一種簡便的gc法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法，其特征在于：在采用三氯甲烷制備樣品時(shí)簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確度，精密度，耐用性，符合《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指南·質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》的要求。本發(fā)明對(duì)現(xiàn)行的采用氣相色譜法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法進(jìn)行了改進(jìn)，并且對(duì)改進(jìn)后的方法進(jìn)行系統(tǒng)適用性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、線性及耐用性的驗(yàn)證，確保該分析方法能夠滿足測定要求，具有不需要將三氯甲烷揮發(fā)干、操作時(shí)間短、增加了實(shí)驗(yàn)效率、有機(jī)相體積為1.0 mL和操作偏差小的特點(diǎn)。
【專利說明】
一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物制品的測定方法，特別是涉及一種簡便的GC法測定人血白蛋 白中辛酸鈉含量的方法，本發(fā)明采用氣相色譜法檢測人血白蛋白中辛酸鈉的含量，優(yōu)化了 檢測方法，并對(duì)新的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
【背景技術(shù)】
[0002] 辛酸鈉被廣泛用于人血白蛋白的穩(wěn)定劑，它在人血白蛋白加熱保溫過程中能夠起 穩(wěn)定和保護(hù)作用，防止白蛋白的變性，確保制品有良好的外觀。然而，辛酸鈉有一定的毒性， 需控制其在人白蛋白中的含量?！吨袊幍洹芬?guī)定每Ig蛋白質(zhì)中應(yīng)為〇. 140~0.180mmol。
[0003] 《中國藥典》已經(jīng)收錄了辛酸鈉測定法(附錄VI K)，但該方法制備樣品需要將三氯 甲烷揮發(fā)至干，并且樣品的終體積是1〇〇此。操作時(shí)間較長并且容易在檢測中產(chǎn)生偏差，因 此，本發(fā)明對(duì)藥典方法進(jìn)行了改變和優(yōu)化，根據(jù)《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指 導(dǎo)原則和《藥品GMP指南?質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》的要求，非藥典分析方法或方法發(fā) 生改變，應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證后才能使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，經(jīng)過大量試驗(yàn)和反復(fù)研究， 給出了一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法。本發(fā)明對(duì)現(xiàn)行的采用GC法測 定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法進(jìn)行了改進(jìn)，并且對(duì)改進(jìn)后的方法進(jìn)行系統(tǒng)適用性、準(zhǔn) 確度、精密度、專屬性、定量限、線性及耐用性的驗(yàn)證，確保該分析方法能夠滿足測定要求， 具有不需要將三氯甲烷揮發(fā)干、操作時(shí)間短、增加了實(shí)驗(yàn)效率、有機(jī)相體積為1.0 mL和操作 偏差小的特點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案是，這種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的 方法，其特征在于:其測定方法如下。
[0006] 由以下步驟組成。
[0007] 1.取人血白蛋白一批次1瓶，作為方法驗(yàn)證供試品。
[0008] 溶液配制。
[0009] 1.5111〇1/1高氯酸溶液:取高氯酸12.2 1^，加超純水定容至10〇111匕 [0010]正庚酸溶液:精密稱定0.2 g，用三氯甲烷定容至10 mL，濃度為20 mg/mL。
[0011] 正辛酸溶液:精密稱定0.5 g，用三氯甲烷定容至10 mL，濃度為50 mg/mL。
[0012] 線性溶液:分別量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入 正庚酸溶液1.0 mL，分別用三氯甲燒定容至10 mL，辛酸線性濃度為0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、 2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/mL〇
[0013] 定量限溶液:取辛酸線性濃度為0.6 mg/mL溶液1.0 mL，用三氯甲烷定容至10 mL。
[0014] 標(biāo)準(zhǔn)品溶液:取辛酸線性濃度為3.5 mg/mL溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0015]內(nèi)標(biāo)溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用三氯甲烷定容至25 mL。
[0016] 精密度溶液:量取人血白蛋白500 yL加水500 yL，加1.5 mol/L高氯酸溶液400 μ L，振蕩混勻2分鐘，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻2分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。平行 制備6份，取下層有機(jī)溶液進(jìn)樣。
