一種多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽，相應(yīng)的核酸分子，包含上述核酸分子的構(gòu)建體和/或載體和/或細(xì)胞，和/或包含所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體和/或細(xì)胞的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述組合物用于醫(yī)療用途，優(yōu)選用于治療傳染病。此外，本發(fā)明涉及所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體、細(xì)胞和/或組合物作為抗菌劑、優(yōu)選作為食品添加劑或消毒劑的應(yīng)用，或用于檢測細(xì)菌，優(yōu)選用于診斷應(yīng)用。
【專利說明】一種多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽，相應(yīng)的核酸分子，包含上述核酸分子的構(gòu)建體和/或載體和/或細(xì)胞，和/或包含所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體和/或細(xì)胞的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述多肽、相應(yīng)的核酸分子、包含上述核酸分子的構(gòu)建體和/或載體和/或細(xì)胞、和/或組合物，用于醫(yī)療用途，優(yōu)選用于治療傳染病。此外，本發(fā)明涉及所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體、細(xì)胞和/或組合物作為抗菌劑、優(yōu)選作為食品添加劑或消毒劑的應(yīng)用，或在用于檢測細(xì)菌、優(yōu)選用于診斷應(yīng)用中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌是一種主要的人類病原體，其通常牽涉若干嚴(yán)重的傳染病和食物中毒。由于新出現(xiàn)的耐抗生素菌株，它的治療變得越來越困難。來自感染金黃色葡萄球菌的噬菌體的內(nèi)溶素已表明潛在地控制這些病原體并可以用于它們的特異性檢測。在大多數(shù)情況下，靶向葡萄球菌物種的內(nèi)溶素應(yīng)用的主要障礙是低酶活性、難以大批量生產(chǎn)和/或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
[0003]總是需要關(guān)于例如抗微生物活性和/或穩(wěn)定性具有改善特性的新抗菌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本文報道的是新表征的Ply2638，金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&的內(nèi)溶素。上述酶和若干工程化衍生物以可溶性方式表達(dá)在大腸桿菌中并在凍干(冷凍干燥，Iyophilisation)以后顯示出乎意料的穩(wěn)定性,如在重建(重構(gòu),reconstitution)以后由它們的裂解活性所證明的。除細(xì)胞壁結(jié)合域(其結(jié)合葡萄球菌屬的細(xì)胞壁)之外，我們還示出，兩個功能域，即M23內(nèi)肽酶域和酰胺酶域?qū)τ谧罴训牧呀饣钚允侵陵P(guān)重要的。
[0005]我們示出，具有催化結(jié)構(gòu)域的酶的改造和/或源自金黃色葡萄球菌Φ11內(nèi)溶素、OTwort內(nèi)溶素、和溶葡萄球菌素的細(xì)胞壁結(jié)合域的復(fù)制產(chǎn)生異源多肽融合產(chǎn)物，其在凍干和重建以后具有增強的裂解活性和/或改變的pH最適點(最適度,optimum)和/或增加的穩(wěn)定性。
[0006]核酸分子
[0007]在第一方面，提供了一種核酸分子，其包括第一核苷酸序列或由第一核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與 SEQ ID NO: 12 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性(關(guān)于所有本文使用的SEQ ID NO的概述參見表1)。優(yōu)選地，所述第一核苷酸序列具有至少282、285、290、300、310、320、330、340、350、360或370個核苷酸，更優(yōu)選至少381個核苷酸的長度，和/或至多510、480、450、420或390個核苷酸的長度。優(yōu)選地，所述核酸分子具有至少282、285、290、300、310、320、330、340、350,360,370個核苷酸，更優(yōu)選至少381個核苷酸的長度，和/或至多4500、4200、3900和/或3600個核苷酸的長度。優(yōu)選地，所述核酸分子具有至少1200、1230、1260、1290、1320、1350、1380、1410、1440、1470、1500、1530 或 1560 個核苷酸的長度，和 / 或至多 4500,4200,3900和/或3600個核苷酸的長度。還優(yōu)選的是，按照本發(fā)明的核酸分子具有至少1890、1920、1950、1980、2010、2040、2070、2100、2130 或 2160 個核苷酸的長度，和 / 或至多 4500、4200,3900和/或3600個核苷酸的長度。優(yōu)選地，所述第一核苷酸序列編碼細(xì)胞壁結(jié)合域，其結(jié)合葡萄球菌屬的肽聚糖細(xì)胞壁。優(yōu)選地，所述第一核苷酸序列源于金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內(nèi)溶素。
[0008]如估計自與ALE-1的C端92個殘基的晶體結(jié)構(gòu)的序列對比(Lu et al., J.Biol.Chem.，2006, 281(1): 549-58)，據(jù)估計，來自源自金黃色葡萄球菌噬菌體①2638a內(nèi)溶素的細(xì)胞壁結(jié)合域的最少94個氨基酸可以足以將上述酶引導(dǎo)到葡萄球菌屬的細(xì)胞壁。
[0009]可以利用技術(shù)人員公知的測定來評估(結(jié)構(gòu))域與葡萄球菌屬的肽聚糖細(xì)胞壁的結(jié)合。在優(yōu)選的實施方式中，免疫組織化學(xué)技術(shù)和/或基因融合技術(shù)(其產(chǎn)生標(biāo)記的構(gòu)建體)用來評估肽、多肽或蛋白質(zhì)與葡萄球菌屬的肽聚糖細(xì)胞壁的特異性結(jié)合。在上述免疫組織化學(xué)或融合技術(shù)中所使用的信號的定量方法是本領(lǐng)域公知的。
[0010]在一種實施方式中，可以利用熒光融合構(gòu)建體來量化葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合，上述突光融合構(gòu)建體包含多肽，其包含由第一核苷酸序列編碼的域。由Loessner etal (Molecular Microbiology2002, 44(2):335 - 349)以及在實施例1 中詳細(xì)描述了這樣的細(xì)胞壁結(jié)合測定。在該測定中，使包含所述熒光融合構(gòu)建體或陰性對照、優(yōu)選綠色熒光蛋白(GFP)的溶液經(jīng)受葡萄球菌屬細(xì)胞、優(yōu)選金黃色葡萄球菌細(xì)胞、更優(yōu)選金黃色葡萄球菌BB255指定時間段，其后通過離心作用，和結(jié)合的熒光融合構(gòu)建體一起，沉降細(xì)胞。暴露于熒光融合構(gòu)建體的葡萄球菌屬細(xì)胞的熒光信號減去暴露于陰性對照(優(yōu)選GPF)的葡萄球菌屬細(xì)胞的熒光信號是細(xì)胞結(jié)合的度量，如在本公開中所指的。
[0011 ] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，核酸分子將編碼多肽域，該多肽域結(jié)合葡萄球菌屬的肽聚糖細(xì)胞壁，當(dāng)使用這種測定時，檢測到沉降細(xì)胞的熒光信號的增加高于陰性對照(如本文中所定義的)。上述結(jié)合優(yōu)選是特異性的。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及核酸分子，該核酸分子編碼多肽或域，其呈現(xiàn)由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內(nèi)溶素(Ply2638)的肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合如本文所定義的至少50、60、70、80、90或100、150或200%的結(jié)合。
[0012]在一種實施方式中，本發(fā)明涉及核酸分子，其與編碼金黃色葡萄球菌噬菌體^2638 內(nèi)溶素的 SEQ ID NO:1 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0013]本發(fā)明進(jìn)一步涉及核酸分子，除所述第一核苷酸序列之外，其還包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。優(yōu)選地，所述裂解域呈現(xiàn)肽聚糖水解酶活性(如后文中所定義的)。所述核酸分子包含異源核苷酸序列，其在本文中被定義為“改造構(gòu)建體(retrofittedconstruct)，，。 [0014]如在本文中所使用的，術(shù)語〃異源序列〃或〃異源核酸〃是指這樣的核酸，其不是天然存在的，可操作地連接為所述第一核苷酸序列的鄰近序列。如在本文中所使用的，術(shù)語“異源”可以指“重組體”?！ㄖ亟M體〃是指這樣的遺傳本體(entity)，其不同于一般在天然界中發(fā)現(xiàn)的遺傳本體。當(dāng)應(yīng)用于核苷酸序列或核酸分子時，這意味著所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制和/或連接步驟、和其它程序(其致使產(chǎn)生不同于在天然界中發(fā)現(xiàn)的序列或分子的構(gòu)建體)的各種組合的產(chǎn)物。
[0015]可以通過技術(shù)人員公知的方法來評估“肽聚糖水解酶活性”，其在本文中還被定義為“裂解活性”。在實施方式中，可以用分光光度法并通過測量底物細(xì)胞懸浮液的濁度降低來評估裂解活性。優(yōu)選地，可以用分光光度法測量金黃色葡萄球菌懸液的濁度降低來評估裂解活性，其中通過用分光光度法(Libra S22，BioChrom)測量OD595來量化濁度。更優(yōu)選地，在37°C下，在PBS緩沖液(pH7.4，120mM氯化鈉沖，連同金黃色葡萄球菌懸浮液(其具有1±0.05的初始OD6tltl，如用分光光度法(Libra S22, Biochrom)所評估的)一起，溫育200nM的由核酸分子(如在本文中識別的)編碼的多肽30分鐘。通過將在溫育30分鐘以前的OD595減去在溫育30分鐘以后的OD595來計算濁度降低。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，核酸分子將包含編碼裂解域的核酸序列，當(dāng)利用這種測定時，檢測到至少10、20、30、40、50或60%的濁度降低。優(yōu)選地，檢測到至少70%的降低。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及核酸分子，該核酸分子編碼多肽，其呈現(xiàn)由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內(nèi)溶素(Ply2638)的裂解活性的至少50、60、70、80、90、100、150或200%或更高的裂解活性。
