一種抗凍多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗凍多肽及其制備方法，以魚皮膠原蛋白為原料，通過木瓜蛋白酶酶解，再經(jīng)過分離純化得到純化的特異性抗凍多肽，氨基酸全序列為：Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Arg-Gly-Ala-Pro。本發(fā)明突破了國內(nèi)外現(xiàn)存的抗凍蛋白的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數(shù)量的局限性以及國際FDA組織對轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學上的廣泛應用奠定理論基礎(chǔ)。
【專利說明】一種抗凍多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種抗凍多肽及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]食品和醫(yī)藥產(chǎn)品在低溫儲存和運輸過程中由于環(huán)境溫度的波動變化而反復地遭受冰晶生長和重結(jié)晶的問題越來越受到人們的關(guān)注。溫度的反復升降使冰晶不斷生長、凍融和重結(jié)晶，嚴重破壞細胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應有的品質(zhì)。世界范圍內(nèi)的科學家正面臨嚴肅的挑戰(zhàn):如何控制冰晶生長及重結(jié)晶，實現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥廣品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。
[0003]抗凍蛋白，也稱“冰結(jié)構(gòu)蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)?？箖龅鞍子捎谄渚哂锌刂票L、減少細胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點和突出意義而成為熱點研究主題。同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域而并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用木瓜蛋白酶酶解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，使抗凍活性得以高效地實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明提供的一種抗凍多肽，是由22個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸序列為:Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Arg-Gly-Ala-Pro0
[0007]本發(fā)明還提供所述抗凍多肽的制備方法:以魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白為原料，對其進行酶解，將酶解產(chǎn)物分離純化得到抗凍多肽。
[0008]本發(fā)明進一步提供所述酶解條件為:木瓜蛋白酶:魚源膠原蛋白=1:10-15 (w/w)，pH為7.0，溫度是350C _40°C，酶解時間為20-40分鐘。
[0009]優(yōu)選的酶解條件為:木瓜蛋白酶:魚源膠原蛋白=1:10 (w/w), pH為7.0，溫度是37 °C，酶解時間為30分鐘。
[0010]本發(fā)明提供所述分離純化的步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用S印hadex G_50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集10%乙腈和90%A(v/v)處的洗脫峰，得到所述的抗凍多肽。
[0011]為了實現(xiàn)上述方案，本發(fā)明采取的具體步驟如下:
(I)魚源膠原蛋白酶解條件的優(yōu)化
本技術(shù)所采用的酶和魚(魚皮、魚鱗)膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司(中國.上海，酶活600U/mg)。采用單因素實驗，分別對三個酶解因素進行考察，分別為酶解溫度35°C、37 °C >40 °C >45 V和50 V、酶解時間10，20，30,40和60分鐘以及酶-魚源膠原蛋白配比1:100，1:50，1:20，1:15和1:10 w/w。稱取1.65克魚源膠原蛋白溶解于6ml Mil1-Q水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至7.0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是:PH為7.0、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10。
[0012](2)酶解產(chǎn)物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過Sephadex G-50凝膠色譜(長100cm,直徑2.6cm)進行分離,洗脫液為去離子水,流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑2.0cm)進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0013](3)抗凍活性的測試
本發(fā)明按照國際抗凍蛋白活性檢測的標準，建立抗凍活性檢測系統(tǒng)?？箖龌钚圆捎脵z測抗凍多肽對低溫凍融細菌的保護作用來測試。
[0014](4)氨基酸序列測定
利用蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA,U.S.A)測定特異性抗凍多肽的氨基酸全序列為:Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly- Asp-Arg-Gly-Ala—Pro。
[0015]本發(fā)明立足于抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于特異的肽鏈結(jié)構(gòu)域而不是整體蛋白質(zhì)在起作用的理論基礎(chǔ)，以來自于魚源膠原蛋白為原材料，著眼于通過木瓜蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗凍活性得以高效地實現(xiàn)。本發(fā)明為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學上的廣泛應用奠定理論基礎(chǔ)。
[0016]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1純化魚皮膠原蛋白抗凍多肽的CLC - HPLC-C18色譜圖；
圖2純化的特異性抗凍多肽對保加利亞乳酸桿菌的低溫保護作用；其中，圖中的A、B分別表示未添加特異性抗凍多肽的保加利亞乳酸桿菌、添加0.5% (w/w)特異性抗凍多肽樣品的保加利亞乳酸桿菌生長情況圖。[0018]
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明的抗凍多肽是由22個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸全序列為:Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Arg-Gly-Ala—Proο
[0020]制備方法如下:
以魚源膠原蛋白為原料，使用木瓜蛋白酶對其進行酶解，并按照國際抗凍蛋白活性檢測的標準，建立抗凍活性檢測系統(tǒng)，優(yōu)化其酶解條件，得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是:酶解PH為7.0、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10 ;在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過S印hadex G-50凝膠色譜(長100cm，直徑2.6cm)進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑
2.0cm)進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜(長15cm,直徑0.8cm)再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結(jié)束，進行梯度洗脫，收集10%乙腈和90 %水(v/v)處的洗脫峰，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0021]所述多肽由22個氨基酸所構(gòu)成，多肽的氨基酸全序列為=Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly- Asp-Arg-Gly-Ala—Pro。
[0022]本發(fā)明采用的儀器、檢測手段如下:
本發(fā)明的制備抗凍多肽的抗凍活性檢測系統(tǒng)，采用低溫凍融細菌，檢測添加抗凍多肽對細菌低溫凍融后的生長保護作用。將活化的保加利亞乳酸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中37°C,130r/min搖床培養(yǎng)過夜作為種子液，將種子液以1:100的比例接種到新的液體培養(yǎng)基中，37°C，130r/min搖床培養(yǎng)至OD6tltl=L O左右。取若干1.5mL已滅菌的離心管，加入經(jīng)過濾除菌的濃度為250 μ g/mL待測樣品900 μ L，將菌液稀釋IO4倍，吸取100 μ L加入至待測樣品中，混勻，涂布，37°C在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18h，計菌落數(shù)。將剩余的樣品-菌液混合液置于-20°C低溫處理24h，取出融化并涂布，在培養(yǎng)箱中37°C倒置培養(yǎng)18h，計菌落數(shù)，每組做兩個平行，然后計算保加利亞乳酸桿菌的存活率。另做未添加特異性抗凍多肽的保加利亞乳酸桿菌的存活率為對照。
【權(quán)利要求】
1.一種抗凍多肽，其特征在于:所述多肽的氨基酸序列為=Pro-Gly-Lys-Asn-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Asn-Gly-Arg-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly
-Asp-Arg-Gly-Ala-Pro0
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:以魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白為原料，對其進行酶解，將酶解產(chǎn)物分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述酶解條件為:木瓜蛋白酶:魚源膠原蛋白=1:10 - 15(w/w)，pH為7.0，溫度是35°C_40°C，酶解時間為20-40分鐘。
4.一種如權(quán)利要求3所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述酶解條件為:木瓜蛋白酶:魚源膠原蛋白=1:10 (w/w)，pH為7.0，溫度是37°C，酶解時間為30分鐘。
5.一種如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰,再用Sulfopropyl-SepadexC-25陽離子交換色譜進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離， 反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min,收集10%乙腈和90 %水(v/v)處的洗脫峰，得到所述的抗凍多肽。
【文檔編號】C07K1/16GK103524610SQ201310439269
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】汪少蕓, 邵彪, 王文龍, 饒平凡 申請人:福州大學