專利名稱：擴(kuò)增靶核酸的方法和測定樣品中的靶核酸的相對量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及擴(kuò)增靶核酸的方法和測定樣品中的靶核酸的相對量的方法。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增指靶核酸序列或其互補(bǔ)序列的拷貝數(shù)增加。核酸擴(kuò)增是本領(lǐng)域中公知的。核酸擴(kuò)增包括在擴(kuò)增過程期間需要多個循環(huán)的方法或在單一溫度下實(shí)施的方法。循環(huán)技術(shù)以需要熱循環(huán)的方法例示。需要熱循環(huán)的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其是本領(lǐng)域中公知的。PCR包括通過熱變性將雙鏈DNA變性成單鏈DNA，將引物與單鏈DNA退火；和由所述引物合成互補(bǔ)鏈。等溫?cái)U(kuò)增是在單一溫度下實(shí)施的或者其中擴(kuò)增過程的主要方面在單一溫度下實(shí)施的擴(kuò)增。在PCR過程中，加熱反應(yīng)產(chǎn)物以分開兩條鏈，使得另一引物可結(jié)合到模板。相反地，等溫技術(shù)依賴于鏈置換聚合酶(strand displacing polymerase),以分開雙鏈的兩條鏈并再復(fù)制模板。等溫技術(shù)可以分成依賴于引物置換以引發(fā)反復(fù)的模板復(fù)制的方法和依賴于單一引物分子的連續(xù)再使用或新合成的方法。依賴于引物置換的方法包括解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、外切核酸酶依賴性擴(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、和環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP)。依賴于單一引物分子的連續(xù)再使用或新合成的方法包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)或基于核酸的擴(kuò)增(NASBA 和 TMA)。擴(kuò)增偏倚(amplification bias)可以在擴(kuò)增短的靶核酸時根據(jù)靶核酸的類型而產(chǎn)生。擴(kuò)增偏倚可根據(jù)靶核酸拷貝數(shù)或堿基序列、例如AT含量或GC含量而變化。例如，在包含多種微RNA (miRNA)的樣品中，即在包含miRNA文庫的樣品中擴(kuò)增各miRNA時，擴(kuò)增偏倚可根據(jù)miRNA的序列和miRNA的拷貝數(shù)而變化。通常，miRNA具有范圍為約18至25nt且平均約21至24nt的長度，而且具有超過1000種類型的序列。因此，仍需要開發(fā)在沒有擴(kuò)增偏倚的情況下或以降低的擴(kuò)增偏倚擴(kuò)增在包含多種靶核酸諸如miRNA文庫的樣品中的靶核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
提供以降低的擴(kuò)增偏倚擴(kuò)增靶核酸的方法。提供測定樣品中的靶核酸的相對量的方法。


通過結(jié)合附圖考慮的實(shí)施方案的以下描述，這些和/或其它方面將變得明晰和更容易理解，其中圖IA和IB顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將詳細(xì)地介紹實(shí)施方案，其例子在附圖中說明，其中相同的附圖標(biāo)記始終是指相同的元件。在這點(diǎn)上，本實(shí)施方案可以具有不同形式，并且不應(yīng)解釋為限于本文中所闡述的描述。因而，下文僅通過參考附圖描述實(shí)施方案以解釋本說明書的各方面。諸如“…至少一種(個)”的表述在要素列表之前或之后時修飾整個要素列表，而不是修飾該列表的單獨(dú)要素。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供擴(kuò)增靶核酸的方法，該方法包括提供包含多種類型的靶核酸的樣品；連接至少兩種類型的所述靶核酸；并擴(kuò)增連接產(chǎn)物。