專利名稱：敲除脯氨酸合成途徑提高鈍齒棒桿菌精氨酸產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及工業(yè)微生物生產(chǎn)精氨酸的方法。更具體的，本發(fā)明涉及基因工程重組鈍齒棒桿菌生產(chǎn)精氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是人體和動物體內(nèi)的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質(zhì)肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝產(chǎn)物，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。L-精氨酸在臨床醫(yī)藥、食品、化妝品以及有關(guān)生物研究領(lǐng)域中用途廣泛。發(fā)酵法是目前L-精氨酸商業(yè)化生產(chǎn)比較有效和經(jīng)濟(jì)的方法。隨著我國醫(yī)藥營養(yǎng)水平的提高，對精氨酸的需求日益增長，但傳統(tǒng)生產(chǎn)L-精氨酸的高產(chǎn)菌株大多采用誘變篩選的方法獲得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突變株生理失調(diào)、易退化等局限性；DNA重組技術(shù)出現(xiàn)以后，人們開始探索利用DNA重組技術(shù)調(diào)控合成精氨酸代謝途徑，以達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的。鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)是我國研究者分離到的一種鈍齒狀、無芽孢的革蘭式陽性菌，其突變株在國內(nèi)氨基酸生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，但對其遺傳背景的研究還處于空白狀態(tài)。C.crenatum SYPW是本實驗室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株(菌株的保藏編號為CCTCC NO:M208133), SYPA 5-5是此菌株經(jīng)過傳代5次后得到的菌株，其菌株特性在傳代中與SYPW保持一致。對氨基酸生產(chǎn)菌株代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造從而提高氨基酸的產(chǎn)量是現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)的一個主攻目標(biāo)。對目標(biāo)菌株進(jìn)行遺傳改造時，經(jīng)常涉及到多個基因的連續(xù)敲除，利用枯草桿菌中sac B基因作為一個條件致死型標(biāo)記，攜帶抗生素抗性與sacB雙標(biāo)記的新型整合型載體pKlSmobsacB，對谷氨酸棒狀桿菌染色體基因?qū)崿F(xiàn)了多基因的無痕敲除及基因替代，促進(jìn)了棒桿菌屬的一系列菌株的遺傳改造，為棒桿菌代謝工程改造提供了良好的遺傳改造手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對精氨酸合成的競爭旁路代謝關(guān)鍵酶基因進(jìn)行敲除，以增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物精氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因簇表達(dá)的同時，削弱脯氨酸合成競爭支路途徑的代謝流，最終使L-谷氨酸分解代謝集中在L-精氨酸的合成代謝流從而進(jìn)一步提高精氨酸的產(chǎn)量。通過對L-精氨酸合成代謝途徑的分析，代謝工程改造L-精氨酸生產(chǎn)菌株的另一育種方案就是削弱葡萄糖一L-谷氨酸一L-精氨酸代謝相關(guān)競爭途徑中的分支代謝流，使得更多的代謝流向合成L-精氨酸及其前體物L(fēng)-谷氨酸。在鈍齒棒桿菌L-精氨酸的合成代謝途徑中，以葡萄糖為底物，經(jīng)過TCA循環(huán)中的α -酮戊二酸合成L-谷氨酸，在基因簇argCH編碼的7個酶的催化下合成L-精氨酸。而L-Glu除作為合成L-精氨酸的前體物，其代謝流還可以向L-脯氨酸和L-谷氨酰胺合成。對C.crenatum SYPA (相關(guān)菌株的保藏編號為CCTCC NO:M208133)發(fā)酵L-精氨酸來說，應(yīng)削弱旁路代謝流量而集中葡萄糖經(jīng)TCA循環(huán)中的α -酮戊二酸一L-谷氨酸一L-精氨酸的代謝流量，因此本發(fā)明將對L-精氨酸合成相關(guān)競爭途徑一脯氨酸的合成進(jìn)行敲除，根據(jù)模式菌株谷氨酸棒桿菌全基因組中ProB基因(GenBank N0.BA000036.3)設(shè)計鈍齒棒桿菌中L-脯氨酸合成proB基因的敲除，從而提高了鈍齒棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的產(chǎn)量而完成了本發(fā)明，目前相關(guān)研究暫無報道。技術(shù)方案如下:(I)以鈍齒棒桿菌基因組為模板，分別以proB基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物序列如下:PproBF EcoRI 5， -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGCPproBR SalI 5， -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGACPCR獲得長為1，IOObp的目標(biāo)特異產(chǎn)物，經(jīng)純化后與PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化JM109，提取質(zhì)粒，酶切驗證并測序。(2)設(shè)計引物利用重疊PCR的方法擴(kuò)增缺少了 300 500bp的缺失型基因proB’，引物序列如下:ΡΔproB R5，-CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATCP AproB F 5’ -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT經(jīng)兩輪重疊PCR獲得核苷酸片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1所示為含同源片段proB’與理論大小一致,缺失片段構(gòu)建成功；將目的片段proB’與pK18mobsacB線性化載體相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子。