專利名稱：一種基質表達T.fusca角質酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基質表達T. fusca角質酶的方法，屬于生物工程技術和酶工程領域。
背景技術：
角質酶是一種多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角質和各種聚酯的酯鍵，也可以作用于其它長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反應外，角質酶還能催化酸與醇的酯化、一些脂肪酸鹽與醇的轉酯化。因此角質酶在食品工業(yè)、化工工業(yè)及紡織工業(yè)等諸多領域均有廣泛用途。目前研究者對真菌角質酶中的Fusariumsolani角質酶進行了深入的研究,包括晶體結構解析、分子改造和聞效表達等各個方面。其中關于制備研究尚處在實驗室階段，主要集中于野生菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化以及在不同的基因工程宿主細胞(如酵母、大腸桿菌、曲霉屬和鐮刀菌屬)中進行高效表達、優(yōu)化生產工藝等方面的研究，但由于存在基因工程異源表達時表達量較低和穩(wěn)定性較差的問題，并且生產成本較高，至今為止沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產，同時真菌角質酶本身存在熱穩(wěn)定性差的缺點，不能適合紡織工業(yè)的高溫處理環(huán)境。
與真菌角質酶相比，細菌角質酶具有催化效率高、環(huán)境適應能力強、基因工程異源表達技術成熟等方面的優(yōu)勢。但是迄今為止國內外關于細菌角質酶的報道很少，僅有的報道集中在產角質酶菌種的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和粗酶性質研究等方面。本課題組前期工作中鑒定了嗜熱放線菌Thermobifida fusca角質酶的基因,通過酶學定性和應用效能評價表明其非常適合紡織工業(yè)應用。采用大腸桿菌外源重組蛋白分泌表達中應用最普遍的I型和
II型分泌途徑進行了 T. fusca角質酶的克隆表達和高效分泌研究，其中I型途徑經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，在3L發(fā)酵罐上胞外產量達到700-750U/mL，生產強度約為22. 6U/mL/h,為目前角質酶生產中的最高水平。前期工作中還發(fā)現(xiàn)T. fusca角質酶具有磷脂酶的水解活性，本發(fā)明將成熟的角質酶基因在大腸桿菌中克隆表達，通過角質酶對細胞膜磷脂的有限水解作用使細胞膜通透性增強，進而使得角質酶釋放至培養(yǎng)基中，實現(xiàn)基質表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種基質表達T. fusca角質酶的方法，其特征在于，將NCBI編號為AAZ54921的T. fusca角質酶成熟蛋白基因在大腸桿菌中誘導表達，誘導培養(yǎng)并收集發(fā)酵上清液。為解決上述技術問題，具體方法為I)由本研究室前期構建的Tfu_0883/pET_20b(+)為模板，PCR擴增得到角質酶成熟蛋白基因，連接表達載體，得到重組質粒Tfu_0883/pET20b(+)NS ；2)含有重組質粒Tfu_0883/pET20b (+)NS導入宿主大腸桿菌，構建生產角質酶的基因工程菌；
3)步驟2)構建的重組大腸桿菌經(jīng)誘導培養(yǎng)，收集發(fā)酵上清液。所述宿主菌可以為E.coli BL21(DE3)、Ε· coli W3110、E. coli JM109、Ε· coliJM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 等，其中優(yōu)選 E.coli BL21(DE3)。所述攜帶角質酶和目標蛋白的載體為pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一種。


圖I重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵生產角質酶的過程曲線圖■，DCW; □，培養(yǎng)基中角質酶酶活圖2重組大腸桿菌生產角質酶的SDS-PAGE分析
1，蛋白質分子量標準；2，發(fā)酵液上清；3，細胞破壁上清；4，細胞破壁沉淀圖3重組大腸桿菌3L發(fā)酵罐生產角質酶過程曲線圖■，DCW; □，培養(yǎng)基中角質酶酶活
具體實施例方式實施例I :重組質粒的構建根據(jù)T. fusca角質酶成熟蛋白基因(NCBI編號AAZ54921)，設計引物Pl，P2。Pl :5’ -gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3 含有 NdeI 酶切位點P2 :5’ -AgAgMTTCgggAACgggCAggTggAgCg-3 含有 EcoRI 酶切位點利用上述引物，以本研究室前期構建的Tfu_0883/pET_20b (+)為模板，PCR擴增得到角質酶成熟蛋白基因，反應在50μ L體系中進行。反應條件為94°C預變性4min ;隨后進行30個循環(huán)(980C 10s，60°C 5s, 72°C lmin) ;72°C延伸IOmin ;最后4°C保溫。