專利名稱：一種多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，是分子生物學(xué)研究的物質(zhì)，在醫(yī)藥領(lǐng)域的具體應(yīng)用，即多肽，尤其是涉及一種抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族(Serum andGlucocorticoid Induced Kinase family)的酶活性的多妝。
背景技術(shù)：
目前，以多肽為主的生物藥物在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出迅速推廣的態(tài)勢(shì)。多肽類生物藥物藥效顯著，并能夠治療許多化合物類藥品無(wú)法見(jiàn)效的遺傳類疾病。血清糖皮質(zhì)激素激酶家族(Serumand Glucocorticoid Induced Kinase family)是一種能夠?qū)Χ喾N激素和類激素分子產(chǎn)生快速反應(yīng)的酶蛋白家族。它主要包括三種已知激酶，即血清糖皮質(zhì)激素激酶甲(Serum and glucocorticoid inducible kinase I, SGK1)、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙(Serum and glucocorticoid inducible kinase 2, SGK2)和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙(Serum and glucocorticoid inducible kinase 3, SGK3),及它們的異構(gòu)體。它們?cè)诩?xì)胞受體接觸到相關(guān)激素或類激素物質(zhì)后大量表達(dá)，它的活性在體內(nèi)激素調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用。類激素物質(zhì)在農(nóng)藥，化肥和食品添加劑等化工產(chǎn)品中廣泛存在。這些類激素物質(zhì)通過(guò)食物，皮膚等渠道進(jìn)入人體，造成多種人體應(yīng)激性反應(yīng)。長(zhǎng)期攝入含有較高激素或類激素物質(zhì)的食物，會(huì)造成人體激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，并導(dǎo)致多種相關(guān)的疾病。同時(shí)，由于細(xì)胞老化和內(nèi)分泌紊亂等原因所造成的內(nèi)生性激素水平失常也會(huì)形成多種相關(guān)的疾病。血清糖皮質(zhì)激素激酶家族是類激素物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的刺激過(guò)程中的重要信號(hào)傳導(dǎo)酶。它直接參與多種激素與類激素物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程。對(duì)血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的抑制性調(diào)節(jié)能夠有效緩解上述激素調(diào)節(jié)紊亂對(duì)人體健康造成的危害，是治療相關(guān)疾病的潛在優(yōu)秀藥物。活性多肽，能防治血栓，高血壓和高血脂，還能延緩衰老，提高肌體對(duì)腫瘤形成(Neoplasia)的免疫能力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的多肽。多肽用作藥物載體，既可以用作藥物載體的修飾劑，也可以作為藥物載體的主要組成部分。多肽藥物已引起我國(guó)的高度重視，我國(guó)制定的“十五”生物醫(yī)藥研究的重點(diǎn)方向之一就包括多肽藥物。在未來(lái)將會(huì)有大量的多肽藥物和試劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)，部分將被批準(zhǔn)生產(chǎn)銷售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種多肽，能夠在細(xì)胞中抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族(Serum and Glucocorticoid Induced Kinase family)的酶活性，該多妝具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，在人體細(xì)胞對(duì)血清糖皮質(zhì)激素及其類似物，以及性激素及其類似物反應(yīng)紊亂的情況下，具有良好的調(diào)節(jié)作用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是提供一種多肽，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的多肽通過(guò)高特異性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制在細(xì)胞中抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的PepSeq-I所示的氨基酸序列是通過(guò)脫氧核糖核酸在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外編碼翻譯表達(dá)獲得，或通過(guò)氨基酸直接合成獲得。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的編碼翻譯表達(dá)PepSeq-I的脫氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的血清糖皮質(zhì)激素激酶家族，包括血清糖皮質(zhì)激素激酶甲、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙，及血清糖皮質(zhì)激素激酶甲、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙的異構(gòu)體。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的細(xì)胞為人體細(xì)胞，包括人體的胚胎細(xì)胞。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的抑制為降低酶對(duì)下游靶蛋白進(jìn)行生物催化反應(yīng)的效率和能力。