[0016]在實施方式中，本發(fā)明的核酸分子可以不包含SEQ ID NO:1或者不由SEQ ID NO:1構(gòu)成。SEQ ID NO:1編碼金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638內(nèi)溶素。
[0017]優(yōu)選的實施方式包括核酸分子，該核酸分子包含所述第一核苷酸序列(如本文中所識別的)并進(jìn)一步包含作為裂解域的第二和第三核苷酸序列，其中所述第二序列編碼內(nèi)肽酶域以及第三核苷酸序列編碼酰胺酶域。因此，本發(fā)明涉及核酸分子，該核酸分子包含所述第一核苷酸序列，其中所述核酸分子與SEQ ID勵:1具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性，或其中所述核酸分子進(jìn)一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。`
[0018]如在本文中所使用的，內(nèi)肽酶域優(yōu)選切割五甘氨酸交聯(lián)橋(cross-bridge)(Trayer, H.R.and Buckley, C.E.(1970)Molecular properties of lysostaphin,abacteriolytic agent specific for Staphylococcus aureus.J.Biol.Chem.245, 4842 -4846)，其存在于葡萄球菌屬的細(xì)胞壁中，優(yōu)選存在于金黃色葡萄球菌、模仿葡萄球菌和肉葡萄球菌的細(xì)胞壁中。如在本文中所使用的，酰胺酶域優(yōu)選水解包含Y-谷氨?；牡孜?。在用純化肽聚糖溫育包含任何這些域的所述多肽以后，可以通過表征切割產(chǎn)物來證實在多肽中這些域的功能和活性。優(yōu)選地，編碼第二或第三域的每個核苷酸序列具有細(xì)菌或噬菌體來源。在優(yōu)選的實施方式中，所述第二和第三核苷酸序列源于編碼酶的基因，上述酶選自由金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內(nèi)溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11內(nèi)溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體(pTwort內(nèi)溶素和模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素組成的組。優(yōu)選地，所述第二核苷酸序列與 SEQ ID NO: 14 或 15 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性以及所述第三核苷酸序列與SEQ ID NO: 17或18具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 序列同一性。
[0019]本發(fā)明包括如本文所定義的所有構(gòu)建體，其包含在構(gòu)建體內(nèi)的任何可能位置處的功能域(如在本發(fā)明中所指的)。在優(yōu)選的實施方式中，如本文所定義的核酸分子編碼多肽，該多肽具有由如本文中所識別的第一核酸序列編碼的C端域，其在本文中顯示編碼能夠靶向葡萄球菌屬的功能多肽。甚至更優(yōu)選的是如本文所定義的核酸分子，包括這樣的核酸分子，其與 SEQ ID NO:9 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。SEQ ID N0:9包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼C端SH3b同源細(xì)胞壁結(jié)合域(兩個域均來自由SEQ ID NO:1編碼的Ply2638:Leul38-LyS486 );第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列編碼多肽，其包含N端M23甘氨酰-甘氨酸內(nèi)肽酶同源域(由SEQ ID NO: 33編碼的成熟溶葡萄球菌素:Alal_Glyl54);以及第三核苷酸序列，其編碼中心酰胺酶-2同源域。它具有58.266kDa的理論大小。由SEQ ID NO:9編碼的多肽與金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內(nèi)溶素的不同之處在于:N-端M23內(nèi)肽酶域被來自模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的M23內(nèi)肽酶域取代。我們在這里示出，由SEQ IDNO: 9編碼的多肽，相比于金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內(nèi)溶素，顯示至少20%增加的裂解活性，同時在凍干和重建以后保持裂解活性。在優(yōu)選的實施方式中，包含所述第一、第二和第三核苷酸序列的核酸分子編碼多肽，相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體 Φ2638a 內(nèi)溶素的裂解活性，其呈現(xiàn)至少 0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6、
1.7、1.8、1.9或2倍的裂解活性。在優(yōu)選的實施方式中，包含所述第一、第二和第三核苷酸序列的核酸分子編碼多肽，相比于新制備的多肽，其在凍干和重建(如本文所定義的)以后，呈現(xiàn)至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%的裂解活性的降低，其中“新制備的”在本文中優(yōu)選被定義為，在_20°C下，以1.63mg/mL在凍干緩沖液(50mM Tris、500mM蔗糖、200mM甘露醇、
0.05%聚山梨酯20+50%甘油)中儲存至多2天，并且在測定中評估裂解活性(如本文中所確定的)之前立即融化。
[0020]凍干和重建在本文中被定義為通過冷凍干燥脫水并隨后通過添加水重建樣品。在實施方式中，可以通過針對3次變化的300ml凍干緩沖液(50mM磷酸鹽或Tris、500mM鹿糖、200mM甘露醇、pH7.4)等分部分進(jìn)行透析(滲析)并在液氮的氣相中進(jìn)行冷凍來進(jìn)行凍干和重建?？梢栽跇?biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行冷凍干燥，優(yōu)選地在_40°C和75毫托的真空下60分鐘，接著在5小時內(nèi)提高溫度至-10°C以及在-10°C和相同真空水平下保持另外60分鐘。作為最后的步驟，優(yōu)選在10小時內(nèi)將溫度提高至25°C。通過添加水重建樣品。
[0021]在另一種優(yōu)選的實施方式中，如本文所定義的核酸分子除上文識別的第一、第二和第三核苷酸序列之外還包含至少一個相同或異源的第一、第二和/或第三核苷酸序列的復(fù)制體。優(yōu)選地，如本文所定義的核酸分子除所述第一、第二和第三核苷酸序列之外還包含重復(fù)的相同第一核苷酸序列。我們在這里示出，如本文所定義的編碼細(xì)胞壁結(jié)合域的第一核苷酸序列的復(fù)制產(chǎn)生多肽，優(yōu)選地如由SEQ ID N0:20編碼的，相比于由缺少上述重復(fù)的第一域的核酸分子編碼的參比多肽的裂解活性，或相比于由SEQ ID N0:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內(nèi)溶素的裂解活性，其顯示至少5、10、20、30、20或40%增加的裂解活性，如在如本文中所確定的測定中所評估的，更具體地利用等摩爾量的多肽和改變的PBS緩沖液，其包含200、300、400、或1000nM NaCl。該實施方式還包括異源核酸分子，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列源于相同來源，其為金黃色葡萄球菌卩遼菌體0 2638a,所述核酸分子包含以下序列，其與SEQ ID 勵:1具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性，以及另外的重復(fù)的、相同的或異源的第一、第二和/或第三核苷酸序列。還優(yōu)選的是，如本文所定義的核酸分子包含核苷酸序列，其與SEQ ID N0:6 和 20 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。
[0022]在另一種優(yōu)選的實 施方式中，如本文所定義的核酸分子包含編碼CHAP(半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶)域的第四核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述第四核苷酸序列源于金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11或金黃色葡萄球菌噬菌體ΦΤ\νοι?內(nèi)溶素。甚至更優(yōu)選地，所述第四核苷酸序列與 SEQ ID NO: 18 或 SEQ ID NO: 19 具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。優(yōu)選地，如本文所定義的核酸分子包含核苷酸序列，其與SEQ ID ΝΟ:5或7具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性。我們在這里示出以下分子，其包含如由SEQ ID ΝΟ:5所定義的所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列，編碼以下多肽，相比于由缺少所述第四域的構(gòu)建體編碼的多肽，和/或相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內(nèi)溶素，其呈現(xiàn)增加的裂解活性和/或改變的、優(yōu)選降低的pH最適點。用分光光度法并在如前文所定義的條件下評估裂解活性。優(yōu)選地，相比于由參比多肽編碼的多肽(與所述多肽的差別僅在于缺少所述第四域)的裂解活性，或相比于由SEQ IDNO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內(nèi)溶素的裂解活性，所述多肽呈現(xiàn)至少0.7、 0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或 2 倍的裂解活性的增加。甚至更優(yōu)選地，相比于限定的參比多肽或由SEQ ID NO:1編碼的多肽，所述多肽呈現(xiàn)至少2.5倍的裂解活性的增加。
[0023]改變的或降低的pH最適點在本文中被定義為最佳的裂解活性改變或降低至較低的PH值，其中離子強度保持恒定。優(yōu)選地用分光光度法評估裂解活性(如本文所定義的)。優(yōu)選地，相比于由參比多肽編碼的多肽(與所述多肽的差別僅在于缺少所述第四域)的裂解活性，或相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內(nèi)溶素的裂解活性，裂解活性的PH最適點降低0.5-lpH單位。
