的作用，也與作為表活性劑的十四烷基三甲基銨鹽一道起膠束體的作用。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述熒光化合物是1-十六烷基-6羥基-2苯并三唑酰胺，后者也與作為表面活性劑的乙基三甲基銨鹽一道起著共表面活性劑的作用。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述二氧環(huán)乙烷和所述熒光化合物在膠束體，脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)膠束體，微乳劑，膠片，單層體或多聚體中緊密相鄰。
29.一種通過觸發(fā)產(chǎn)生光的組合物，其特征在于(a)一種熒光化合物，和(b)下式所示的穩(wěn)定1，2-二氧環(huán)乙烷，
式中Arox代表由X-氧基取代的芳基，當(dāng)在致活劑的作用下觸發(fā)除去X時(shí)，它形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，這樣，不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，釋放電能，形成光和下式所示的兩個(gè)含羰基化合物，
式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，它在致活劑的作用下被除去，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷，并且式中A是允許產(chǎn)生光的鈍性有機(jī)基團(tuán)，在該組合物中，在致活劑的作用下，穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，并且熒光化合物接受由于不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
30.一種通過觸發(fā)而產(chǎn)生光的組合物，其特征在于(a)提供一種熒光化合物;和(b)下式所示的穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物
式中R1和R2一起，以及R3和R4一起連接成螺旋稠合亞烷基，后者可以含有除碳原子之外的雜原子(N，S，O或P)和芳香環(huán)，在R1和R2中或R3和R4中至少有一個(gè)是芳基，上述芳基由X-氧基取代，當(dāng)它在選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑及電子授體的致活劑觸發(fā)下除去X時(shí)，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，這樣，不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解，釋放電能，形成光和下式所示兩個(gè)含有羰基的化合物
式中未經(jīng)X-氧基團(tuán)取代的R1，R2，R3，或R4是含碳原子的有機(jī)基團(tuán)，該基團(tuán)為穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物提供穩(wěn)定性，并且式中X是化學(xué)易變基團(tuán)，在致活劑作用下它被除去，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體;其中致活劑使穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，在此過程中，所述熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，進(jìn)而產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷所產(chǎn)生的光。
31.一種產(chǎn)生光的組合物，其特征在于(a)提供一種熒光化合物;和(b)下式所示的穩(wěn)定的二氧環(huán)乙烷化合物
式中R1選自烷基，烷氧基，芳氧基，三烷氨基，三烷基或芳基甲硅氧基，和包括與R2螺旋稠合的芳基在內(nèi)的芳基，其中R2是(可包括R1)的芳基，并且該R2還可以由X-氧基取代，后者在致活劑的作用下除去X，形成不穩(wěn)定的氧化物中間體1，2-二氧環(huán)乙烷化合物，所述致活劑選自酸，堿，鹽，酶，無機(jī)和有機(jī)催化劑，電子授體等，這樣，不穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷化合物分解并釋放出電能，形成下式所示兩個(gè)含羥基的化合物
式中X是化學(xué)易基團(tuán)，經(jīng)致活劑作用除去X形成不穩(wěn)定的氧化物中間體，是中R3和R4可以以螺旋稠合多環(huán)烷基和多環(huán)芳基的形式連在一起，在致活劑作用下，穩(wěn)定的1，2-二氧環(huán)乙烷分解，其中熒光化合物接受由不穩(wěn)定氧化物中間體分解而產(chǎn)生的電能，并產(chǎn)生光強(qiáng)度大于單獨(dú)觸發(fā)二氧環(huán)乙烷而產(chǎn)生的光。
32.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于二氧環(huán)乙烷與熒光化合物的摩爾比在約1000比1和1比1之間。
33.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于所述熒光化合物是熒光素化合物。
34.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于在該組合物中存有陽離子表面活性劑。
35.權(quán)利要求30所述組合物，其特征在于R1是甲氧基，R2是由X-氧基取代的苯基，并且R3和R4連在一起構(gòu)成金剛烷基。
36.權(quán)利要求35所述組合物，其特征在于X-氧基選自羥基，三烷基或芳基甲硅氧基，無機(jī)含氧酸鹽，氧-吡喃糖苷，芳基羧基酯和烷基羧基酯，并且由致活劑除去X。
37.權(quán)利要求36所述組合物，其特征在于所述熒光化合物是熒光素化合物。
38.權(quán)利要求37所述組合物，其特征在于在該組合物中存在有陽離子，其中所述熒光化合物與形成共表面活性劑的烴鏈連接，在該組合物中，二氧環(huán)乙烷的存在量約為10-2至10-6M，表面活性劑應(yīng)大于10-4M，共表面活性劑應(yīng)為10-3至10-6M。