所述方法包括提供包含多種類型的靶核酸的樣品。樣品可以是包含靶核酸的任何樣品。例如，樣品可以包括包含靶核酸的生物樣品或化學(xué)樣品。源自活生物體的生物樣品可以從活生物體直接分離，或者分離并進(jìn)一步加工(例如通過使用純化和擴(kuò)增)。例如，經(jīng)分離的活生物體包括選自下組的至少一種血液、尿、唾液、淋巴、組織和細(xì)胞。另外，經(jīng)進(jìn)一步加工的樣品可以是任何樣品，包括血清、由活生物體分離的核酸、或擴(kuò)增的核酸?；瘜W(xué)樣品可以包括化學(xué)合成的靶核酸。樣品可以包括RNA或DNA。樣品可以包括miRNA。術(shù)語“miRNA”可以是真核細(xì)胞中存在的短RNA。miRNA在細(xì)胞生理學(xué)中具有重要的功能，并且可以充當(dāng)在基因表達(dá)的翻譯后的控制物(controller)?？梢酝ㄟ^使用TRizol/TRI試劑的方法分離miRNA。也可以通過使用已知的分離試劑盒例如mirVana分離試劑盒(Ambion)和RNeasy 試劑盒(Qiagen)分離 miRNA。靶核酸可以具有約200nt或更小的長度。例如，靶核酸長度的范圍可在約15至約200nt、約15至約170nt、約15至約150nt、約15至約120nt、約15至約lOOnt、約15至約80nt、約15至約75nt、約15至約70nt、約18至約200nt、約18至約170nt、約18至約150nt、約18至約120nt、約18至約lOOnt、約18至約80nt、約18至約75nt、約18至約70nt、約18至約50nt、約18至約30nt、約18至約27nt、約8至約25nt、約18至約25nt、或約21至約25nt的范圍內(nèi)。例如，靶核酸可以具有與前miRNA或miRNA的長度對應(yīng)的長度。靶核酸可以是DNA或RNA。RNA可以選自下組tRNA、rRNA、mRNA和miRNA。DNA可以是基因組DNA片段或由RNA制備的cDNA。在本文中使用的術(shù)語“多種類型的靶核酸”表示一個樣品中含有具有不同一級序列的至少兩種核酸分子。例如，一個樣品中可以含有具有不同序列的至少兩種miRNA分子。術(shù)語“至少兩”包括至少三、至少四、至少五、至少n[n為6以上的任意整數(shù)]的界限，以及靶核酸的類型的任意具體數(shù)目為2或更大的整數(shù)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、m[m為16以上的任意整數(shù)]，其全部在此附上。所述方法包括連接至少兩種類型的靶核酸。可以通過使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來實(shí)施連接。例如，可以在RNA連接酶和DNA連接酶的至少一種存在的情況下實(shí)施所述連接。用于在RNA連接酶和DNA連接酶的至少一種存在的情況下連接靶核酸的條件是本領(lǐng)域中公知的。例如，用于連接的條件可以包括包含如下的溶液具有磷酸化的5’-P-末端的核酸、具有3’ -羥基末端的核酸、和ATP。例如，RNA連接酶包括T4RNA連接酶I或2。DNA連接酶包括T4DNA連接酶?？梢栽谶m于連接的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溫度可以在約35°C至約40°C的范圍中，例如約37°C。通過引入在靶核酸間的接頭序列來實(shí)施連接。所述連接可通過如下實(shí)施將具有3’ -末端的一個靶核酸與具有5’ -末端的另一個靶核酸連接，3’ -末端特異性接頭序列結(jié)合到所述3’ -末端，5’ -末端特異性接頭序列結(jié)合到所述5’ -末端。術(shù)語“接頭序列”指用于與靶核酸的3’-末端或5’-末端連接的核酸序列。接頭序列可以是DNA或RNA。接頭序列可以是單鏈序列或雙鏈序列。接頭序列可以具有在約20%至約80%，例如約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約60%至約80%、約70%至約80%、約60%至約70%、約30%至約70%、約30%至約60%、約30%至約50%、約30%至約40%、約40%至約50%，或約40%至約70%范圍內(nèi)的GC含量。接頭序列可以具有在約3nt至約IOOnt范圍內(nèi)的長度。接頭序列的長度可在約3nt至約70nt、約3nt至約50nt、約3nt至約30nt、約3nt至約20nt、約
