兔血中白蛋白的純化制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種兔血中白蛋白的純化制備方法，主要包括如下工藝步驟：(1)兔血前處理；(2)濾出液脫鹽；(3)兔血白蛋白的分離；(4)層析；(5)超濾。該方法操作簡單，提取的白蛋白純度高，提取白蛋白純度可達(dá)99%，與傳統(tǒng)方法比較，提取效率可提高25%。
【專利說明】兔血中白蛋白的純化制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及兔血中白蛋白的純化制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]兔血含有很高的營養(yǎng)價值，可加工成多種產(chǎn)品，供食用、藥用，或作為畜禽的動物性飼料。兔血可提取多種生物藥物和生化試劑，如醫(yī)用血清、血清抗原、凝血酶、亮氨酸、蛋白胨等，兔血醫(yī)用價值高，但目前兔血提取技術(shù)僅限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，無法達(dá)到純化提取，且不能產(chǎn)業(yè)化提取和生產(chǎn)，對兔血的應(yīng)用存在一定的局限性。目前，應(yīng)用最廣泛的是牛血清白蛋白，用于細(xì)胞培養(yǎng)、WB封閉劑、代謝反應(yīng)、生化測定、抗體稀釋等，兔血清白蛋白在用于封閉劑、抗體稀釋、生化測定等方面要優(yōu)于牛血清白蛋白。常用的方法為鹽析法和DEAE柱層析法，且在兔血方面主要是在實(shí)驗(yàn)室的小批量處理，本方法在處理量和純度方面較之傳統(tǒng)方法都有極大的提升。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種兔血中白蛋白的純化制備方法，該方法操作簡單，提取的白蛋白純度高。
[0004]兔血中白蛋白的純化制備方法，主要包括如下工藝步驟:
(1)兔血前處理
a.將50L新鮮兔血按16:1的比例加入4.0%的枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)溶液中，并攪勻；
b.連續(xù)流離心機(jī)離心，離心力約為400g，離心上清為血漿，沉淀物為血球等細(xì)胞，收集上清；
c.將收集的上清通過深層濾器，收集濾出液；
(2)濾出液脫鹽
采用G25脫鹽層析，將20L的濾出液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，當(dāng)紫外檢測器檢測到蛋白流出時，切換至收集管路，直至紫外檢測器信號值為其峰值的1/10，切換至廢液，直至紫外檢測器信號為平，重復(fù)上樣；
(3)兔血白蛋白的分離
a.冷沉淀:將G25脫鹽柱的收集液置于4°C的環(huán)境中過夜，其會析出大量的沉淀物，該沉淀物即為兔凝血酶原和其他蛋白質(zhì)的混合物；
b.離心:將冷沉淀的溶液在4°C的條件下，離心約30min，收集上清液；
(4)層析
a.將步驟(3)中收集的上清液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集穿透液。
[0005]所述層析柱為450*200，填料為DEAE 6FF，裝填高度為15cm，約需要22L填料。Buffer A:15mM HAc-NaAc, pH 為 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 為 4.5。
[0006]b.將a中收集的穿透液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集二次穿透液。
[0007]所述層析柱為450*200，填料為CM，裝填高度為15cm，約需要22L填料。Buffer A:25mM HAc-NaAc，pH 為 4.5 ；Buffer B:25mM NaAc + 0.25M NaCl，pH 為 5.5。
[0008](5)超濾
在進(jìn)液口放入兔血白蛋白洗脫液中(pH為7.0)，待兔血白蛋白洗脫液體積約為之前的1/10時,關(guān)閉超濾系統(tǒng)，收集進(jìn)液管路和回流管路中的兔血白蛋白洗脫液。
[0009]將膜包用0.1M NaOH沖洗30min，再用水沖洗直至pH約為7，將膜包取出并置于保存液中，提取白蛋白純度可達(dá)99%，與傳統(tǒng)方法比較，提取效率可提高25%。

【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0011]兔血中白蛋白的純化制備方法，主要包括如下工藝步驟:
(1)兔血前處理
a.將50L新鮮兔血按16:1的比例加入4.0%的枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)溶液中，并攪勻；
b.連續(xù)流離心機(jī)離心，離心力約為400g，離心上清為血漿，沉淀物為血球等細(xì)胞，收集上清；