[0024]本發(fā)明優(yōu)選涉及包含第一、第二、第三和可選地第四核苷酸序列(如本文中所識別的)的核酸分子，其編碼以下多肽，相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638a內(nèi)溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的pH最適點或者其具有增加的裂解活性和/或降低的PH最適點。當(dāng)利用如本文中所確定的測定或技術(shù)人員公知的方法時，在本文中識別的核酸分子沒有可檢測的差異。本發(fā)明還涉及包含如本文中所識別的第一、第二、和第四核苷酸序列的核酸分子，其編碼以下多肽，相比于由SEQ ID N0:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內(nèi)溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的PH最適點，或者其具有增加的裂解活性和/或降低的pH最適點。本發(fā)明還涉及包含如本文中所識別的第一、第三、和第四核苷酸序列的核酸分子，其編碼以下多肽，相比于由SEQID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638&內(nèi)溶素的裂解活性，其具有相同的裂解活性和/或相同的PH最適點，或者其具有增加的裂解活性和/或降低的pH最適點。本文識別的每種核苷酸序列，即第一、第二、第三、第四核苷酸序列，其編碼本文定義的多肽的單獨域，可以通過已知用于構(gòu)建和裝配核酸片段的任何常用方法加以裝配，其中上述常用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且廣泛描述于文獻(xiàn)(Sambrook, Maniatis et al.(1989))和本公開描述的實驗部分。在優(yōu)選的實施方式中，第一、第二、第三和/或第四核苷酸序列可操作地連接在一起。
[0025]因此，本發(fā)明的核酸分子編碼多肽，優(yōu)選如本文中所識別的多肽，其能夠借助于由如本文所定義的第一核苷酸序列編碼的細(xì)胞壁結(jié)合域來結(jié)合葡萄球菌屬，和/或溶解所述細(xì)菌，其中借助于分別由第二、第三和第四核苷酸序列編碼的內(nèi)肽酶和/或酰胺酶域和可選地CHAP域(如本文所定義的)。[0026]在優(yōu)選的實施方式中，如本文所定義的本發(fā)明的核酸分子可選地包含以下序列，其編碼便于純化的標(biāo)記。優(yōu)選地，所述標(biāo)記選自，但不限于，由FLAG標(biāo)記、多(His)標(biāo)記、HA標(biāo)記和Myc標(biāo)記組成的組。更優(yōu)選地,所述標(biāo)記是6xHis標(biāo)記。甚至更優(yōu)選地,所述標(biāo)記是N端6xHis標(biāo)記，其相同于SEQ ID NO: 43。
[0027]
[0028]在另外的方面，提供了由如上文識別的核酸分子編碼的多肽。這種多肽包含細(xì)胞壁結(jié)合域，并且優(yōu)選地包含內(nèi)肽酶域和/或酰胺酶域(如在之前的部分中所定義的)。
[0029]本發(fā)明包括的多肽域與SEQ ID NO:35、36、37、38、39、40、41和/或42優(yōu)選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。優(yōu)選地，本發(fā)明包括的多肽域優(yōu)選包含一個或多個假定接頭(連接子，linker)并與SEQID 勵:51、52、53、54、55、56、57和/或58具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0030]本發(fā)明包括的多肽與SEQ ID勵:21、25、26、27、29和/或32優(yōu)選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括的多肽與SEQ ID勵:25、26、27、29和/或32優(yōu)選具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性。
[0031]在本發(fā)明的實施方式中，多肽與SEQ ID N0:21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、和/或42優(yōu)選具有至少80%的序列同一性，其由核酸構(gòu)建體編碼，上述核酸構(gòu)建體與 SEQ ID 勵:1、5、6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18和/或19分別具有至少80%的同一性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽與 SEQ ID N0:25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、和 /或42具有至少80%的序列同一性，其由核酸構(gòu)建體編碼，上述核酸構(gòu)建體與SEQ ID N0:5、
6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18 和 / 或 19 分別具有至少 80% 的同一性。
`[0032]按照本發(fā)明的多肽可以具有至少94、95、96、100、110或120個氨基酸，優(yōu)選127個氨基酸和/或至多1500、1400、1300或1200個氨基酸的長度。優(yōu)選地，所述多肽的長度為至少 400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510 或 520 個氨基酸和 / 或至多1500、1400、1300或1200個氨基酸。還優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的多肽的長度為至少630、640、650、660、670、680、690、700、710 或 720 個氨基酸和 / 或至多 1500、1400、1300 或 1200 個氨基酸。
[0033]本發(fā)明包括的氨基酸或核苷酸序列可以源自如本文中所識別的序列中的一種，其中分別取代、插入、缺失、或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或更多個核苷酸或氨基酸。本發(fā)明包括的氨基酸序列可以源自如本文中所識別的序列中的一種，其中通過添加另外的N端或C端氨基酸或化學(xué)部分，以增加穩(wěn)定性、溶解性和活性。
[0034]本發(fā)明的實施方式包括變體多肽。變體多肽可以是多肽的非天然存在形式。多肽變體可以以一些工程化方式不同于分離自其天然來源的多肽。可以通過開始自SEQ IDNO: 1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20的核苷酸序列的定位誘變來制備變體。優(yōu)選地，多肽變體包含這樣的突變，其并不改變編碼的多肽的生物功能。按照優(yōu)選的實施方式，多肽變體呈現(xiàn)葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性，相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內(nèi)溶素的葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性，其是相同的或增強的。本發(fā)明的多肽變體優(yōu)選是SEQ ID N0:21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41和/或42的變體。具有相同的或增強的葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性的多肽變體是呈現(xiàn)金黃色葡萄球菌肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性的多肽，相比于由SEQ ID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體O2638a內(nèi)溶素的葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性(以如上文確定的測定所測得)，其是相同的或增加的。
[0035]按照另一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的核苷酸序列是SEQ ID N0:l、5、6、7、9、12、13、
14、15、16、17、18、19和/或20的核苷酸序列的變體。核苷酸序列變體可以用于制備如之前定義的多肽變體。核酸變體可以是如上文所定義的任何核苷酸序列的片段。核酸變體還可以是核苷酸序列，其與SEQ ID勵:1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20的差別在于遺傳密碼的簡并度。核酸變體還可以是SEQ ID N0:l、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、
18、19和/或20的等位變體。等位變體表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式的任何一種。優(yōu)選的核酸變體是核苷酸序列，其包含沉默突變?？商鎿Q地或組合地，還可以通過引入核苷酸取代來獲得核酸變體，上述核苷酸取代并不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列，而是對應(yīng)于用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的宿主生物體的密碼子選擇。按照優(yōu)選的實施方式，核酸變體編碼仍然呈現(xiàn)其生物功能的多肽。更優(yōu)選地，核苷酸序列變體編碼呈現(xiàn)葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性的多肽。甚至更優(yōu)選地，核酸變體編碼具有如之前定義的增強的葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性的多肽。編碼呈現(xiàn)葡萄球菌屬肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)合和/或裂解活性的多肽的核酸可以分離自任何微生物。
[0036]可以利用技術(shù)人員已知的技術(shù)來獲得所有這些變體，如在低至中等至高雜交條件下通過雜交篩查文庫(蛋白質(zhì)印跡(southern blotting)法)可以用來設(shè)計探針的核苷酸序列 SEQ ID 勵:1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20或其變體。低到中到高嚴(yán)格性條件是指在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200pg/ml剪切和變性鮭魚精DNA中，以及在分別用于低到中到高嚴(yán)格性的25%、35%或50%甲酰胺中的預(yù)雜交和雜交。隨后，洗滌雜交反應(yīng)三次，時間為 30分鐘，每次利用2X SSC、0.2%SDS以及用于低到中到高嚴(yán)格性的55°C、65。。、或 75。。。