3nt至約IOnt、約3nt至約7nt、約4nt至約20nt、約4nt至約IOnt、或約4nt至約7nt的范圍內(nèi)。術(shù)語“對3’ -末端或5’ -末端特異性的接頭序列”表示不同的接頭序列分別結(jié)合到3’ -末端和5’ -末端?？梢酝ㄟ^選擇性封閉或活化靶核酸和接頭序列的5’ -末端和3’ -末端的反應(yīng)性來進(jìn)行連接。例如，5’ -末端接頭序列可通過如下僅連接到靶核酸如miRNA或其cDNA的5’ -末端將靶核酸的5’ -末端磷酸化，封閉靶核酸的3’ -末端(例如，通過將3’-末端-OH基團(tuán)轉(zhuǎn)化成磷?；鶊F(tuán))，并在DNA或RNA連接酶存在的情況下與具有3’ -末端-OH基團(tuán)的5’ -末端接頭序列(A5)反應(yīng)。在這點(diǎn)上，可以將5’ -末端接頭序列的5’ -末端選擇性地磷酸化。3’ -末端接頭序列(A3)可通過如下僅連接到連接產(chǎn)物的3’ -末端在DNA或RNA連接酶存在的情況下將連接產(chǎn)物與具有磷酸化的5’ -末端的3’_末端接頭序列反應(yīng)。在這點(diǎn)上，可以將3’-末端接頭序列的3’-末端選擇性地磷酸化。可以將對靶核酸的3’ -末端和5’ -末端特異性的接頭序列順序地引入靶核酸的5’ -末端和3’ -末端，順序地引入靶核酸的3’ -末端和5’ -末端，或者同時引入靶核酸的5’ -末端和3’ -末端。5’ -末端特異性接頭序列和3’ -末端特異性接頭序列可以具有相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列。將接頭序列同時引入5’-末端和3’-末端的例子如下。在DNA或RNA連接酶存在的情況下，將具有磷酸化的5’ -末端和3’ -末端OH基團(tuán)的靶核酸、具有非磷酸化的5’ -末端和3’ -末端OH基團(tuán)的5’ -末端接頭序列、和具有磷酸化的5’ -末端和封閉的3’ -末端的3’-末端接頭序列反應(yīng)，使得可以將分別對靶核酸的5’-末端和3’-末端特異性的接頭序列鍵合到靶核酸的5’ -末端和3’ -末端。如上所述，可以將在其5’ -末端和3’ -末端中的至少之一處具有特異性接頭序列的靶核酸彼此連接。所述方法包括將引物序列或引物結(jié)合序列與靶核酸的連接產(chǎn)物的3’ -末端和5’_末端的至少一個連接?？梢耘c接頭序列與靶核酸間的連接相同的方式將引物序列或引物結(jié)合序列與連接產(chǎn)物的3’ -末端或5’ -末端連接?？梢詫⒁镄蛄泻鸵锝Y(jié)合序列的至少一個與3’ -末端和5’ -末端之一特異性連接。術(shù)語“引物結(jié)合序列”包括與引物互補(bǔ)的序列。但是，所述方法可不包括將引物序列或引物結(jié)合序列連接到靶核酸的連接產(chǎn)物的3’ -末端或5’ -末端的至少之一。在這種情況下，接頭序列可用作引物序列或引物結(jié)合序列。例如，當(dāng)連接產(chǎn)物包括僅在靶核酸的連接產(chǎn)物的3’ -末端或5’ -末端的至少之一處的接頭時，所述方法可不包括將引物序列或引物結(jié)合序列連接到靶核酸的連接產(chǎn)物的3’ -末端或5’ -末端的至少之一。此外，接頭序列的至少一部分也可用作引物序列。術(shù)語“引物序列”指起到核酸聚合起點(diǎn)作用的核酸序列。引物序列可以結(jié)合到靶核酸且具有3’-0H基團(tuán)。弓丨物序列可以是DNA或RNA。引物序列可以是單鏈。引物序列可以具有在約20%至約80%，例如約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約60%至約80%、約70%至約80%、約60%至約70%、約30%至約70%、約30%至約60%、約30%至約50%、約30%至約40%、約40%至約50%、或約40%至約70%范圍內(nèi)的GC含量。引物序列可以具有在約IOnt至約IOOnt范圍內(nèi)的長度。例如，引物序列的長度可在約IOnt至約70nt、約IOnt至約50nt、約IOnt至約30nt、約IOnt至約20nt、約15nt至約lOOnt、約15nt至約70nt、約15nt至約50nt、約15nt至約40nt、或約15nt至約30nt的范圍內(nèi)。所述引物序列或引物結(jié)合序列可預(yù)連接到接頭序列。兩個或更多個(兩種或更