c.將收集的上清通過深層濾器，收集濾出液；
(2)濾出液脫鹽
采用G25脫鹽層析，將20L的濾出液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，當(dāng)紫外檢測器檢測到蛋白流出時，切換至收集管路，直至紫外檢測器信號值為其峰值的1/10，切換至廢液，直至紫外檢測器信號為平，重復(fù)上樣；
(3)兔血白蛋白的分離
a.冷沉淀:將G25脫鹽柱的收集液置于4°C的環(huán)境中過夜，其會析出大量的沉淀物，該沉淀物即為兔凝血酶原和其他蛋白質(zhì)的混合物；
b.離心:將冷沉淀的溶液在4°C的條件下，離心約30min，收集上清液；
(4)層析
a.將步驟(3)中收集的上清液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集穿透液。
[0012]層析柱為450*200，填料為DEAE 6FF，裝填高度為15cm，約需要22L填料，BufferA:15mM HAc-NaAc，pH 為 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 為 4.5。
[0013]b.將a中收集的穿透液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集二次穿透液。
[0014]層析柱為450*200，填料為CM，裝填高度為15cm，約需要22L填料。Buffer A:25mMHAc-NaAc，pH 為 4.5 ；Buffer B:25mM NaAc + 0.25M NaCl，pH 為 5.5。
[0015](5)超濾
在進(jìn)液口放入兔血白蛋白洗脫液中(pH為7.0)，待兔血白蛋白洗脫液體積約為之前的1/10時,關(guān)閉超濾系統(tǒng)，收集進(jìn)液管路和回流管路中的兔血白蛋白洗脫液。
[0016]將膜包用0.1M NaOH沖洗30min，再用水沖洗直至pH約為7，將膜包取出并置于保存液中。
[0017]此外，本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，基于相同手段所達(dá)到的技術(shù)效果，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.兔血中白蛋白的純化制備方法，其特征在于:主要包括如下工藝步驟: (1)兔血前處理 a.將50L新鮮兔血按16:1的比例加入4.0%的枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)溶液中，并攪勻； b.連續(xù)流離心機(jī)離心，離心力約為400g，離心上清為血漿，沉淀物為血球等細(xì)胞，收集上清； c.將收集的上清通過深層濾器，收集濾出液； (2)濾出液脫鹽 采用G25脫鹽層析，將20L的濾出液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，當(dāng)紫外檢測器檢測到蛋白流出時，切換至收集管路，直至紫外檢測器信號值為其峰值的1/10，切換至廢液，直至紫外檢測器信號為平，重復(fù)上樣； (3)兔血白蛋白的分離 a.冷沉淀:將G25脫鹽柱的收集液置于4°C的環(huán)境中過夜，其會析出大量的沉淀物，該沉淀物即為兔凝血酶原和其他蛋白質(zhì)的混合物； b.離心:將冷沉淀的溶液在4°C的條件下，離心約30min，收集上清液； (4)層析 a.將步驟(3)中收集的上清液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集穿透液； 所述層析柱為450*200，填料為DEAE 6FF，裝填高度為15cm，約需要22L填料；BufferA:15mM HAc-NaAc, pH 為 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 為 4.5 ; b.將a中收集的穿透液通過上樣管路上樣，待上樣完成后切至進(jìn)液管路，收集二次穿透液； 所述層析柱為450*200，填料為CM，裝填高度為15cm，約需要22L填料；Buffer A:25mMHAc-NaAc, pH 為 4.5 ；Buffer B:25mM NaAc + 0.25M NaCl，pH 為 5.5 ; (5)超濾 在進(jìn)液口放入兔血白蛋白洗脫液中(pH為7.0)，待兔血白蛋白洗脫液體積約為之前的1/10時，關(guān)閉超濾系統(tǒng)，收集進(jìn)液管路和回流管路中的兔血白蛋白洗脫液； 將膜包用0.1M NaOH沖洗30min，再用水沖洗直至pH約為7，將膜包取出并置于保存液中。
【文檔編號】C07K14/765GK104231074SQ201410454603
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】葛安山, 劉曉明, 荊榮燕 申請人:青島康大食品有限公司, 青島中創(chuàng)生物科技有限公司