[0037]如本文提供的序列信息不應(yīng)狹義地解釋為需要包括錯誤識別的堿基。技術(shù)人員能夠確定上述錯誤識別的堿基并且知道如何校正這樣的錯誤。
[0038]核酸構(gòu)建體
[0039]在另外的方面，提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含如在前述部分中所識別的核酸分子。這種核酸構(gòu)建體可以包含第一核酸序列，該第一核酸序列編碼以下多肽，其包含細(xì)胞壁結(jié)合域，可以進(jìn)一步包含如在前述部分中所定義的第二和第三以及可選的第四核酸序列。
[0040]本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。優(yōu)選地,表達(dá)載體包含本發(fā)明的核苷酸序列，其可操作連接于一個或多個控制序列，該控制序列引導(dǎo)編碼的多肽在細(xì)胞、受試者、或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的生產(chǎn)或表達(dá)。
[0041 ] 表達(dá)載體可以被看作是重組表達(dá)載體?？梢酝ㄟ^引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子將質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒轉(zhuǎn)化，來構(gòu)建這種載體。根據(jù)待轉(zhuǎn)化的宿主生物體的上述轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且廣泛描述于文獻(xiàn)中。
[0042]本發(fā)明的又一個主題是用于宿主生物體的轉(zhuǎn)化方法，其中通過整合(合并，integrating)本發(fā)明的至少一種核酸分子，可以通過任何適當(dāng)?shù)囊阎绞絹磉M(jìn)行上述轉(zhuǎn)化，其中上述已知方式廣泛描述于專題文獻(xiàn)以及尤其描述于在本申請中引用的參考文獻(xiàn)中，更特別地通過根據(jù)本發(fā)明的載體。
[0043]MM
[0044]在另外的方面，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞，其包含如本文所定義的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。細(xì)胞可以是任何微生物、原核或真核細(xì)胞，其適用于表達(dá)本發(fā)明的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞是大腸桿菌。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞是大腸桿菌 CLlblue MRF。
[0045]方法
[0046]在另外的方面，提供了一種用于生產(chǎn)、可選純化和可選冷凍干燥如在之前部分中所定義的多肽的方法。所述方法包括以下步驟:
[0047]i)在細(xì)胞中生產(chǎn)所述多肽，其中上述細(xì)胞包含如在前述部分中所定義的核酸構(gòu)建體，可選地，
[0048]ii)純化所述多肽，以及可選地，
[0049]iii)冷凍干燥所述純化多肽。
[0050]在優(yōu)選的實施方式中，大腸桿菌用于步驟i):用于生產(chǎn)多肽，其中利用重組技術(shù)。更優(yōu)選地，大腸桿菌XLlblueMRF用于步驟i):用于生產(chǎn)多肽，其中利用重組技術(shù)。優(yōu)選地，在步驟ii)中，填充有5mL低密度鎳螯合瓊脂糖珠(ABT珠)的IMAC和Econo-Pac層析柱(Biorad)連同重力流一起用于純化所述(6xHis標(biāo)記的重組)多肽?？梢韵鄬τ?x11冷凍干燥緩沖液透析洗脫的多肽2、4、和12小時，所述緩沖液優(yōu)選包含50mM磷酸鹽、500mM蔗糖、200mM甘露醇、0.005%聚山梨酯20，ρΗ7.4。
[0051]方法
[0052]在另外的方面，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)具有增強的裂解活性的多肽的方法，其中通過處理如在前述部分中所定義的或如通過上文描述的方法可獲得的多肽。所述處理包括取代二價金屬離子，用于增加裂解活性(相比于未經(jīng)處理的多肽)，優(yōu)選地所述方法包括以下步驟:
[0053]i )相對于包含螯合化合物的緩沖液透析(滲析)所述多肽；
[0054]ii)相對于包含二價金屬離子的緩沖液透析(滲析)所述多肽，優(yōu)選地所述二價金屬離子選自由Mn2+、Co2+、Cu2+、和Zn2+組成的組。
[0055]“螯合化合物”在本文中被定義為結(jié)合金屬離子的化合物。公知的螯合化合物是乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)。優(yōu)選地，EDTA用于本發(fā)明的方法的步驟i )。
[0056]優(yōu)選地，步驟ii)的二價金屬離子選自由Mn2+、Co2+、Cu2+組成的組，更優(yōu)選地，所述二價金屬離子選自由Mn2+和Co2+組成的組，甚至更優(yōu)選地，所述二價金屬離子是Mn2+。
[0057]我們示出，通過上文限定的任一種取代二價金屬離子致使Ply2638的裂解活性增加2-2.5倍。用如本文所定義的分光光度法來評估裂解活性。優(yōu)選地，相比于未經(jīng)處理的多肽，所述方法致使裂解活性增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍。甚至更優(yōu)選地，上述方法致使裂解活性增加至少2.5倍。優(yōu)選地，相比于未經(jīng)處理的由SEQ IDNO:1編碼的多肽，經(jīng)處理的 多肽呈現(xiàn)裂解活性增加0.7,0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、
1.5,1.6,1.7,1.8,1.9 至 2 倍。
[0058]組合物[0059]在另外的方面，提供了一種組合物，該組合物包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構(gòu)建體或多肽或載體或細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物呈現(xiàn)如本文所定義的裂解活性。更優(yōu)選地，所述組合物用作藥劑。這種藥劑優(yōu)選用于治療、預(yù)防和/或延遲傳染病。本發(fā)明還涉及一種藥物或藥用組合物。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種用于治療傳染病的藥物或藥用組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，用于治療由細(xì)菌、優(yōu)選地葡萄球菌屬的細(xì)菌、更優(yōu)選地金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌引起的傳染病。優(yōu)選地，所述傳染病是皮膚感染、乳腺炎、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、中毒性休克綜合征(TSS)、膿毒癥、敗血癥、菌血癥、或骨髓炎。優(yōu)選地，所述皮膚感染選自由丘疹、膿皰病、癤、疔瘡、蜂窩織炎、毛囊炎、癰、鱗狀皮膚綜合征和膿腫組成的組。
[0060]如本文所定義的組合物可以包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的不同核酸分子、和/或核酸構(gòu)建體和/或多肽和/或載體和/或細(xì)胞的混合物。
[0061]如本文所定義的組合物可以包含一種或多種另外的活性組分?；钚越M分優(yōu)選地在本文中被定義為顯示如本文所定義的裂解活性。優(yōu)選地，所述一種或多種另外的活性組分選自由噬菌體或抗菌素和抗生素組成的組。在本文中涵蓋的噬菌體可以是在文獻(xiàn)中已知的任何噬菌體。優(yōu)選地，本發(fā)明所包括的噬菌體屬于，但不限于，由肌噬菌體科(Myoviridae)、長尾曬菌體科(Siphoviridae)和短尾曬菌體科(Podoviridae)組成的列表中的科。本發(fā)明所包括的噬菌體還可以屬于由復(fù)層噬菌體科(Tectiviridae)、覆蓋噬菌體科(被脂病毒科，001'1:;[(30￥；[1'丨(136)、脂毛卩遼菌體科(脂毛病毒科，Lipothrixviridae)、芽生卩遼菌體科(Plasmaviridae)、古卩遼菌科(Rudiviridae)、微小紡錘形曬菌體科(福賽爾曬菌體科，F(xiàn)usel 1viridae )、絲桿曬菌體科(Inoviridae )、微小曬菌體科(Microviridae )、輕小卩遼菌體科(Leviviridae)和囊狀曬菌體科(Cystoviridae)組成的列表中的科。更優(yōu)選地，所述一種或多種活性組分包含溶葡萄球菌素和/或由溶葡萄球菌素構(gòu)成，優(yōu)選與SEQ ID NO:34具有 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素，更優(yōu)選SEQ ID NO: 34的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素。甚至更優(yōu)選地，所述一種或多種活性組分包含一種或多種不同噬菌體以及溶葡萄球菌素和/或由上述兩者組成，優(yōu)選地，一種或多種不同噬菌體以及模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素(SEQ ID N0:34)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以順序和/或同時給予如本文所定義的活性組分的組合。
[0062]如本文所定義的組合物可以進(jìn)一步包含藥用載體。上述組合物優(yōu)選用作藥物或藥劑。優(yōu)選地，藥劑用于治療傳染病。組合物可以具有液體、固體、或者半液體或半固體形式。
[0063]本發(fā)明的組合物可以用來治療感染金黃色葡萄球菌的動物(包括人類)。任何適宜的給予途徑可以用來給予所述組合物，包括，但不限于:口服、氣霧劑或用于遞送到肺的其它裝置、鼻噴入、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)、陰道、直腸、局部、腰椎穿刺、鞘內(nèi)、以及直接施用到腦和/或腦脊膜。