擴增得到的PCR片段，經(jīng)膠回收后，與pMD18-T simple載體連接，并將連接產物轉化至E. coli JM109，轉化產物涂布于LB-Amp固體平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，平板上挑取單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8h后抽提質粒并測序。將測序結果正確的質粒和pET_20b(+)分別經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切(Nde I為pET-20b (+)載體固有的信號肽pelB上游的酶切位點)后割膠回收，用T4連接酶16°C連接過夜。連接產物轉化E.coli JM109感受態(tài)細胞，涂布LB-Amp固體平板。經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉化子在LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，8 IOh后提取質粒，得到富集的Tfu_0883/pET-20b (+)NS。實施例2 :重組角質酶的搖瓶發(fā)酵將獲得的重組質粒Tfu_0883/pET-20b (+)NS轉入感受態(tài)細胞E. coli BL21 (DE3)，在LB-Amp的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑單菌落于LB-Amp的液體培養(yǎng)基生長至對數(shù)生長后期，按5%接種量接種到TB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mLAmp)，37°C培養(yǎng)2h后，加入終濃度為5g/L的乳糖并降溫至25°C誘導培養(yǎng)。如圖I所示，在發(fā)酵前期，重組菌正常生長，培養(yǎng)基中角質酶酶活很低，當誘導12h之后，培養(yǎng)基中角質酶酶活逐漸上升，當誘導24h時，培養(yǎng)基中酶活達到最高，為204. 8U/mL，胞內僅為10. lU/mL，表明角質酶幾乎全部“分泌”至胞外。SDS-PAGE顯示培養(yǎng)基中有明顯的約31kDa的條帶，與角質酶分子量一致，且無大量的雜蛋白，而胞內目的蛋白量極少(圖2)。
實施例3 :重組角質酶的分批補料發(fā)酵在搖瓶發(fā)酵的基礎上，進一步在3L發(fā)酵罐上進行了發(fā)酵放大實驗。采用指數(shù)流加法控制補料速度以達到重組菌的高密度發(fā)酵。當初始碳源(甘油)在發(fā)酵6h左右基本消耗完時，指數(shù)流加補料液，控制比生長速率μ = O. 251Γ1。當菌濃OD6tltl達到50時，以O. 的流速流加乳糖進行誘導。如圖3所示，在誘導9小時后胞外酶活快速上升，最終酶活為1063U/mL,是搖瓶發(fā)酵的5. 2倍，生產強度為44. 2U/mL/h,是前期I型分泌途徑生產強度的
I.9倍，為國內外報道的最高水平。3L發(fā)酵罐中角質酶高產量的獲得表明該種角質酶的生產方式可以實現(xiàn)角質酶的高效制備，具備工業(yè)化生產的潛力。
權利要求
1.一種基質表達T. fusca角質酶的方法，其特征在于，將NCBI編號為AAZ54921的T. fusca角質酶成熟蛋白基因在大腸桿菌中表達，發(fā)酵培養(yǎng)并收集發(fā)酵上清液。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于，具體方法為 1)將T.fusca角質酶成熟蛋白基因克隆到pET-20b(+)，構建無信號肽角質酶的重組質粒 Tfu_0883/pET-20b(+)NS ； 2)將重組質粒Tfu_0883/pET-20b(+)NS導入宿主大腸桿菌； 3)步驟2)構建的無信號肽角質酶重組菌進行發(fā)酵，收集發(fā)酵上清液。
3.權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 等中任意一種。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述攜帶角質酶的載體為pUC系列，pET系列，pT7-7,或pGEX等中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基質表達T.fusca角質酶的方法，屬于生物工程技術和酶工程領域。本發(fā)明由本研究室前期構建的Tfu_0883/pET-20b(+)為模板，PCR擴增得到角質酶成熟蛋白基因，連接表達載體，轉化E.coli宿主菌，實現(xiàn)了角質酶的基質表達。搖瓶發(fā)酵中，經(jīng)過誘導重組角質酶在培養(yǎng)基中的酶活達到204.8U/mL，為總酶活的95.3％。進一步在3L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)，最終酶活為1063U/mL，是搖瓶發(fā)酵的5.2倍，生產強度為44.2U/mL/h，為國內外報道的最高水平。
文檔編號C12R1/19GK102899298SQ20121024142
公開日2013年1月30日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權日2012年7月5日
發(fā)明者吳敬, 宿玲恰, 陳晟, 陳堅 申請人:江南大學