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一種Exendin9-39基因及其多肽的制備方法

文檔序號:411590閱讀:604來源:國知局
專利名稱:一種Exendin9-39基因及其多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,特別是涉及ー種EXendin9-39基因及其多肽的制備方法。
背景技術(shù)
Exendin9-39基因是含有31個氨基酸殘基的小肽,它是由Exendin_4的39個氨基酸殘基缺失N端的前8個氨基酸殘基后得到的。Exendin-4發(fā)現(xiàn)與美國毒蜥蜴分泌的毒液中。其作用主要是動物體內(nèi)的類胰高血糖素樣肽-I (glucagon-like peptide-1, GLP-I) 受體的激活劑,促進GLP-I與受體結(jié)合,誘導cAMP的產(chǎn)生,從而發(fā)揮出類似GLP-I的作用増加葡萄糖依賴性的胰島素分泌,抑制胰高血糖素的分泌,加速葡萄糖清除,延緩胃排空和誘發(fā)飽腹感、抑制食欲;還可以改善外周胰島素抵抗等。而缺少8個氨基酸的eXendin9-39卻是GLP-I受體的抑制劑,其作用也與exendin-4完全相反降低胰島素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、增加食欲等(G0ke R et al. Exendin-4is a high potency agonistand truncated exendin-(9-39)-amide an antagonist at the glucagon-like peptideI-(7-36)-amide receptor of insulin-secreting beta-cells. J Biol Chem. 1993Sep15,268 (26):19650-5. Schepp W et al. Exendin_4and exendin-(9-39)NH2: agonist andantagonist, respectively, at the rat parietal cell receptor for glucagon-likepeptide-1-(7-36)NH2. Eur J Pharmacol. 19940ct 14, 269(2):183-91.Thorens B etal. Cloning and functional expression of the human islet GLP-lreceptor.Demonstration that exendin_4is an agonist andexendin-(9-39)an antagonist of thereceptor. Diabetes. 1993Nov, 42 (11):1678-82.)早在1999年,Karim Meeran等用大鼠的實驗證明,exendin9_39能夠提高動物食欲,并能增加動物的體重。姆天注射30nmoI的exendin9_39于大鼠的側(cè)腦室中,連續(xù)注射3天,與注射生理鹽水的對照組相比,實驗組大鼠平均每天的飼料消耗是 21. 9±0. 5vs. 19. 5±0. 4g Ρ〈0· 001,最終體重增加 7±2vs. 2± lg;P〈0. 02 (MeeranK, et al. Repeated 丄ntracerebroventricular Administration of Glucagon-LikePeptide-1-(7-36)Amide or Exendin-(9-39)Alters Body Weight in the Rat. Endocrinology. 1999Jan;140(1):244-50.)。目前,exendin9_39主要采用化學合成,成本高(對原料氨基酸及儀器設(shè)備要求極高)、產(chǎn)量少。利用基因工程生產(chǎn)eXendin9-39,不僅可以實現(xiàn)エ業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)、有效地降低生產(chǎn)成本,而且終產(chǎn)品污染各種有害化合物的機會績效,產(chǎn)品更加安全。但關(guān)于exendin9-39的原核表達和提取純化尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種Exendin9-39基因用于原核表達生產(chǎn)Exendin9_39多肽。
本發(fā)明另一目的是提供制備Exendin9_39多肽的方法。根據(jù)遺傳密碼表,并考慮到大腸桿菌密碼子的偏愛性,進行選擇性優(yōu)化,設(shè)計推導出exendin9_39基因的原核表達編碼序列如SEQ ID NO. I所示。Exendin9_39基因的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。exendin-4失去N端的前8個氨基酸后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。(Chen YE, Drucker DJ. Tissue-specific expression of unique mRNAs that encodeproglucagon-derived peptides or exendin 4in the lizard.J Biol Chem. 1997Feb14; 272 (7) :4108-15.)相比之下,本發(fā)明設(shè)計的exendin9_39的核苷酸序列與exendin-4失去N端的前8個氨基酸后的核苷酸序列顯著不同,二者的同源性為75%。其中,所述Exendin9-39基因通過基因克隆可得到重組載體。其中,所述Exendin9-39基因或所述重組載體可導入宿主細胞。其中,所述Exendin9_39基因可應用于制備Exendin9_39多肽。將人工設(shè)計好的exendin9_39基因序列(攜帶BamH I和Hind III酶切位點)進行人工合成,插入到原核表達載體pET-28b (+)中,構(gòu)建高效原核表達載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21 (DE3-plyss)中,通過誘導表達,獲得表達產(chǎn)物并提取純化。本發(fā)明所述Exendin9_39多肽的制備方法,包括以下步驟I)用Exendin9_39基因構(gòu)建表達載體;2)將表達載體導入宿主菌中,篩選得到表達Exendin9_39多肽的工程菌;3)培養(yǎng)所述工程菌,并誘導Exendin9_39多肽的表達。其中,所述表達載體為原核表達載體。其中,所述宿主菌為大腸桿菌。其中,所述Exendin9-39多肽利用組氨酸標簽進行親和層析純化,可得到目的蛋白。所述exendin9_39基因可應用于制備動物增肥產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果I)本發(fā)明利用大腸桿菌的密碼子的偏愛性,人工合成了 exendin9_39的核苷酸序列,并構(gòu)建成原核表達載體,進行原核表達,比人工合成價廉、方便,更加適用于動物生產(chǎn)領(lǐng)域,可顯著降低應用成本。2)本發(fā)明的eXendin9-39多肽能提高動物的食欲、抑制胰島素的分泌,可用于毛皮動物增肥。3)本發(fā)明的exendin9_39多肽用于水紹、狐貍等毛皮動物,僅利用動物的毛皮,動物尸體進行銷毀,或用于生產(chǎn)エ業(yè)用油,不存在生物安全的問題。