[0064]包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構(gòu)建體或多肽或載體或細(xì)胞的組合物，當(dāng)它降低在患者中或在所述患者的細(xì)胞中或在細(xì)胞系中或在無細(xì)胞體外系統(tǒng)中存在的葡萄球菌屬的量時，優(yōu)選是活性的、功能性的、或治療活性的，或者能夠治療、預(yù)防和/或延緩傳染病，以及優(yōu)選意味著葡萄球菌屬的初始量的99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更少仍然是可檢測的。優(yōu)選地，沒有葡萄球菌屬是可檢測的。在此段落中，短語“葡萄球菌屬的量”優(yōu)選指活的葡萄球菌屬?？梢岳眉夹g(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來檢測葡萄球菌屬，這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如免疫組織化學(xué)技術(shù)(利用葡萄球菌屬特異性抗體)、管凝固酶測試(其檢測葡萄球菌凝固酶或"游離凝固酶")、表面蛋白如凝聚因子(玻片凝固酶測試)和/或蛋白A (商用膠乳測試)的檢測?？梢岳眉夹g(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來檢測活的葡萄球菌屬，如微生物細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)和/或?qū)崟r定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(用來測定細(xì)菌mRNA)。優(yōu)選地,在組織中或者在個體或患者的細(xì)胞中，通過比較在用本發(fā)明的所述組合物或多肽進(jìn)行治療以前在所述個體或患者中存在的量，評估所述降低?？商鎿Q地，可以與所述個體或患者的組織或細(xì)胞進(jìn)行比較，其中在治療是局部的情況下上述組織或細(xì)胞還未用所述組合物或多肽加以治療。
[0065]可以將包含如本文中所識別的或通過本文描述的方法可獲得的核酸分子或核酸構(gòu)建體或多肽或載體或細(xì)胞的組合物給予患者或所述患者的細(xì)胞、組織或器官至少一周、一個月、六個月、一年或更長時間。
[0066]在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種非醫(yī)療用組合物，其呈現(xiàn)如本文所定義的結(jié)合和/或裂解活性。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種抗菌劑。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種抗菌劑，其用于溶解細(xì)菌、優(yōu)選葡萄球菌屬的細(xì)菌、更優(yōu)選金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種抗菌劑，其作為食品防腐劑或消毒劑。
[0067]
[0068]在另外的方面，本發(fā)明涉及包含由如本文所定義的第一、第二、第三和可選的第四核酸序列編碼的域的多肽的應(yīng)用，編碼上述多肽的核酸分子的應(yīng)用，包含上述核酸分子的構(gòu)建體的應(yīng)用，包含上述構(gòu)建體的載體的應(yīng)用，包含上述載體的細(xì)胞的應(yīng)用，和/或包含任何上述的組合物的應(yīng)用，優(yōu)選作為抗菌劑。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及作為抗菌劑的應(yīng)用，用于溶解細(xì)菌、優(yōu)選葡萄球菌屬的細(xì)菌、更優(yōu)選金黃色葡`萄球菌種的細(xì)菌。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及作為食品防腐劑或消毒劑的抗菌劑?？赡艿?，上述食品防腐劑或消毒劑連同其它抗菌劑一起使用。優(yōu)選地，上述食品防腐劑或消毒劑連同如本文所定義的一種或多種另外的活性組分一起使用。優(yōu)選地，所述一種多種另外的活性組分選自由如本文所定義的噬菌體或抗菌素和抗生素組成的組。
[0069]上面提到的多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體、細(xì)胞和/或組合物可以通過許多方式應(yīng)用于食品、和/或各種待消毒的物理部位，上述方式包括，但不限于，將所述多肽和/或包含本發(fā)明的多肽的細(xì)胞摻入食品，將所述多肽和/或包含本發(fā)明的多肽的細(xì)胞噴灑到食品或待消毒的物理部位上。
[0070]本發(fā)明的多肽可以分離自細(xì)胞，或可以直接應(yīng)用或給予包含本發(fā)明的所述多肽的細(xì)胞而無需所述多肽的分離。例如，可以將產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的細(xì)胞給予受試者(人或動物)或應(yīng)用于表面，其中本發(fā)明的多肽將被分泌進(jìn)入食品，分泌到表面或分泌進(jìn)入受試者的腸中。然后，本發(fā)明的多肽可以結(jié)合并可選地溶解在此環(huán)境中存在的細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選葡萄球菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌。
[0071]進(jìn)一步提供了包含由如本文所定義的第一核酸序列編碼的域的多肽的應(yīng)用、編碼上述多肽的核酸分子的應(yīng)用、包含上述核酸分子的構(gòu)建體的應(yīng)用、包含上述構(gòu)建體的載體的應(yīng)用、包含上述載體的細(xì)胞的應(yīng)用、和/或包含任何上述的組合物的應(yīng)用，優(yōu)選用于檢測細(xì)菌，更優(yōu)選用于檢測葡萄球菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體、細(xì)胞和/或組合物用于診斷應(yīng)用。可能地，所述多肽、核酸分子、構(gòu)建體、載體、細(xì)胞和/或組合物連同其它檢測劑一起使用。
[0072]通
[0073]在另外的方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過給予如前文所定義的組合物用于治療、延緩和/或預(yù)防傳染病的方法。這種方法的所有特點已在本文中加以定義。
[0074]定義
[0075]序列同一件
[0076]"序列同一性"在本文中被定義為在兩個或更多氨基酸(肽、多肽、或蛋白質(zhì))序列或兩個或更多核酸(核苷酸、多核苷酸)序列之間的關(guān)系，如通過比較序列所確定的。在本領(lǐng)域中，"同一性"還指在氨基酸或核苷酸序列(根據(jù)具體情況)之間序列相關(guān)的程度，如通過在一系列上述序列之間的匹配所確定的。通過比較一種肽或多肽的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代與第二肽或多肽的序列來確定在兩個氨基酸序列之間的"相似性"。在優(yōu)選的實施方式中，針對如本文中所識別的整個SEQ ID NO計算同一性或相似性?？梢酝ㄟ^已知方法容易地計算〃同一性〃和〃相似性〃，包括但不限于以下方法，其描述于Computational Molecular Biology, Lesk, A.Μ., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing:1nformatics and Genome Projects, Smith, D.ff., ed., AcademicPress, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jers ey,1994;Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987;and Sequence AnalysisPrimer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ；以及CariIΙο, Η., and Lipman, D., SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。
[0077]設(shè)計用來確定同一性的優(yōu)選方法以在待測試的序列之間產(chǎn)生最大匹配。用來確定同一性和相似性的方法編碼在可公開獲得的計算機程序中。用來在兩個序列之間確定同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括例如，GCG程序包(Devereux, J.，et al.，NucleicAcids Researchl2(I):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、和 FASTA (Altschul, S.F.etal.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990) )。BLAST X 程序可公開獲自 NCBI 和其它來源(BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul, S.，et al., J.Mol.Biol.215:403-410 (1990))。公知的 Smith Waterman 算法還可以用來確定同一性。
[0078]用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下各項:算法:Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)；比較矩陣:BL0SSUM62，來自 Hentikoff 和 Hentikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.89:10915-10919(1992);空隙罰分(空位罰分):12 ;以及空隙長度罰分:4?？捎糜谶@些參數(shù)的程序可公開獲得為來自Genetics Computer Group (位于Madison, WI)的〃0gap〃程序。上述參數(shù)是用于氨基酸比較的默認(rèn)參數(shù)(連同沒有對端間隙的罰分)。
[0079]用于核酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下各項:算法:Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453(1970);比較矩陣:匹配=+10，錯配=0 ;空隙罰分:50 ;空隙長度罰分:3?？色@得為Gap程序，來自Genetics Computer Group (位于Madison, Wis)。上面給出的是用于核酸比較的默認(rèn)參數(shù)。
[0080]可選地，在確定氨基酸相似性的程度時，技術(shù)人員還可以考慮所謂的〃保守〃氨基酸取代，如技術(shù)人員將清楚的。保守氨基酸取代是指具有類似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂族側(cè)鏈的氨基酸的組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、和異亮氨酸；具有脂族羥基側(cè)鏈的氨基酸的組是絲氨酸和蘇氨酸；具有包含酰胺的側(cè)鏈的氨基酸的組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的氨基酸的組是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸的組是賴氨酸、精氨酸、和組氨酸；以及具有含硫側(cè)鏈的氨基酸的組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文披露的氨基酸序列的取代變體是那些變體，其中在所披露的序列中的至少一個殘基已被除去并在其位置插入不同的殘基。優(yōu)選地，氨基酸變化是保守的。對于每種天然存在的氨基酸的優(yōu)選的保守取代是如下:Ala 對 ser ；Arg 對 Iys ；Asn 對 gin 或 his ；Asp 對 glu ；Cys 對 ser 或 ala ；Gln 對 asn ；Glu 對asp ；Gly 對 pro ；His 對 asn 或 gin ；Ile 對 Ieu 或 val ；Leu 對 ile 或 val ；Lys 對 arg、gin或 glu ；Met 對 leu 或 ile ；Phe 對 met、leu 或 tyr ；Ser 對 thr ；Thr 對 ser ；Trp 對 tyr ；Tyr對trp或phe ；以及Val對ile或leu。