[0017] 準(zhǔn)確度溶液:分別量取人血白蛋白600 yL加水400 yL(120%溶液）、400 yL加水600 μΚ80%溶液），混勻，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400 yL，振蕩混勻2分鐘，各加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶 液，振蕩混勻2分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。分別平行制備3份，取下層有機(jī)溶液進(jìn)樣。
[0018] 供試品溶液:精密度溶液作為供試品溶液。
[0019] 空白溶液:取三氯甲烷作為空白溶液。
[0020] 試驗(yàn)條件(儀器參數(shù)）。
[0021] 色譜柱:DB-FFAP( 123-3232)，0· 32 mm*30 m。
[0022] FID:23(TC。
[0023] 進(jìn)樣口 ：23(TC。
[0024] 爐溫：16(TC。
[0025] 載氣:氮?dú)狻?br>[0026] 流速:2.0 mL/min。
[0027] 進(jìn)樣量:0.1 yL。
[0028] 運(yùn)行時(shí)間：10分鐘。
[0029]結(jié)果計(jì)算。
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,辛酸峰與庚酸峰面積之比 的RSD應(yīng)不大于5 %。以線性溶液中辛酸峰與庚酸峰面積比對(duì)辛酸濃度(mg/mL)作直線回歸， 求得直線回歸方程，直線回歸相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99,計(jì)算出供試品溶液中辛酸的濃度 (m g / m L )，結(jié)果計(jì)算中除辛酸峰與庚酸峰以外，其他的峰可忽略不計(jì)。再按下式計(jì)算供試品 中辛酸鈉含量。
[0031]辛酸鈉含量(mmol/g蛋白質(zhì)）。
[0032]式中:A為供試品溶液中辛酸的濃度，mg/m。
[0033] η為供試品溶液的稀釋倍數(shù)(1/供試品的取用量，以mL計(jì)算）。
[0034] 144.22為辛酸分子量(I mmol辛酸相當(dāng)于I mmol辛酸鈉）。
[0035] C為供試品蛋白質(zhì)含量，g/mL。
[0036]本發(fā)明在采用三氯甲烷制備樣品時(shí)簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確 度，精密度，耐用性，符合《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指 南?質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》的要求。
[0037]所述的三氯甲烷制備樣品時(shí)不需要將三氯甲烷揮發(fā)至干。
[0038] 所述的系統(tǒng)適用性:標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,標(biāo)準(zhǔn)品 溶液中辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在 0.95~1.20之間。
[0039] 所述的專屬性:空白溶液應(yīng)沒有其他峰干擾測定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液中辛 酸峰的保留時(shí)間的RSD不大于2%。
[0040] 所述的線性:r不低于0.99。
[0041] 所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值應(yīng)不小于10。
[0042] 所述的精密度:重復(fù)性:精度度溶液中辛酸鈉含量的RSD應(yīng)不大于5%，中間精密度： 兩個(gè)分析人員的RSD應(yīng)不大于5%。
[0043] 所述的準(zhǔn)確度:準(zhǔn)確度溶液與精密度溶液中辛酸鈉含量的RSD應(yīng)不大于5%。
[0044]所述的耐用性:流速變化±25%系統(tǒng)適用性應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0045]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為。
[0046] 1.三氯甲烷對(duì)人體及環(huán)境都有危害，本發(fā)明不需要將三氯甲烷揮發(fā)干，操作時(shí)間 短。增加了實(shí)驗(yàn)效率。
[0047] 2.樣品的終體積是IOOyL，容易引起偏差，本發(fā)明有機(jī)相體積為1.0 mL，操作偏差 小。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下通過實(shí)施例詳細(xì)說明發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例并非是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0049] 1.進(jìn)樣順序： 空白溶液(1針） 內(nèi)標(biāo)溶液(1針） 標(biāo)準(zhǔn)品溶液(6針） 線性溶液(各1針） 定量限溶液(6針） 精密度溶液(各1針） 準(zhǔn)確度溶液(各1針） 流速變化（± 25%)后進(jìn)樣順序:標(biāo)準(zhǔn)品溶液(6針）。
[0050] 2.系統(tǒng)適用性驗(yàn)證。
[0051]目的：確認(rèn)色譜條件符合系統(tǒng)適用性要求，能夠滿足檢測需要。
[0052]方法：以6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性驗(yàn)證，計(jì)算辛酸峰與庚酸峰的分離度、辛 酸峰與庚酸峰面積之比及RSD值，及辛酸峰的拖尾因子。
[0053] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0054] A.辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5。
[0055] B.辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %。
[0056] C.辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.20之間。
[0057] 3.專屬性驗(yàn)證。
[0058] 目的：確認(rèn)在雜質(zhì)(庚酸)存在下，本方法能夠正確測定出被測物辛酸。