多種)靶核酸可包括將兩個或更多個不同的靶核酸與一個或多個預(yù)連接的、端基封閉的3’ -引物-接頭序列、或者一個或多個預(yù)連接的、端基封閉的5’ -引物-接頭序列組合。如從前述描述中明晰的，接頭和引物序列可以多種不同的方式添加到靶核酸。例如，接頭序列(例如端基封閉的接頭序列)可連接到兩個或更多個靶核酸的3’-末端，和靶核酸隨后彼此連接(如果需要，采用從接頭除去端基封閉的步驟)以提供具有以下結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物(靶)-A3-[(靶)-A3] n-(靶)-A3，其中A3是3 ’接頭序列，(靶)是靶核酸序列，和η是代表在連接產(chǎn)物中靶核酸序列的數(shù)目的整數(shù)。η可在1000、例如2-1000、2-800、2_600、2-500、2-300、2-200或2-100的范圍內(nèi)。當(dāng)然，可使用連接至靶的5’末端的5’接頭序列進(jìn)行相同的過程，在該情況下連接產(chǎn)物將具有以下結(jié)構(gòu)·Μ-(靶)-[Α5-(靶)]η-Α5-(靶)，其中Α5是5’接頭序列。如需要，引物或引物結(jié)合序列可添加到連接產(chǎn)物的3’和/或5’末端，提供具有以下結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物Ρ5-(靶)-A3-[(靶)-A3] η_ (靶)-A3 ；Ρ5-(靶)-A3-[(靶)-A3] η_ (靶)-Α3-Ρ3 ；(靶)-A3-[(靶)-A3]η_ (靶)-Α3-Ρ3 ；Ρ5-Α5_(靶)-[Α5_(靶)]η-Α5_(靶)；Ρ5-Α5-(靶)-[Α5-(靶)]η~Α5~ (靶)_Ρ3 ;或
Α5-(靶)-[Α5-(靶)]η-Α5-(靶)-Ρ3 ；其中Ρ5和Ρ3分別是5’和3’引物或引物結(jié)合序列，且Α5、A3、(靶)和η各自如上定義?；蛘撸宇^序列可添加到靶核酸序列的3’和5’末端兩者，和靶核酸隨后連接以提供具有以下結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物當(dāng)然，可使用連接至靶的5’末端的5’接頭序列進(jìn)行相同的過程，在該情況下連接產(chǎn)物將具有以下結(jié)構(gòu)Α5-(靶)-Α3-[Α5-(靶)-Α3]η-Α5-(靶)-A3，其中Α5、Α3、(靶)和η各自如上定義。引物或引物結(jié)合序列可添加到3’和/或5’末端以提供具有以下結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物Ρ5-Α5-(靶)-A3- [Α5-(靶)-A3] η~Α5~ (靶)-A3 ；Α5-(靶)-A3- [Α5-(靶)-A3] η~Α5~ (靶)-Α3-Ρ3 ；或Ρ5-Α5-(靶)-A3- [Α5-(靶)-A3] η~Α5~ (靶)-Α3-Ρ3 ；
其中P5、P3、A5、A3、(靶)和η如上定義。接頭和引物或引物結(jié)合序列向靶核酸的連接、以及包括接頭和/或引物或引物結(jié)合序列的靶核酸的連接可以任何合適的順序進(jìn)行，如需要，使用端基封閉(保護(hù))基團(tuán)，以得到具有所需結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物，如本文中涉及的任何連接產(chǎn)物。合適的方案說明在以下提供的實(shí)施例中。在具體實(shí)施方式