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種多肽，與現(xiàn)有技術(shù)相比該多肽是第一個(gè)能夠有效抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性的抑制劑。本發(fā)明的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列，能夠通過(guò)高特異性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，顯著降低血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性，從而增強(qiáng)人體細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素型化合物以及性激素類化合物的耐受性，該多肽具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，在人體細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素及其類似物，以及性激素及其類似物反應(yīng)紊亂的情況下，具有良好的調(diào)節(jié)作用，可以作為治療攝入性激素紊亂和內(nèi)分泌性激素紊亂的潛在特效藥物，對(duì)阿爾茨海默病、激素紊亂造成的皮疹、糖尿病以及其他由激素紊亂導(dǎo)致的疾病有潛在的治療作用。


圖I是本發(fā)明中pcDNA3. I載體的結(jié)構(gòu)示意 圖2是本發(fā)明中P印Seq-I對(duì)SGKl催化活性的抑制水平；
圖3是本發(fā)明中P印Seq-I存在下SGKl對(duì)底物蛋白ENaC的催化活性；
圖4是本發(fā)明中Kinase-Glo激酶發(fā)光檢測(cè)激酶的活性效果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。本發(fā)明提供了一種多肽，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列，所述的PepSeq-I 所不的氨基酸序列為 N，-Gly Met Arg Ser Arg Ser His Ser Phe Thr Gly ThrSer-C'，所述的多肽是通過(guò)高特異性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制在細(xì)胞中抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性。其中，PepSeq-I所示的氨基酸序列是通過(guò)脫氧核糖核酸在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外編碼翻譯表達(dá)獲得，或通過(guò)氨基酸直接合成獲得。該脫氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列，所述的 DNASeq-I 所不的序列為 5’-ggcatgagat cgaggtctca cagtttcact ggaacgtccagcggc-3'。
上述，細(xì)胞為人體細(xì)胞，包括人體的胚胎細(xì)胞；抑制為降低酶對(duì)下游靶蛋白進(jìn)行生物催化反應(yīng)的效率和能力。本發(fā)明中的血清糖皮質(zhì)激素激酶家族，包括血清糖皮質(zhì)激素激酶甲(SGKl)、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙(SGK2)和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙(SGK3)，及其異構(gòu)體。血清糖皮質(zhì)激素激酶甲(SGKl)的序列為
I aagtggggtt cataacagaa cagggatagc cgtctctggc tcgtgctctc atgtcatctc61 agagttccag cttatcagag gcatgtagca gggaggctta ttccagccat aactgggctc121 tacctccagc ctccagaagt aatccccaac ctgcatatcc ttgggcaacc cgaagaatga181 aagaagaagc tataaaaccc cctttgaaag ctttcatgaa gcagaggagg atgggtctga241 acgactttat tcagaagatt gccaataact cctatgcatg caaacaccct gaagttcagt301 ccatcttgaa gatctcccaa cctcaggagc ctgagcttat gaatgccaac ccttctcctc361 caccaagtcc ttctcagcaa atcaaccttg gcccgtcgtc caatcctcat gctaaaccat421 ctgactttca cttcttgaaa gtgatcggaa agggcagttt tggaaaggtt cttctagcaa481 gacacaaggc agaagaagtg ttctatgcag tcaaagtttt acagaagaaa gcaatcctga541 aaaagaaaga ggagaagcat attatgtcgg agcggaatgt tctgttgaag aatgtgaagc601 accctttcct ggtgggcctt cacttctctt tccagactgc tgacaaattg tactttgtcc661 tagactacat taatggtgga gagttgttct accatctcca gagggaacgc tgcttcctgg721 aaccacgggc tcgtttctat gctgctgaaa tagccagtgc cttgggctac ctgcattcac781 tgaacatcgt ttatagagac ttaaaaccag agaatatttt gctagattca cagggacaca841 ttgtccttac tgacttcgga ctctgcaagg agaacattga acacaacagc acaacatcca901 ccttctgtgg cacgccggag tatctcgcac ctgaggtgct tcataagcag ccttatgaca961 ggactgtgga ctggtggtgc ctgggagctg tcttgtatga gatgctgtat ggcctgccgc1021 ctttttatag ccgaaacaca gctgaaatgt acgacaacat tctgaacaag cctctccagc1081 tgaaaccaaa tattacaaat tccgcaagac