[0081]核酸構(gòu)建體、轉(zhuǎn)化、表達(dá)載體、可操作地連接、表達(dá)、控制序列、多肽
[0082]構(gòu)律體
[0083]由核苷酸序列表示核酸分子。由氨基酸序列表示多肽。核酸構(gòu)建體定義為核酸分子，其分離自天然 產(chǎn)生的基因或其已被改變以包含以本來不會存在于天然界的方式被合并或并列的核酸區(qū)段。通過核苷酸序列表示核酸分子。可選地，存在于核酸構(gòu)建體中的核苷酸序列可操作地連接于一個或多個控制序列，其引導(dǎo)所述肽或多肽在細(xì)胞或在受試者中產(chǎn)生或表達(dá)。
[0084]“可操作地連接”在本文中定義為以下構(gòu)型，其中控制序列被適當(dāng)?shù)胤胖迷谙鄬τ诰幋a本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的位置，以使控制序列引導(dǎo)本發(fā)明的肽或多肽在細(xì)胞和/或受試者中的產(chǎn)生/表達(dá)。
[0085]“可操作地連接”還可以用于定義以下構(gòu)型，其中序列被適當(dāng)?shù)胤胖迷谙鄬τ诰幋a功能域的另一序列的位置，以使嵌合多肽在細(xì)胞和/或受試者中被編碼。
[0086]“表達(dá)”將理解為包括任何涉及肽或多肽的生產(chǎn)的步驟，包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
[0087]控制序列在本文中定義為包括所有以下組件，其是多肽表達(dá)所必要的或者有利于多肽的表達(dá)。在最低限度，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。可選地，由在核酸構(gòu)建體中存在的核苷酸序列表示的啟動子可操作連接于編碼如本文中所識別的肽或多肽的另一種核苷酸序列。
[0088]術(shù)語〃轉(zhuǎn)化〃是指在并入新DNA (即，細(xì)胞的外源DNA)以后，在細(xì)胞中誘導(dǎo)的永久或瞬時基因變化。當(dāng)細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞時，如在本發(fā)明中所旨在的，該術(shù)語通常是指染色體外的、自我復(fù)制的載體，其具有可選擇的抗生素耐受性。
[0089]表達(dá)載體可以是任何載體，其可以方便地進(jìn)行重組DNA程序并且可以引起編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列在細(xì)胞和/或受試者中的表達(dá)。如在本文中所使用的，術(shù)語"啟動子"是指核酸片段，其作用是控制相對于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄方向位于上游的一個或多個基因或核酸的轉(zhuǎn)錄。它關(guān)系到通過針對DNA依賴性RNA聚合酶的結(jié)合位點的存在所識別的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點、和任何其它DNA序列，包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、阻抑和激活蛋白結(jié)合位點、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接地用來調(diào)節(jié)從啟動子開始的轉(zhuǎn)錄量的任何其它序列的核苷酸。在本發(fā)明的上下文中，啟動子優(yōu)選終止于轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的核苷酸-1。
[0090]如在本文中所使用的，“多肽”是指任何肽、寡肽。多肽、基因產(chǎn)物、表達(dá)產(chǎn)物、或蛋白質(zhì)。多肽由連續(xù)氨基酸組成。術(shù)語〃多肽〃涵蓋天然存在的或合成的分子。
[0091]在本文件和其權(quán)利要求中，動詞〃包含〃和它的結(jié)合形式在其非限制性意義上用來指包括在該詞語以后的事項，但并不排除未具體提及的事項。另外，動詞“由……組成”可以由“基本上由……組成”代替，意思是產(chǎn)物或組合物或如本文所定義的核酸分子或核酸構(gòu)建體或載體或細(xì)胞的肽或多肽可以包含除具體識別的成分以外的另外成分，所述另外成分并不改變本發(fā)明的獨特特征。另外，通過不定冠詞〃一 〃或〃 一種〃提及要素并不排除存在多于一種要素的可能性，除非上下文明顯地要求，否則存在一種且僅一種要素。因此不定冠詞〃一 〃或〃 一種〃通常是指〃至少一種"。在本說明書中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0092]以下實施例僅用于說明的目的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0093]圖1 對抗金黃色葡萄球菌 SA2638/2854 細(xì)胞，Ply2638 (SEQ ID N0:21,由 SEQ IDNO:44編碼)活性依賴于內(nèi)溶素濃度的線性關(guān)系。在標(biāo)準(zhǔn)條件(PBS緩沖液，pH7.4，120mM氯化鈉)下并用光度裂解測定進(jìn)行測定。最大活性由來自S形裂解曲線的回歸擬合的第一導(dǎo)數(shù)確定，借助于SigmaPlot軟件計算。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，其由重復(fù)三次的技術(shù)實驗計
[0094]圖2 二價陽離子對Ply2638 (SEQ ID N0:21，由SEQ ID NO:44編碼)的裂解活性的影響。用EDTA處理酶，隨后通過針對包含MgCl2、CaCl2, ZnCl2, CuCl2, CoCl2、或MnSO4的MOPS緩沖液的透析取代金屬離子。針對MOPS緩沖液的Ply2638透析(滲析)(省略EDTA處理)用作參比。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，其由重復(fù)三次的技術(shù)實驗計算。
[0095]圖3 在凍干和重建以后，50nM Ply2638 (SEQ ID NO: 21，由 SEQ ID NO:44 編碼)對金黃色葡萄球菌SA2638/2854細(xì)胞的裂解活性。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用濁度降低測定來測量活性。凍干緩沖液作為對照。在冷凍干燥以后，三域(三重結(jié)構(gòu)域，triple domain)酶恢復(fù)全裂解活性。
[0096]圖4在凍干和重建(表示為凍干)以后，相比于新制備的M23_LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID N0:29，由 SEQ ID NO:48 編碼)和 Ply2638 (SEQ ID N0:21，由 SEQ IDN0:44 編碼)，50nMM23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID N0:29，由 SEQ ID N0:48 編碼)對金黃色葡萄球菌SA2638/2854細(xì)胞的裂解活性。凍干緩沖液作為對照。在標(biāo)準(zhǔn)條件下用濁度降低測定來測量活性。在冷凍干燥以后，三域酶恢復(fù)全裂解活性。
[0097]圖5 溶葡萄球菌素(LST ；SEQ ID NO:34,由 SEQ ID NO:33 編碼)和 Ply2638 衍生物(SEQ ID N0:31、30、29、21 和 24，分別由 SEQ ID NO: 11、10、48、44 和 4 編碼)依賴于濃度的相對活性。在50nM下LST的活性設(shè)定為參比。在標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C，pH7.4和120mM氯化鈉濃度)下并利用來自冷凍儲備液的金黃色葡萄球菌SA2638/2854底物細(xì)胞進(jìn)行所有測定。
[0098]圖6在各種pH值(左圖)和氯化鈉濃度(右圖)下用濁度降低測定確定的截短和(具有PlyTw域)改造Ply2638變體的相對活性。通過兩種催化結(jié)構(gòu)域的一種,酶的截短導(dǎo)致受損的活性。在堿性pH值和升高鹽濃度下，CBD (M23_Ami_SH3b_SH3b ；SEQ ID NO: 32，由SEQID NO;49編碼)的復(fù)制加速裂解。具有CHAPll域的Ply2638改造得到以下酶，其假定會攻擊在葡萄球菌屬的肽聚糖層中的三種不同的鍵。其PH最適點改變到稍酸性條件并改善抗菌活性。然而，嵌合酶的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性仍然是一個挑戰(zhàn)。在標(biāo)準(zhǔn)條件(PH7.4和120mM氯化鈉濃度)下，Ply2638的最大的溶解速度設(shè)定為參比。棒表示重復(fù)三次測定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差未示出。(CHAP_M23_Ami_SH3b=SEQ ID N0:25，由 SEQ ID NO:45 編碼；Ami_M23_Ami_SH3b=SEQ ID NO: 26，由 SEQ ID NO:46 編碼；M23_Ami_SH3b_SH3b=SEQ ID NO: 32，由 SEQ IDN0:49編碼；M23_Ami_SH3b=SEQ ID NO: 21，由 SEQ ID N0:44編碼；Ami_SH3b=SEQ ID NO: 22，由 SEQ ID N0:2 編碼；M23_SH3b=SEQ ID N0:23，由 SEQ ID N0:3 編碼)。
[0099]圖7在標(biāo)準(zhǔn)條件下，針對使用金黃色葡萄球菌SA2638/2854底物細(xì)胞，50nM四域酶(四重結(jié)構(gòu)域酶)(SEQ ID NO: 27 和 28，分別由 SEQ ID NO: 47 和 8 編碼)、Ply2638 (SEQ IDN0:21，由SEQ ID N0:44編碼)、和溶葡萄球菌素(SEQ ID N0:34，由SEQ ID N0:33編碼)的活性。凍干緩沖液作為對照。通過結(jié)合Ply2638、PlyTw、和溶葡萄球菌素的域來構(gòu)建四域酶。
實施例
[0100]材料和方法
[0101]菌株、培養(yǎng)條件、噬菌體和質(zhì)粒