中，不使用插入(intervening)引物序列。代替地，祀核酸序列彼此連接，和在靶核酸彼此連接之前、同時或之后，引物(或引物結(jié)合序列)或接頭-引物(或接頭-引物結(jié)合序列)添加到3’和/或5’末端。作為進(jìn)一步說明，端基封閉的接頭-引物序列可添加到靶核酸的混合物，和所述混合物連接以提供具有以下結(jié)構(gòu)的變化長度的核酸(靶)-(靶)n_ (靶)-A3-P3，其中A3是接頭序列，P3是端基封閉的引物或引物結(jié)合序列，和靶是靶序列，及η如上定義。接頭-引物或接頭-引物結(jié)合序列然后可添加到連接產(chǎn)物的5’末端以提供具有以下結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物Ρ5-Α5-(靶)-(靶)η-(靶)-Α3-Ρ3。當(dāng)然，通過
在第一步中使用5’接頭-端基封閉的引物代替3’接頭-引物來首先添加Ρ5-Α5基團(tuán)可進(jìn)行相同的過程。作為進(jìn)一步說明，當(dāng)端基封閉的接頭-引物序列如5’-羥基5’端基封閉的Ρ5-Α5而不是5’ -磷?；?’ -羥基Ρ5-Α5和/或2’，3’ -雙脫氧3’端基封閉的Α3-Ρ3以如上所述類似的方式使用時，接頭-引物序列可僅添加到5’、3’或5’和3’末端兩者。所述方法包括擴(kuò)增連接產(chǎn)物。術(shù)語“擴(kuò)增”指靶核酸及其互補(bǔ)序列的拷貝數(shù)增加。可以通過使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來實(shí)施擴(kuò)增。核酸的擴(kuò)增包括在擴(kuò)增過程期間需要多個循環(huán)的方法或在單一溫度下實(shí)施的方法。循環(huán)技術(shù)以需要熱循環(huán)的方法例示。需要熱循環(huán)的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其是本領(lǐng)域中公知的。PCR包括通過熱變性將雙鏈DNA變性成單鏈DNA，將引物與單鏈DNA退火；并由所述引物合成互補(bǔ)鏈。等溫?cái)U(kuò)增是在單一溫度下實(shí)施的或者其中擴(kuò)增過程的主要方面在單一溫度下實(shí)施的擴(kuò)增。在PCR過程中，加熱反應(yīng)產(chǎn)物以分開兩條鏈，使得另一引物可以結(jié)合到模板。相反地，等溫技術(shù)依賴于鏈置換聚合酶，以分開雙鏈的兩條鏈并再復(fù)制模板。等溫技術(shù)可以分成依賴于引物置換以引發(fā)反復(fù)的模板復(fù)制的方法和依賴于單一引物分子的連續(xù)再使用或新合成的方法。依賴于引物置換的方法包括解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、外切核酸酶依賴性擴(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、和環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP)。依賴于單一引物分子的連續(xù)再使用或新合成的方法包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)或基于核酸的擴(kuò)增(NASBA和TMA)?？梢酝ㄟ^將所述連接產(chǎn)物擴(kuò)增為一個擴(kuò)增產(chǎn)物來實(shí)施所述擴(kuò)增。即，可選擇引物使得一個擴(kuò)增產(chǎn)物包括在一個連接產(chǎn)物中含有的所有靶核酸。例如，在PCR中，正向引物可以與最上游的靶核酸的5’ -末端區(qū)或其上游區(qū)互補(bǔ)，而反向引物可以與最下游的靶核酸的3’_末端區(qū)或其下游區(qū)互補(bǔ)?？梢酝ㄟ^使用與所述引物序列互補(bǔ)的序列和與所述引物結(jié)合序列互補(bǔ)的序列的至少一個作為引物來實(shí)施所述擴(kuò)增。連接產(chǎn)物可具有約4000nt或更小的長度。