[0059] 方法。
[0060] A.通過1針空白溶液確定其他雜質(zhì)對(duì)辛酸測定無干擾。
[0061] B.通過1針內(nèi)標(biāo)溶液確定庚酸峰保留時(shí)間。
[0062] C.標(biāo)準(zhǔn)品溶液6針，分別計(jì)算庚酸峰保留時(shí)間和辛酸峰保留時(shí)間。
[0063] D.供試品溶液(精密度溶液)6份各1針，分別計(jì)算庚酸峰保留時(shí)間和辛酸峰保留 時(shí)間。
[0064] E.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液辛酸峰保留時(shí)間的RSD值。
[0065] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0066] A.空白溶液應(yīng)沒有其他峰干擾測定。
[0067] B.辛酸峰的保留時(shí)間的RSD不大于2%。
[0068] 4.線性驗(yàn)證。
[0069] 目的：確認(rèn)在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，辛酸峰與庚酸峰面積比與樣品中被測物辛酸的濃度直 接呈正比關(guān)系的程度。
[0070] 方法：以5種濃度的線性溶液的辛酸峰與庚酸峰面積比對(duì)辛酸濃度(mg/mL)作直線 回歸，求得直線回歸方程。
[0071] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0072] 直線回歸相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不低于0.99。
[0073] 5 ·定量限驗(yàn)證。
[0074] 目的：確認(rèn)樣品中的被測物能夠被定量測定的最低量。
[0075] 方法:取定量限溶液（線性驗(yàn)證中的最低濃度0.6 mg/mL溶液再稀釋10倍)6份各1 針連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算辛酸峰的信噪比。
[0076]可接受標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)6針定量限溶液的辛酸峰信噪比平均值不小于10。
[0077] 6.精密度驗(yàn)證。
[0078]目的：通過重復(fù)性驗(yàn)證和中間精密度驗(yàn)證，確認(rèn)在選定的測試條件下，對(duì)同一均勻 供試品溶液多次測定所得結(jié)果之間的接近程度。
[0079]方法。
[0080] A ·重復(fù)性驗(yàn)證。
[0081]在相同條件下，由同一個(gè)分析人員對(duì)6份精密度溶液(供試品溶液)各1針連續(xù)進(jìn) 樣，計(jì)算出辛酸鈉含量，并計(jì)算辛酸鈉含量RSD。
[0082] B.中間精密度驗(yàn)證。
[0083]在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，在不同的時(shí)間，由另一個(gè)分析人員對(duì)6份精密度溶液(供試品溶 液)各1針連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算辛酸鈉含量，并計(jì)算兩個(gè)分析人員測定結(jié)果的RSD。
[0084] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0085] 重復(fù)性驗(yàn)證:辛酸鈉含量RSD應(yīng)不大于5%。
[0086]中間精密度驗(yàn)證:兩個(gè)分析人員測定結(jié)果的RSD應(yīng)不大于5%。
[0087] 7 ·準(zhǔn)確度驗(yàn)證。
[0088] 目的：確認(rèn)用本方法測定的結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。 方法:分別對(duì)6針精密度溶液(100%溶液）、兩種準(zhǔn)確度溶液(120%溶液和80%溶液)各3針 進(jìn)行辛酸峰與庚酸峰面積之比計(jì)算，計(jì)算辛酸鈉含量，并計(jì)算辛酸鈉含量的RSD。
[0089] 可接受標(biāo)準(zhǔn):辛酸鈉含量RSD應(yīng)不大于5%。
[0090] 8 ·耐用性驗(yàn)證。
[0091 ]目的：確認(rèn)在流速變化± 25%時(shí)，系統(tǒng)適用性結(jié)果不受影響。
[0092]方法。
[0093] A.將流速調(diào)整為2.5mL/min(+25%)，進(jìn)6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算辛酸峰與庚酸峰的分 離度、辛酸峰與庚酸峰面積之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0094] B.將流速調(diào)整為1.5mL/min( -25%)，進(jìn)6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算辛酸峰與庚酸峰的 分離度、辛酸峰與庚酸峰面積之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0095] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0096]系統(tǒng)適用性符合下列要求。
[0097] A.辛酸峰與庚酸峰的分離度應(yīng)大于1.5。
[0098] B.辛酸峰與庚酸峰面積之比RSD應(yīng)不大于5%。
[0099] C.辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.20之間。
[0100]總結(jié):本發(fā)明給出的該方法可以準(zhǔn)確的檢測人血白蛋白中辛酸鈉的含量，減少了 實(shí)驗(yàn)偏差和環(huán)境污染，提1? 了實(shí)驗(yàn)效率D