圖 I 為 Exendin9-39 多肽 Tricine-SDS-PAGE 電泳圖,其中 I 泳道Marker,2、3、4泳道為純化后的樣品。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。pET_28b ( + )表達載體購自Novagen公司;BL21 (DE3)pLysS宿主菌購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;基因序列由上海生エ生物工程公司合成。DH5a感受態(tài)細菌購自天根生物技術(shù)有限公司。實施例I人工設(shè)計合成exendin9_39的核苷酸序列根據(jù)已發(fā)表的exendin-4的核苷酸序列和大腸桿菌的密碼子的偏愛性特點,人エ設(shè)計合成eXendin9-39的核苷酸序列。完整的表達框序列如SEQ ID NO. I所示。在exendin9-39基因N端加上BamH I酶切位點ggatcc和C端加上Hind III酶切位點aagctt。加入酶切位點的序列如下GGATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCTT實施例2構(gòu)建原核表達載體
將合成的核苷酸序列經(jīng)BamH I和Hindm酶切并回收,同時將空載體pET-28b( + )也用BamH I和Hind III酶切,回收大片段,再按摩爾比(I :5)加入回收的合成序列,同時添加T4連接酶,16°C連接4小時以上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌,鋪氨芐青霉素平板,37°C過夜培養(yǎng)后,挑選單菌落進行篩選,鑒定大小和方向,最后測序確定所得質(zhì)粒為含有exendin9-39基因的原核表達載體。命名為pET_EX9_39。測序結(jié)果如下GATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCT證實插入序列為人工合成的eXendin9-39的核苷酸序列,所得質(zhì)粒正確。實施例3exendin9_39的原核表達將上述pET-EX9-39轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS菌中取I μ I質(zhì)粒DNA加入到200 μ I冰浴融化的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a中,繼續(xù)冰浴40分鐘,42°C熱沖擊120秒,迅速取出返回到冰水浴中10分鐘,然后加入800 μ I的LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)I小時,取100 μ I鋪氨芐青霉素平板進行篩選,挑單菌落加入到IOml的含工作濃度的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,然后取過夜培養(yǎng)物,按1%體積接種到500ml LB培養(yǎng)基中,待0D600=0. 5-0. 7左右吋,加入工作濃度為lmmol/L的IPTG誘導,約5_7小時后收菌,提取純化。實施例4exendin9_39多肽的純化及鑒定誘導后收集菌體,利用超聲處理,破壞菌壁,可得粗制品,然后利用組氨酸標簽進行Ni+-NTA親和層析柱(北京慧德易科技有限責任公司,BIO-RAD產(chǎn)品;Ni+_NTA agarose,QIAGEN公司產(chǎn)品)純化,得到目的蛋白,經(jīng)Tricine-SDS-PAGE得到單一條帶。電泳結(jié)果如圖I所示。得到的目的蛋白約占菌體總蛋白的28%,純化后的蛋白純度達到93%。實施例5exendin9_39多肽生物活性測定取20只健康成年Wistar大鼠(10周齡),公母各半,實驗組和對照組各10只。姆天注射30nmol的exendin9_39于實驗組大鼠的側(cè)腦室中,連續(xù)注射3天,實驗組大鼠與注射生理鹽水的對照組大鼠相比,平均每天的飼料消耗是22±0. 5vs. 18±0. 4g(P〈0. 001),最終體重増加 8±2vs. 3±lg (P〈0. 02)。
權(quán)利要求
1.Exendin9-39基因,其具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求I所述基因的重組載體。
3.含有權(quán)利要求I所述基因或權(quán)利要求2所述重組載體的宿主細胞。
4.權(quán)利要求I所述基因在制備EXendin9-39多肽中的應用。
5.權(quán)利要求I所述基因在制備動物增肥產(chǎn)品中的應用。
6.一種制備Exendin9-39多肽的方法,包括以下步驟1)用權(quán)利要求I所述的基因構(gòu)建表達載體;2)將表達載體導入宿主菌中,篩選得到表達Exendin9-39多肽的工程菌;3)培養(yǎng)所述工程菌,并誘導Exendin9-39多肽的表達。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述表達載體為原核表達載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述宿主菌為大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,對所述Exendin9-39多肽進行分離純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Exendin9-39基因及其多肽的制備方法。所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的exendin9-39多肽可用于制備毛皮動物增肥產(chǎn)品。采用本發(fā)明方法,使Exendin9-39多肽在原核細胞中表達,比人工合成價廉、方便,更加適用于動物生產(chǎn)領(lǐng)域,可顯著降低應用成本。
文檔編號C12N15/63GK102703459SQ20121021077
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者劉維全, 王吉貴 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學
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