例如，連接產(chǎn)物的長度可在約15-約4000nt、約15-約3500nt、約15-約3000nt、約 15-約 3000nt、約 15-約 2500nt、約 15-約 2000nt、約 15-約 1500nt、約 15-約 IOOOnt,約 15-約 800nt、約 15-約 600nt、約 15-約 400nt、約 15-約 200nt、約 18-約 4000nt、約18-約 3500nt、約 18-約 3000nt、約 18-約 3000nt、約 18-約 2500nt、約 18-約 2000nt、約18-約 1500nt、約 18-約 IOOOnt、約 18-約 800nt、約 18_約600社、約 18_約400社、約 18-約200nt、約 21-約 4000nt、約 21-約 2000nt、或約 21-約 IOOOnt 的范圍內(nèi)。
引物可以沒有與靶核酸互補(bǔ)的序列，如miRNA或其cDNA。在PCR中，因?yàn)檎蛞锱c最上游的靶核酸的5’ -末端的上游區(qū)互補(bǔ)，所以正向引物沒有靶核酸序列或與靶核酸互補(bǔ)的序列，且因?yàn)榉聪蛞锱c最下游的靶核酸的3’ -末端的下游區(qū)互補(bǔ)，所以反向引物沒有靶核酸序列或與靶核酸互補(bǔ)的序列。所述方法可以進(jìn)一步包括如果所述靶核酸是RNA，則通過逆轉(zhuǎn)錄所述靶核酸產(chǎn)生與所述靶核酸互補(bǔ)的DNA(cDNA)。可以在所述連接之前或之后實(shí)施所述逆轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域中已知，使用逆轉(zhuǎn)錄酶使用RNA鏈，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA互補(bǔ)鏈。所述方法可以進(jìn)一步包括在所述逆轉(zhuǎn)錄前將接頭序列與所述靶核酸的3’ -末端和5’ -末端的至少一個連接。可以將所述接頭序列與靶核酸的3’ -末端和5’ -末端的至少一個特異性連接。 所述方法可以進(jìn)一步包括在所述逆轉(zhuǎn)錄后將接頭序列與靶核酸的cDNA的3’ -末端和5’ -末端的至少一個連接?？梢詫⒔宇^序列與靶核酸的3’ -末端和5’ -末端的至少一個特異性連接。連接接頭序列是如上所述的。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供測定樣品中的靶核酸的相對量的方法，該方法包括根據(jù)上述方法擴(kuò)增樣品中含有的靶核酸；由擴(kuò)增產(chǎn)物測量所述靶核酸的量；并通過使用測量的量測定所述樣品中的所述靶核酸的相對量。所述方法包括根據(jù)上述方法擴(kuò)增樣品中含有的靶核酸。所述方法包括由擴(kuò)增產(chǎn)物測量靶核酸的量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法測量靶核酸的量?？梢酝ㄟ^使用實(shí)時擴(kuò)增測量靶核酸的量。實(shí)時擴(kuò)增包括使用熒光染料和熒光淬滅劑的Taqman 方法、以及使用結(jié)合到雙鏈DNA的熒光材料的方法。根據(jù)Taqman 方法，可以基于在擴(kuò)增期間通過使用Taqman 探針檢測的熒光材料的量實(shí)時測量靶核酸的量，所述Taqman 探針具有與突光報(bào)告材料結(jié)合的5’-末端和與突光淬滅劑結(jié)合的3’-末端，而且包含對各靶核酸特異性的序列。在擴(kuò)增期間，因?yàn)橥ㄟ^具有5’ ->3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶使引物延伸并且合成新鏈，所以通過5’->3’外切核酸酶活性切割與模板退火的探針。因?yàn)樘结槺磺懈?，所以熒光染料得到釋放。因而，從其分離熒光淬滅劑，并且熒光升高。在這點(diǎn)上，熒光報(bào)告材料可以根據(jù)靶核酸而變化。使用Taqman 探針的實(shí)時擴(kuò)增是本領(lǐng)域中公知的，并且可以使用任何已知的方法。除了實(shí)時擴(kuò)增以外，可使用對應(yīng)單獨(dú)的靶核酸的特異性探針的雜交方法量化或檢測單獨(dú)的靶核酸，和在這種情況下，探針可固定在微陣列中。可通過如下量化或檢測單獨(dú)的靶核酸擴(kuò)增單獨(dú)的靶核酸和通過使用特異性探針檢測其。