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征在于:采用Ξ氯甲燒 制備樣品時(shí)簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確度，精密度，耐用性，符合《中國藥 典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指南?質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》 的要求，該測定方法如下： 取人血白蛋白一批次1瓶，作為方法驗(yàn)證供試品； 溶液配制： 1.5mol/L高氯酸溶液:取高氯酸12.2 mL，加超純水定容至100 mL; 正庚酸溶液:精密稱定0.2 g，用Ξ氯甲燒定容至10 mL，濃度為20 mg/血； 正辛酸溶液:精密稱定0.5 g，用Ξ氯甲燒定容至10 mL，濃度為50 mg/血； 線性溶液:分別量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入正庚 酸溶液1.0 mL，分別用Ξ氯甲燒定容至10 mL，辛酸線性濃度為0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/ni; 定量限溶液:取辛酸線性濃度為0.6 mg/血溶液1.0血，用Ξ氯甲燒定容至10血； 標(biāo)準(zhǔn)品溶液:取辛酸線性濃度為3.5 mg/mL溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液； 內(nèi)標(biāo)溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用Ξ氯甲燒定容至25 mL; 精密度溶液:量取人血白蛋白500化加水500化，加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振 蕩混勻2分鐘，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻2分鐘，W3000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、20分鐘； 平行制備6份，取下層有機(jī)溶液進(jìn)樣； 準(zhǔn)確度溶液:分別量取人血白蛋白600化加水400化（120%溶液）、400化加水600化 (80%溶液），混勻，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振蕩混勻2分鐘，各加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶 液，振蕩混勻2分鐘，W3000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、20分鐘，分別平行制備3份，取下層有機(jī)溶液進(jìn)樣； 供試品溶液:精密度溶液作為供試品溶液； 空白溶液:取Ξ氯甲燒作為空白溶液； 試驗(yàn)條件(儀器參數(shù)）： 色譜柱：DB-FFAP(123-3232),0.32 mm*30 m， FID： 230 °C, 進(jìn)樣口 ：230°C， 爐溫：160 °C， 載氣:氮?dú)猓? 流速:2.0血/min, 進(jìn)樣量:0.1化， 運(yùn)行時(shí)間：10分鐘； 結(jié)果計(jì)算： 標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD 應(yīng)不大于5 %，W線性溶液中辛酸峰與庚酸峰面積比對(duì)辛酸濃度(mg/mL)作直線回歸，求得 直線回歸方程，直線回歸相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99,計(jì)算出供試品溶液中辛酸的濃度(mg/ mL)，結(jié)果計(jì)算中除辛酸峰與庚酸峰W外，其他的峰可忽略不計(jì)，再按下式計(jì)算供試品中辛 酸鋼含量， 辛酸鋼含量(mmol/g蛋白質(zhì)）：式中:A為供試品溶液中辛酸的濃度，mg/mM η為供試品溶液的稀釋倍數(shù)(1/供試品的取用量，隊(duì)hL計(jì)算）； 144.22為辛酸分子量(1 mmol辛酸相當(dāng)于1 mmol辛酸鋼）； C為供試品蛋白質(zhì)含量，g/mL。2. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:Ξ氯甲燒制備樣品時(shí)不需要將Ξ氯甲燒揮發(fā)至干。3. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的系統(tǒng)適用性:標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,標(biāo)準(zhǔn)品溶 液中辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在 0.95~1.20之間。4. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的專屬性:空白溶液沒有其他峰干擾測定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液中辛酸峰的 保留時(shí)間的RSD不大于2〇/〇。5. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的線性:r不低于0.99。6. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值應(yīng)不小于10。7. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的精密度和重復(fù)性:精度度溶液中辛酸鋼含量的RSD應(yīng)不大于5%，中間精密度:兩 個(gè)分析人員的RSD應(yīng)不大于5%。8. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的準(zhǔn)確度:準(zhǔn)確度溶液與精密度溶液中辛酸鋼含量的RSD應(yīng)不大于5%。9. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的耐用性:流速變化± 25%系統(tǒng)適用性應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105842352SQ201610157446
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月18日
【發(fā)明人】楊健
【申請(qǐng)人】遼寧成大生物股份有限公司