[0102]大腸桿菌XLlBlueMRF和大腸桿菌Sure用于6x-His-標(biāo)記的(SEQ ID N0:43)融合蛋白的過表達(dá)。在30°C下，在LB-PE培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩種菌株，含有100 μ g/ml氨芐青霉素和30yg/ml四環(huán)素，用于質(zhì)粒選擇。噬菌體2638A裂解液作為模板，用于Ply2638A基因或其域編碼區(qū)的擴(kuò)增。CHAPTw域(SEQ ID NO: 19)由噬菌體Twort裂解液擴(kuò)增。來自噬菌體11的半胱氨酸-組氨酸依賴性酰胺酶/肽酶(CHAP)域和酰胺酶域(分別為SEQ ID N018和 17 ；Donovan, et al., 2006and2008;Navarre et al., 1999;Sass and Bierbaum2007)由包含phill自溶素基因的pet21a載體擴(kuò)增,其來自Donovan, D.M.的善意饋贈。包含成熟溶葡萄球菌素的序列(SEQ ID Ν0:33)的質(zhì)粒LT1215作為模板，用于域擴(kuò)增M23-LST (SEQID NO:15)和 CWT-LST (SEQ ID NO:13)。
[0103]pQE-30 載體(目錄號:32915，Qiagen，Hilden，德國；SEQ ID NO:50)作為克隆和表達(dá)載體，用于分別在大腸桿菌XLlBlueMRF或大腸桿菌Sure中產(chǎn)生6x_His標(biāo)記的重組融合蛋白。
[0104] DNA技術(shù)和克隆程序
[0105]按照Sambrook, Maniatis et al.(1989)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于克隆單基因和產(chǎn)生融合蛋白。高保真PCR酶混合物(Fermentas)用于PCR反應(yīng)。借助于分光光度計(NanoDropND-1000分光光度計)來確定DNA濃度。
[0106]通過將Ply2638 (SEQ ID NO:1)編碼序列 Metl - Lys486 插入 pQE30 (SEQ IDNO: 50)部位BamH1- Sail 來構(gòu)建PHP126380PHP12638-P12638 構(gòu)建體具有連續(xù)插入BamH1-Sac1- SalI 部位的相同序列。CHAPll (SEQ ID NO: 18)、Amill (SEQ ID 勵:17)和(:通?_Amill被N端引入BamHI消化的pHPL2638A。在連接反應(yīng)以前，利用蝦堿性磷酸酶(SAP，F(xiàn)ermentas)使載體去磷酸化。利用BamHI和SacI限制位點,通過用各自的插入片段替換來自 pHGFP_CBD2638A_c 載體(SEQ ID NO: 59)的 GFP 編碼區(qū)來構(gòu)建 pHM23_CBD2638 (SEQ IDN0:3)和 pHM23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638 (SEQ ID N0:49)。 pHM23_LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO:48)具有pQE_30主鏈，其具有插入BamHI和SacI中的成熟溶葡萄球菌素(SEQ ID NO: 33)編碼序列Alal-Gly 154以及Ply2638部分序列，其編碼在SacI和SalI位點處的 Leul38-Lys486。pHM23-LST_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID NO: 11)具有插入 BamHI和SacI中的成熟溶葡萄球菌素(SEQ ID NO: 33)序列Alal - Gly 154以及插入pQE30的SacI和SalI位點的Alal-Lys246。以相同的方式來構(gòu)建pHLST-LST (SEQ ID N0:10)，其中在BamH1- SacI和Sac1- Sail位點重復(fù)地具有Alal - Lys246。在編碼四域構(gòu)建體pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CBD2638 (SEQ ID NO:47)和 pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT_LST (SEQID N0:8)的質(zhì)粒中，通過剪接重疊延伸PCR (SOE)和插入pQE30BamHI和SalI位點，來直接融合域。在兩種構(gòu)建體中，借助于生物信息學(xué)(未發(fā)表的數(shù)據(jù))來確定單個域的邊緣區(qū)(boarder region)(CHAPTw,SEQ ID NO:19:Metl -1lel40,Ami2638, SEQ ID NO:16:SEQ IDN0:1 的 Lysl41-Gly358，CBD2638，SEQ ID NO: 12:SEQ ID NO:1 的 Trp393-Lys486，M23_LST，SEQ ID NO: 15:SEQ ID NO: 33 的 Alal - Glyl54，CWT-LST，SEQ ID NO: 13:SEQ ID NO: 33 的Trp155 - Lys246)。將具有重復(fù)順序的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌Sure菌株中，并將所有其它質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌XLlBlueMRF中。
[0107]重組融合蛋白的表達(dá)和純化
[0108]基本上如之前由其他人(Loessneret al., 1996, Schmelcher et al.，2010)描述的，進(jìn)行蛋白過表達(dá)和部分純化。簡單地說，在250ml改良LB培養(yǎng)基(15g/l胰蛋白，8g/I酵母提取物，5g/l NaCl, ρΗ7.8)中生長攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌，直到在600nm (0D600nm)處0.4至0.6的光密度并用ImMIPTG加以誘導(dǎo)。在30°C下進(jìn)一步溫育細(xì)胞4小時，或在20°C下溫育18小時，冷卻至4°C，然后通過離心作用收獲。將細(xì)胞顆粒懸浮于5ml固定緩沖液(50mM NaH2PO4, 500mM NaCl，5mM咪唑，0.1%聚山梨酯20，pH7.4)中。借助于通過在1200psi 下操作的弗氏壓力細(xì)胞破碎器(French Pressure Cell Press) (1200psi, SLMAminco, Urbana, IL, U.S.)的雙通道來釋放包含可溶性重組蛋白的細(xì)胞溶質(zhì)大腸桿菌內(nèi)含物。其它下游處理步驟包括通過離心作用除去不溶性細(xì)胞碎片，過濾滅菌(0.2μπι PES膜，Millipore)，以及固定金屬親和層析(IMAC)純化，其中利用填充有低密度N1-NTA超流樹脂(Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland)的 MicroBiospinCBio-Rad, Hercules, CA, U.S.)柱。用5-10柱容積的固定緩沖液對N1-NTA固定蛋白質(zhì)進(jìn)行柱上重力流洗滌。然后用洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4, 500mM NaCl，125mM咪唑，0.1%聚山梨酯20，pH7.4)洗脫蛋白部分，并針對兩種變化的透析緩沖液(50mM NaH2PO4, IOOmMNaCl, 0.1%聚山梨酯20，pH7.4)加以透析。用NanoDrop ND-1000分光光度計來確定蛋白質(zhì)濃度，在280nm處校正吸收系數(shù)，如借助于Vector NTI軟件(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.)由一級氨基酸序列計算,并通過SDS-PAGE來估計純度。在與50%甘油混合的情況下，將等分部分存儲于_20°C。
[0109]重組蛋白的凍干
[0110]針對3次變化的300ml凍干緩沖液(50mM磷酸鹽或Tris，500mM蔗糖，200mM甘露醇，pH7.4)等分部分透析(滲析)IMAC純化蛋白，并在液氮的氣相中冷凍。在-40°C和75毫托的真空下，進(jìn)行冷凍干燥60分鐘，接著在5小時期間提高溫度至-10°C，然后在-10°C和在相同真空水平下保持另外60分鐘。作為最后的步驟，在10小時期間，將溫度提高至25°C。在裂解測定中，在測試以前，通過添加水重建樣品。
[0111]細(xì)胞壁結(jié)合測定
[0112]作為用來確定CBD引導(dǎo)GFP融合于細(xì)菌表面和介導(dǎo)緊密結(jié)合于細(xì)胞壁配體的能力的標(biāo)準(zhǔn)測定，使用了以下條件:通過離心作用收獲來自晚對數(shù)期的細(xì)菌，優(yōu)選金黃色葡萄球菌 BB255，再懸浮于 1/10 容積的 PBS-T(50mM NaH2PO4,120mM NaCl [ρΗ8.0]，0.01% 聚山梨酯20)中，然后存儲在冰上。將GFP-CBD蛋白，優(yōu)選SEQ ID Ν0:64，由SEQ ID Ν0:60編碼，在相同的緩沖液中稀釋至400ηΜ的濃度(2x GFP-CBD)，并同樣存儲在冰上。在1.5ml微型離心杯中，混合100 μ I細(xì)胞和100 μ I的2xGFP-CBD，并在室溫下溫育5分鐘。然后通過在微型離心中的離心作用(16000g，60s)從上清液除去細(xì)胞。丟棄上清液并用500 μ I的PBS-T緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。對于熒光顯微鏡檢術(shù)，最后將顆粒再懸浮于50 μ I緩沖液中。對于熒光計測定，最后將顆粒再懸浮于200 μ I的PBS-T中并轉(zhuǎn)移到微量板孔中?？梢岳枚鄻?biāo)記計數(shù)裝置(Victor3, Perkin Elmer, Massachusetts, U.S.)并借助于無菌的未經(jīng)處理的黑色96-孔聚苯乙烯微量板(Nunc, Roskilde, Denmark)進(jìn)行定量突光測定。作為陰性對照，可以使用GFP。
[0113]定量熒光測定
[0114]通過用7.5yg GFP-CBDS2638 融合蛋白(SEQ ID NO: 64，由 SEQ ID NO: 60 編碼)溫育來自Iml容積的設(shè)定為(?_Μ1+/-0.05 (約4χ109個細(xì)胞)的細(xì)胞研究pH和鹽對CBD2638與金黃色葡萄球菌BB255細(xì)胞表面配體相互作用的依賴性。這種細(xì)胞蛋白比接近飽和點(如在前述實驗中確定的)并使得能夠檢測結(jié)合效率的變化。利用檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5至
6.5)和磷酸鹽緩沖液(pH6至9)測試不同的pH值。在使用在pH緩沖液中的GFP-CBD2638蛋白溫育以后，用相應(yīng)的PH緩沖液洗滌細(xì)胞，接著是標(biāo)準(zhǔn)PBS-T (pH8)洗滌。最后，將細(xì)胞調(diào)節(jié)到OD595nm=0.3，以借助于Victor3多標(biāo)記計數(shù)器檢測來自其200 μ I懸浮液的熒光。利用借助于增加氯化鈉濃度(IOmM NaH2PO4,0 -1OOOmM NaCl, 0.1%聚山梨酯20，ρΗ6)所制備的緩沖液進(jìn)行類似的實驗。