例如，檢測可通過使用電泳或其它檢測方法(例如光或電信號檢測方法)進(jìn)行。量化或檢測的量可用于計(jì)算單獨(dú)的靶核酸的相對量。在使用結(jié)合到雙鏈DNA的熒光材料的方法中，DNA結(jié)合熒光材料在PCR期間結(jié)合到所有雙鏈DNA。在PCR期間，DNA產(chǎn)物的增加提高熒光強(qiáng)度。在每個循環(huán)測量強(qiáng)度，使得可以定量DNA的濃度。DNA結(jié)合熒光材料可以是SYBR Green I。也可以通過使用擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交或電泳來測定靶核酸的量。所述方法包括通過使用靶核酸的測量的量測定樣品中的靶核酸的相對量?？梢酝ㄟ^相對于預(yù)定值例如閾值將靶核酸的量標(biāo)準(zhǔn)化，或者將靶核酸的量與標(biāo)準(zhǔn)值比較來實(shí)施所述測定靶核酸的相對量?？梢允褂脺y定的靶核酸的相對量來確定靶核酸與各種生理狀況例如疾病間的關(guān)系O根據(jù)在包含多種靶核酸的樣品中根據(jù)實(shí)施方案的擴(kuò)增靶核酸的方法，可以降低的擴(kuò)增偏倚擴(kuò)增靶核酸。如此，可由擴(kuò)增產(chǎn)物的量更精確地測定樣品中的靶核酸的概況(剖析圖，profile)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案的測定樣品中的靶核酸的相對量的方法，可以有效測定樣品中的靶核酸的相對量。參考以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明的目的，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :以降低的擴(kuò)增偏倚擴(kuò)增靶核酸I.制備第一連接產(chǎn)物，其中接頭序列和引物序列連接到單獨(dú)miRNA的cDNA選擇具有不同GC含量的15種類型的miRNA作為待擴(kuò)增的靶核酸。合成具有與接頭序列和引物序列順序結(jié)合的3’-末端和5’-末端的單鏈DNA(其是各miRNA的cDNA)(第一連接產(chǎn)物)以模擬具有與順序結(jié)合到接頭序列和引物序列的3’ -末端和5’ -末端的連接產(chǎn)物。詳細(xì)地，將3’-末端接頭序列(A3)與各miRNA的cDNA的3’-末端連接，將5’-末端接頭序列(A5)與cDNA的5’ -末端連接，將3’引物序列(P3)與A3連接，并將5’引物序列(P5)與A5連接，導(dǎo)致合成第一連接產(chǎn)物(Bioneer Corporation, KOREA)。合成的第一連接產(chǎn)物具有P5-A5-miRNA的cDNA_A3_P3的一般結(jié)構(gòu)。在這點(diǎn)上，P5和P3是引物結(jié)合位點(diǎn)。P5-A5和A3-P3具有如下的序列。P5-A5:5，-TGAGTTCTACGGTACCTCTAAGC-3’ (SEQ ID NO :16)A3-P3:5，-AGGCATAAGCTGTTAGCTCAGAAT-3，(SEQ ID NO :17)作為擴(kuò)增引物，使用P5-A5序列的正向引物(SEQ ID NO 16)和具有5’_ATTCTGAGCTAACAGCTTATGCCT-3’ (SEQ ID NO :18)的與 A3-P3 序列互補(bǔ)的反向引物。因?yàn)榻宇^序列和引物序列具有在20%至80%范圍內(nèi)的GC含量，所以連接產(chǎn)物也具有接近20%至80%的GC含量。下表I中顯示15種miRNA的序列。表I
編號名稱SEQ ID NO GC含量(%) Tm(°C) 長度(nt)~
~ hsa-mir-95 36 46022
2hsa-mir-7234.86223
3hsa-mir-1327. 35622
4hsa-mir-9434.86223
5hsa-mir-16545. 5642權(quán)利要求