39.權(quán)利要求38所述組合物，其特征在于所述表面活性劑是十四烷基三甲基銨鹽。
40.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于所述二氧環(huán)乙烷和熒光化合物在膠束體，脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)膠束體，微乳化劑，膠片，單層體或聚合物中緊密相鄰。
41.權(quán)利要求30所述組合物，其特征在于所述二氧環(huán)乙烷和熒光化合物在膠束體，脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)膠束體，微乳化劑，膠片，單層體或聚合物中緊密相鄰。
42.權(quán)利要求31所述組合物，其特征在于所述二氧環(huán)乙烷和熒光化合物在膠束體，脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)膠束體，微乳化劑，膠片，單層體或聚合物中緊密相鄰。
43.一種檢測(cè)DNA的方法，該方法包括使被檢測(cè)的DNA與具有標(biāo)記酶的DNA探針雜交，然后由標(biāo)記酶產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，該方法的特征在于(a)提供下式所示的二氧環(huán)乙烷，
式中X是可與標(biāo)記酶反應(yīng)產(chǎn)生光的基團(tuán)，(b)提供一種熒光化合物，該化合物在探針和DNA雜交物之混合物中提高所述二氧環(huán)乙烷的發(fā)光作用，和(c)檢測(cè)由標(biāo)記酶與所述二氧環(huán)乙烷反應(yīng)而產(chǎn)生的雜交物所發(fā)出的光。
44.權(quán)利要求43所述方法，其特征在于，X是與作為標(biāo)記酶的堿性磷酸酶反應(yīng)的磷酸基。
45.權(quán)利要求44所述方法，其特征在于，所述磷酸基是PO3Na2。
46.權(quán)利要求43所述方法，其特征在于，X是與作為標(biāo)記酶的酶反應(yīng)的乙酸基。
47.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于，所述1，2-二氧環(huán)乙烷的分子式為，
式中X是與作為致活劑的酶反應(yīng)的基團(tuán)，由此產(chǎn)生兩個(gè)羰基化合物和光，所述兩個(gè)含羰基化合物是
48.權(quán)利要求47所述組合物，其特征在于OX是磷酸基，而酶是堿性磷酸酶。
49.權(quán)利要求47所述組合物，其特征在于，在所述組合物中混有表面活性劑。
50.權(quán)利要求49所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
51.權(quán)利要求47所述組合物，其特征在于，所述熒光化合物是熒光素化合物。
52.權(quán)利要求51所述組合物，其特征在于，在該組合物中混有表面活性劑。
53.權(quán)利要求52所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
54.權(quán)利要求51所述組合物，其特征在于，所述熒光素化合物是熒光素表面活性劑。
55.權(quán)利要求54所述組合物，其特征在于，所述熒光素表面活性劑選自5-N-十四碳酰氨基熒光素和1-十六碳烷基-6-羥基-2-苯并噻唑酰胺。
56.權(quán)利要求55所述組合物，其特征在于，在該組合物中混有表面活性劑。
57.權(quán)利要求56所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
58.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于，所述熒光化合物是熒光素表面活性劑。
59.權(quán)利要求58所述組合物，其特征在于，所述熒光素表面活性劑選自5-N-十四碳酰氨基熒光素和1-十六碳烷基-6-羥基-2-苯并噻唑酰胺。
60.權(quán)利要求59所述組合物，其特征在于，在該組合物中混有表面活性劑。
61.權(quán)利要求60所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑是十六碳烷基三甲基銨鹽。
62.權(quán)利要求31所述組合物，其特征在于，所述熒光化合物是熒光素表面活性劑。
63.權(quán)利要求62所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑選自5-N-十四碳酰氨基熒光素和1-十六碳烷基-6-羥基-2-苯并噻唑酰胺。
64.權(quán)利要求63所述組合物，其特征在于，在該組合物中混有表面活性劑。
65.權(quán)利要求64所述組合物，其特征在于，所述表面活性劑是十四碳烷基三甲基銨鹽。
66.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于，在該組合物中二氧環(huán)乙烷和熒光化合物彼此緊密相間。
67.權(quán)利要求30所述組合物，其特征在于，在該組合物中，二氧環(huán)乙烷和熒光化合物彼此緊密相間。
68.權(quán)利要求31所述組合物，其特征在于，在該組合物中，二氧環(huán)乙烷和熒光化合物彼此緊密相間。
69.權(quán)利要求29所述組合物，其特征在于，在該組合物中含有表面活性劑。
全文摘要
本文介紹了涉及1，2-二氧環(huán)乙烷和熒光化合物的方法和組合物。實(shí)際上，將可觸發(fā)的1，2-二氧環(huán)乙烷與表面活性劑及連接在烷烴上的熒光化合物預(yù)混合，經(jīng)酶促觸發(fā)，得到一膠束態(tài)共表面活性劑或經(jīng)證實(shí)與這些分子密切相關(guān)的其他分子。該方法和組合物可用于為各種目的采用的免疫測(cè)定和DNA探針。
文檔編號(hào)C07F9/12GK1040980SQ89106249
公開日1990年4月4日 申請(qǐng)日期1989年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1988年7月27日
發(fā)明者阿瑟·保羅·沙普 申請(qǐng)人:韋恩州立大學(xué)校董會(huì)