[0115]通過記錄洗滌和熱滅活細(xì)胞(之前用過量GFP-CBD2638蛋白溫育)的相對熒光單位(RFU)來測試具有改變的細(xì)胞表面特性的葡萄球菌屬菌株的CBD結(jié)合能力的量化。利用在多標(biāo)記計數(shù)裝置中的適當(dāng)?shù)臑V光片組合，來測量相同容積(200 μ I)的GFP-CBD2638標(biāo)記細(xì)胞(調(diào)節(jié)到OD595nm=0.3)的熒光。以相同方式，對金黃色葡萄球菌ΒΒ255細(xì)胞和SDS處理的細(xì)胞進(jìn)行 GFP-CBD2638 (SEQ ID Ν0:64，由 SEQ ID Ν0:60 編碼)、GFP_CBD2638_CBD2638 (SEQID N065 和 / 或 66，分別由 SEQ ID NO: 61 和 62 編碼)、和 GFP-CBD2638-CBD2638-CBD2638(SEQ ID N0:67，由SEQ ID NO:63編碼)的吸收水平的比較和量化。
[0116]裂解測定
[0117]使用于裂解活性測定的底物細(xì)胞生長至在600nm(0D600)處0.4的光密度，用PBST(pH7.4)洗滌兩次，并再懸浮于包含15%甘油的PBS緩沖液(pH7.4)中，同時將其濃縮100倍。在_20°C下存儲細(xì)胞。為了進(jìn)一步用于結(jié)合或裂解活性測定，融化細(xì)胞，用PBS(pH7.4)洗滌，并稀釋至1±0.05的0D600。在標(biāo)準(zhǔn)裂解活性測定中，將蛋白樣品稀釋至等摩爾量并分布于透明的96-孔組織培養(yǎng)試驗板(SPL life sciences, Pocheon, Korea)。加入底物細(xì)胞至最終體積并在37°C下記錄在595nm (0D595nm)處的光密度降低約I小時。
[0118]在裂解測定中，針對來自冷凍儲備液的噬菌體26 38A繁殖株金黃色葡萄球菌SA2638/2854，測試Ply2638的改造和檢測構(gòu)建體的裂解活性。我們測試了在各種緩沖液條件下的活性。利用檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(25mM檸檬酸鹽、25mM磷酸鹽、120mM NaCl,pH4.6-6.6)和Tris/磷酸鹽緩沖液(25mM Tris、25mM磷酸鹽、120mM NaCl)，測試了增量為
0.4的從4.6至9的pH值。在0至1000mM氯化鈉(在IOmM磷酸鹽緩沖液中，pH7.4)的鹽濃度下，測試了 Ply2638A衍生物的活性。在裂解測定中，在其施加之前，用MQ將Ply2638A衍生物稀釋至10 PM的最終濃度。此處，利用多通道移液管，將4 ill的IOiiM Ply2638A衍生物施加于196 ill基底細(xì)胞懸浮液，從而得到200nM蛋白的測定濃度。基底細(xì)胞懸浮液制備自冷凍儲備液:用PH或鹽緩沖液將其稀釋并用分光光度法(Libra S22, Biochrom)將其標(biāo)準(zhǔn)化至1±0.05的初始0D600。在I小時期間，利用Victor31420多標(biāo)記分析儀(MultilabelCounter instrument) (Perkin Elmer)來測量在 595nm (0D595)處光密度的降低。在每個單讀數(shù)以后，劇烈搖晃平板I秒(雙軌道，0.1mm直徑)。作為陽性對照，使用N端6xHis標(biāo)記的溶葡萄球菌素(HLST),市售溶葡萄球菌素(重組,源自大腸桿菌，Sigma)。作為陰性對照，使用MilliQ水。
[0119]二價金屬離子對Ply2638的活性的影響
[0120]針對包含EDTA的緩沖液(50mM MOPS、IOOmM氯化鈉、0.005%聚山梨酯20、IOmMEDTA)透析部分純化的Ply2638 (SEQ ID N0:21) 2小時，接著針對包含相應(yīng)的二價金屬離子的緩沖液(50mM MOPS，IOOmM氯化鈉，0.005%聚山梨酯20，以及分別IOmM CaCl2UOmMMgCl2UmM CoCl2UmM CuCl2UmM MnSO4、或ImM ZnCl2)進(jìn)行透析。在用于標(biāo)準(zhǔn)裂解測定中之前，SDS處理和EDTA洗滌用作底物的細(xì)胞。
[0121]表 L SEQ ID NO 識別
[0122]
【權(quán)利要求】
1.一種包含第一核苷酸序列的核酸分子，其中，所述核苷酸序列與SEQ ID N0:12具有至少80%的序列同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中，所述第一核苷酸序列編碼細(xì)胞壁結(jié)合域，所述細(xì)胞壁結(jié)合域結(jié)合葡萄球菌屬的肽聚糖細(xì)胞壁。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和/或2所述的核酸分子，其中，所述第一核苷酸序列源于金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 2638a內(nèi)溶素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子與SEQID NO:1具有至少80%的序列同一性，或者其中所述核酸分子進(jìn)一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子進(jìn)一步包含編碼裂解域的異源核苷酸序列，其中所述裂解域是第二和第三核苷酸序列，以及其中所述第二核苷酸序列編碼M23內(nèi)肽酶域并且所述第三核苷酸序列編碼酰胺酶域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸分子，其中，所述第二和第三核苷酸序列源于編碼酶的基團(tuán)，所述酶選自由金黃色葡萄球菌噬菌體Φ26383內(nèi)溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 11內(nèi)溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體?Twort內(nèi)溶素、和模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸分子，其中，所述第二核苷酸序列與SEQID: 14或15具有至少80%的序列同一性以及所述第三核苷酸序列與SEQ ID NO: 16或17具有至少80%的序列同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分子，其中，所述核苷酸分子與SEQID NO:9具有至少80%的序列同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項所述的核酸分子，進(jìn)一步包含編碼CHAP(半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶)域的第四核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中，所述第四核苷酸序列源于金黃色葡萄球菌噬菌體Φ11或金黃色葡萄球菌噬菌體OTwort內(nèi)溶素。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分子，其中，所述第四核苷酸序列與SEQID NO: 18或SEQ ID NO: 19具有至少80%的序列同一性。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項所述的核酸分子，編碼多肽，相比于由SEQID NO:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體02638a內(nèi)溶素，所述多肽具有相同或增加的裂解活性和/或相同或降低的PH最適點。
13.一種多肽，由如在權(quán)利要求1-12中任一項所識別的核酸分子編碼。
14.一種核酸構(gòu)建體,包含如在權(quán)利要求1-12中任一項所識別的核酸分子。
15.一種表達(dá)載體，包含如在權(quán)利要求14中所限定的核酸構(gòu)建體，可操作地連接于一個或多個控制序列，所述一個或多個控制序列引導(dǎo)所編碼的多肽在細(xì)胞、受試者、或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)生或表達(dá)。
16.一種細(xì)胞，包含如在權(quán)利要求14中所識別的核酸構(gòu)建體或如在權(quán)利要求15中所識別的表達(dá)載體，所述細(xì)胞是微生物、原核或真核細(xì)胞。
17.一種用于生產(chǎn)、可選地純化和可選地冷凍干燥如在權(quán)利要求13中所限定的多肽的方法，所述方法包括以下步驟:i)在如在權(quán)利要求16中所識別的細(xì)胞中產(chǎn)生所述多肽，包括如在權(quán)利要求14中所限定的核酸構(gòu)建體，可選地， ii)純化所述多肽，以及可選地， iii)冷凍干燥純化的所述多肽。
18.一種用于生產(chǎn)具有增強的裂解活性的多肽的方法，通過處理如在權(quán)利要求13中所識別的多肽和/或通過權(quán)利要求17所述的方法可獲得的多肽，其中，所述方法包括以下步驟: i)針對包含螯合化合物的緩沖液透析所述多肽， ii)針對包含二價金屬離子的緩沖液透析所述多肽，優(yōu)選地所述二價金屬離子選自由Co2+、Cu2+、Mn2+、和 Zn2+ 組成的組。
19.一種組合物，包含如在權(quán)利要求1-12中任一項所識別的核酸分子、如在權(quán)利要求13中所識別的和/或通過如在權(quán)利要求17和/或18中所確定的方法可獲得的多肽、和/或如在權(quán)利要求14中所識別的核酸構(gòu)建體、和/或如在權(quán)利要求15中所識別的載體、和/或如在權(quán)利要求16中所識別的細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，包含一種或多種另外的活性組分，優(yōu)先選自由噬菌體和抗生素組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要 求19和/或20所述的組合物，用作藥劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，用作治療傳染病的藥劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求13和/或通過如在權(quán)利要求17和/或18中所確定的方法可獲得的多肽、根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸構(gòu)建體、如在權(quán)利要求15中識別的載體、如在權(quán)利要求16中所識別的細(xì)胞、和/或根據(jù)權(quán)利要求19和/或20所述的組合物作為抗菌劑、優(yōu)選作為食品添加劑或消毒劑的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸分子，由上述核酸分子編碼的多肽，核酸構(gòu)建體，和/或包含上述核酸構(gòu)建體的載體和/或細(xì)胞，或者包含上述多肽、核酸分子、核酸、載體和/或細(xì)胞中的任一種的組合物用于檢測葡萄球菌、優(yōu)選在診斷應(yīng)用中的應(yīng)用。
25.一種用于治療、延緩和/或預(yù)防傳染病的方法，通過給予如在權(quán)利要求19和/或20中所限定的組合物。
【文檔編號】C12N9/36GK103703127SQ201180072127
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月4日
【發(fā)明者】馬丁·約翰內(nèi)斯·勒斯納, 弗里茨·艾興澤埃爾 申請人:邁克瑞歐斯人體健康有限公司