1.擴(kuò)增靶核酸的方法，該方法包括 提供包含多種類型的靶核酸的樣品； 連接至少兩種類型的所述靶核酸；和 擴(kuò)增連接產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求I的方法,其中所述樣品包括RNA或DNA。
3.權(quán)利要求I的方法，其中在RNA連接酶和DNA連接酶的至少一種存在的情況下實(shí)施所述連接。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述連接下通過如下實(shí)施引入在所述靶核酸間的接頭序列、在靶核酸的5’ -末端的接頭序列、在靶核酸的3’ -末端的接頭序列、或其組合。
5.權(quán)利要求I的方法，其中通過將具有3’-末端的一個祀核酸與具有5’-末端的另一個革[I核酸連接來實(shí)施所述連接，3’ -末端特異性接頭序列結(jié)合到所述3’ -末端,5’ -末端特異性接頭序列結(jié)合到所述5’ -末端。
6.權(quán)利要求I的方法，其中將引物序列或引物結(jié)合序列與所述連接產(chǎn)物的3’-末端和5’_末端的至少一個連接。
7.權(quán)利要求6的方法，其中將所述引物序列和所述引物結(jié)合序列的至少一個與所述3’ -末端或所述5’ -末端特異性連接。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述靶核酸具有200nt或更小的長度。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述靶核酸具有在20至70nt范圍內(nèi)的長度。
10.權(quán)利要求I的方法，其中通過將所述連接產(chǎn)物擴(kuò)增為一個擴(kuò)增產(chǎn)物來實(shí)施所述擴(kuò)士豳>曰ο
11.權(quán)利要求6的方法，其中通過使用與所述引物序列互補(bǔ)的序列和與所述引物結(jié)合序列互補(bǔ)的序列的至少一個作為弓I物來實(shí)施所述擴(kuò)增。
12.權(quán)利要求I的方法，進(jìn)一步包括如果所述靶核酸是RNA，則通過逆轉(zhuǎn)錄所述靶核酸產(chǎn)生與所述靶核酸互補(bǔ)的DNA(cDNA)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在所述連接之前或之后實(shí)施所述逆轉(zhuǎn)錄。
14.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括在所述逆轉(zhuǎn)錄前將接頭序列與所述靶核酸的3’ -末端和5’ -末端的至少一個連接。
15.權(quán)利要求14的方法，其中將所述接頭序列與所述3’-末端和所述5’-末端的至少一個特異性連接。
16.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括在所述逆轉(zhuǎn)錄后將接頭序列與所述cDNA的3’-末端和5’ -末端的至少一個連接。
17.權(quán)利要求16的方法，其中將所述接頭序列與所述3’-末端和所述5’-末端的至少一個特異性連接。
18.權(quán)利要求I的方法，其中通過PCR來實(shí)施所述擴(kuò)增，且將正向和反向引物與不是所述靶核酸的核酸區(qū)特異性退火。
19.測定樣品中的靶核酸的相對量的方法，該方法包括 根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法擴(kuò)增樣品中含有的靶核酸； 由擴(kuò)增產(chǎn)物測量所述靶核酸的量；和 通過使用測量的量來測定所述樣品中的所述靶核酸的相對量。
全文摘要
以降低的擴(kuò)增偏倚擴(kuò)增靶核酸的方法和測定樣品中的靶核酸的相對量的方法。所述擴(kuò)增靶核酸的方法包括提供包含多種類型的靶核酸的樣品；連接至少兩種類型的所述靶核酸；和擴(kuò)增連接產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/10GK102876660SQ20121024065
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者洪性宇 申請人:三星電子株式會社