acctcctgga gggcctcctg cagaaggaca1141 ggacaaagcg gctcggggcc aaggatgact tcatggagat taagagtcat gtcttcttct1201 ccttaattaa ctgggatgat ctcattaata agaagattac tccccctttt aacccaaatg1261 tgagtgggcc caacgaccta cggcactttg accccgagtt taccgaagag cctgtcccca1321 actccattgg caagtcccct gacagcgtcc tcgtcacagc cagcgtcaag gaagctgccg1381 aggctttcct aggcttttcc tatgcgcctc ccacggactc tttcctctga accctgttag1441 ggcttggttt taaaggattt tatgtgtgtt tccgaatgtt ttagttagcc ttttggtgga1501 gccgccagct gacaggacat cttacaagag aatttgcaca tctctggaag cttagcaatc1561 ttattgcaca ctgttcgctg gaagcttttt gaagagcaca ttctcctcag tgagctcatg1621 aggttttcat ttttattctt ccttccaacg tggtgctatc tctgaaacga gcgttagagt1681 gccgccttag acggaggcag gagtttcgtt agaaagcgga cgctgttcta aaaaaggtct1741 cctgcagatc tgtctgggct gtgatgacga atattatgaa atgtgccttt tctgaagaga 1801 ttgtgttagc tccaaagctt ttcctatcgc agtgtttcag ttctttattt tcccttgtgg1861 atatgctgtg tgaaccgtcg tgtgagtgtg gtatgcctga tcacagatgg attttgttat1921 aagcatcaat gtgacacttg caggacacta caacgtggga cattgtttgt ttcttccata1981 tttggaagat aaatttatgt gtagactttt ttgtaagata cggttaataa ctaaaattta2041 ttgaaatggt cttgcaatga ctcgtattca gatgcttaaa gaaagcattg ctgctacaaa2101 tatttctatt tttagaaagg gtttttatgg accaatgccc cagttgtcag tcagagccgt2161 tggtgttttt cattgtttaa aatgtcacct gtaaaatggg cattatttat gttttttttt2221 ttgcattcct gataattgta tgtattgtat aaagaacgtc tgtacattgg gttataacac2281 tagtatattt aaacttacag gcttatttgt aatgtaaacc accattttaa tgtactgtaa2341 ttaacatggt tataatacgt acaatccttc cctcatccca tcacacaact ttttttgtgt2401 gtgataaact gattttggtt tgcaataaaa ccttgaaaaa tatttacata taaaaaaaa血清糖皮質(zhì)激素激酶甲(SGKl)通過(guò)脫氧核糖核酸在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外用特異的編碼翻譯表達(dá)，轉(zhuǎn)化為
MSSQSSSLSEACSREAYSSHNWALPPASRSNPQPAYPWATRRMKEEAIKPP LKAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKISQPQEPELMNANPSPPPSP
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EMYDNILNKPLQLKPNITNSARHLLEGLLQKDRTKRLGAKDDFMEIKSHVFFSLIN
WDDLINKKITPPFNPNVSGPNDLRHFDPEFTEEPVPNSIGKSPDSVLVTASVKEAA
EAFLGFSYAPPTDSFL
實(shí)施例一利用多肽P印Seq-I對(duì)SGKl的酶活性進(jìn)行肝細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)抑制，包括 a、構(gòu)建PepSeq-I的表達(dá)載體和底物蛋白表達(dá)載體
根據(jù)脫氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列，所述的DNASeq-I所示的序列為5' -ggcatgagat cgaggtctca cagtttcact ggaacgtcca gcggc-3',合成該段 DNA 序列，并在兩端引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。根據(jù)底物蛋白ENaC的全長(zhǎng)cDNA序列，利用Primer Primer 5. 0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別在上游引物和下游引物前加上限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列及接頭，通過(guò)PCR方法從細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出ENaC，反應(yīng)體系如下
10 X Taq聚合酶緩沖液5 y L
dNTPs4u L
上游引物2. 5iiL
下游引物2. 5iiL
TaqDNA 聚合酶I ii L
模板I U L
__無(wú)菌水
34 u L
Total50 u L
反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 u L擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析并回收目的片段。將合成的DNASeq-I以及ENaC的PCR純化產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的載體pcDNA3. 1，如圖I所示。利用T4連接酶16°C連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化篩選連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中混勻后冰上放置30min，42°C熱擊90s再冰上放置3min，加入800 y L的LB培養(yǎng)液37°C震蕩45min，取一定量鋪于含Amp抗性的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落接種于Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12h，SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒。陽(yáng)性克隆pcDNA3. I- X和pcDNA3. I-ENaC經(jīng)酶切及測(cè)序驗(yàn)證。b、載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系
如圖I所示，鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pcDNA3 . 1-X、pcDNA3. I-ENaC0采用GenEscortTMI進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)良好的HepG2細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24h接種到6孔板仲，待細(xì)胞總面積達(dá)到60%-80%，取I. 5 ii g DNA3. 1-X、I. 5u g pcDNA3. I-ENaC質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)共轉(zhuǎn)，3天后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞。C、檢測(cè)P印Seq-I在肝細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平
對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)P印Seq-I在HepG2細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液冰上裂解15min,離心取上清加入IXSDS Loading Buffer后100°C煮5min進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移至NC膜上，選用1:1000稀釋的SGKl抗體(Abcam)、1:3000稀釋的羊抗兔抗體以及ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)。d、檢測(cè)PepSeq-I對(duì)細(xì)胞內(nèi)SGKl催化活性的抑制水平
如圖2所示,通過(guò)蛋白凝膠電泳Western Blotting]檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)PepSeq-I對(duì)SGKl催化活性的抑制水平。實(shí)施例二 利用多肽P印Seq-I對(duì)SGKl的酶活性進(jìn)行細(xì)胞外抑制，包括
a、體外轉(zhuǎn)錄SGKl和底物蛋白ENaC的相關(guān)表達(dá)載體
將經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRV線性化后的pcDNA3. 1_X、pcDNA3. I-ENaC采用TnT快速轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，所述的多肽通過(guò)高特異性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制在細(xì)胞中抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，所述的PepSeq-I所示的氨基酸序列是通過(guò)脫氧核糖核酸在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外編碼翻譯表達(dá)獲得，或通過(guò)氨基酸直接合成獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其特征在于，所述的編碼翻譯表達(dá)PepSeq-I的脫氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，所述的血清糖皮質(zhì)激素激酶家族，包括血清糖皮質(zhì)激素激酶甲、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙，及血清糖皮質(zhì)激素激酶甲、血清糖皮質(zhì)激素激酶乙和血清糖皮質(zhì)激素激酶丙的異構(gòu)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多肽，其特征在于，所述的細(xì)胞為人體細(xì)胞，包括人體的胚胎細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，所述的抑制為降低酶對(duì)下游靶蛋白進(jìn)行生物催化反應(yīng)的效率和能力。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽，所述的多肽具有PepSeq-1所示的氨基酸序列，通過(guò)高特異性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制在細(xì)胞中抑制血清糖皮質(zhì)激素激酶家族的酶活性。本發(fā)明提供的多肽，具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，在人體細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素及其類似物，以及性激素及其類似物反應(yīng)紊亂的情況下，具有良好的調(diào)節(jié)作用，可以作為治療攝入性激素紊亂和內(nèi)分泌性激素紊亂的特效藥物，對(duì)阿爾茨海默病、激素紊亂造成的皮疹、糖尿病以及其他由激素紊亂導(dǎo)致的疾病有潛在的治療作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102746379SQ20121024204
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者張芃芃, 楊艷坤, 白仲虎, 龍泉 申請(qǐng)人:張芃芃, 楊艷坤, 白仲虎, 龍泉