(3)將經(jīng)酶切驗 證后質(zhì)粒pK18mobsacB_proB’電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入鈍齒棒桿菌，經(jīng)1800V,5ms電擊后涂布于含有LBG+Km固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)24 36h，第一次同源重組轉(zhuǎn)化子長出。再分別將目標(biāo)轉(zhuǎn)化子在含蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫二次重組篩選，最終在LBG平板上進(jìn)行劃線分離并挑取多個轉(zhuǎn)化子，通過PCR對發(fā)生第二次同源重組的菌株進(jìn)行回復(fù)野生型/基因缺失型的鑒定。(4)發(fā)生二次同源重組后缺失了 200_300bp的AproB具有約50%的幾率替代原基因組中具有功能的proB，因此，在上述LBG平板中隨即挑取轉(zhuǎn)化子，提取染色體為模板，以目標(biāo)基因proB的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。經(jīng)PCR驗證，第
3、5泳道對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子為基因缺失型鈍齒棒桿菌AproB。


圖1含同源臂片段的缺失型基因proB’的PCR擴(kuò)增2 二次重組菌株的基因缺失型和回復(fù)野生型轉(zhuǎn)化子proB PCR鑒定泳道說明I:DL2000marker ；2,4:回復(fù)突變型proB ；3, 5:基因缺失型AproB ；6:λDNA/Hind III marker圖3重組鈍齒棒桿菌與原始對照菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸比較分析(A)原始對照菌株(B)重組鈍齒棒桿菌AproB
具體實施例方式實施例1:重組鈍齒棒桿菌中谷氨酸激酶酶活力的檢測隨機(jī)選擇上述驗證的proB基因缺失型轉(zhuǎn)化子在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體經(jīng)超聲波破碎后測定胞內(nèi)谷氨酸激酶酶活:以L-谷氨酸為底物，在pH 7.0的0.25mL 體系中加入 50mM L-谷氨酸，IOmM ATP,20mM MgCl2, IOOmM 鹽酸羥氨，50mM Tris，加Λ 200 μ L粗酶液，充分混勻后置于37°C，30min反應(yīng)。加入含三氯乙酸的FeCl3反應(yīng)終止液lmL，3，500g低速離心后取上清液于535nm下測定Y -谷氨酸氧廂酸的吸光值。IU定義為每分鐘生成Iymol氧肟酸鹽所需的酶量。與對照菌鈍齒棒桿菌SYPA 5-5相比，轉(zhuǎn)化子粗酶液中基本測不到ProB編碼的谷氨酸激酶酶活力，確定了重組菌SYPA 5-5 AproB失去由谷氨酸激酶催化谷氨酸磷酸化合成L-谷氨酸-5-P的功能。實施例2:重組鈍齒棒桿菌Λ proB轉(zhuǎn)化子搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，玉米漿 20，尿素 1.5，KH2PO4I, (NH4)2S0420,MgSO4.7H20 0.5 ;pH 為 7.0 7.2，裝液量 30mL/250mL, 121°C滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖150(分消)，玉米漿40，生物素8X10_5，L-組氨酸5X 1θΛ MnSO4.H2O 0.02，(NH4) 2S0420, MgSO4.7H20 0.5，KH2PO4L 5，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02，CaC0330(分消滅菌)。pH 為 7.0 7.2，裝液量 25mL/250mL, 121°C滅菌 IOmin0將上述經(jīng)酶活驗證的重組菌鈍齒棒桿菌SYPA 5-5 Δ proB進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，從新鮮活化的斜面培養(yǎng)基中挑取一滿環(huán)鈍齒棒桿菌(對照菌及重組菌)于種子培養(yǎng)基中(30mL/250mL)，30°C，220r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)14 16h,至OD = 0.6時，以5%接種量，發(fā)酵96h其L-精氨酸產(chǎn)量比對照菌株鈍齒棒桿菌SYPA 5-5顯著提高，提高率為20.4%。實施例3:重組鈍齒棒桿菌Λ proB轉(zhuǎn)化子5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酸種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，玉米漿 20，尿素 1.5，KH2PO4I, (NH4)2S0420,MgSO4.7H20 0.5 ;pH 為 7.0 7.2，裝液量 30mL/250mL, 121°C滅菌 20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖150(分消)，玉米漿40，生物素8X10_5，L-組氨酸5X 1θΛ MnSO4.H2O 0.02，(NH4) 2S0420, MgSO4.7H20 0.5，KH2PO4L 5，F(xiàn)eSO4.7H20 0.02，CaC0330(分消滅菌)。pH 為 7.0 7.2，裝液量 25mL/250mL, 121°C滅菌 IOnW93]。5L自控發(fā)酵罐分批發(fā)酵條件:5L發(fā)酵罐中裝液量3L，接種量采用5%，30°C，通氣量為3L/min，自動流加氨水以控制pH在6.8，采用工廠發(fā)酵L-精氨酸專用消泡劑，溶氧自動控制，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min,發(fā)酵96h。結(jié)果表明:鈍齒棒桿菌中proB基因的功能缺失，使得脯氨酸合成的能力大大降低，發(fā)酵液中脯氨酸的積累量只有對照菌株的2.7%，同時提高了糖耗，使得精氨酸產(chǎn)量提高，其中精氨酸產(chǎn)量提高了 13.6%。經(jīng)氨基酸分析儀測定其發(fā)酵液中各游離氨基酸含量，如圖3、表I所示。表I發(fā)酵液中殘?zhí)?、生長量和各氨基酸含量分析
權(quán)利要求
1.一種脯氨酸合成關(guān)鍵酶缺失型基因λ pr0B，其特征是:以保藏編號為CCTCC NO:M208133的C.crenatum SYPA菌株DNA為模板，通過重疊PCR法將獲得來自鈍齒棒桿菌SYPA的脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因ProB中的了 352個核苷酸堿基缺失；重疊PCR的引物序列為:第一輪PCR引物序列:PproBF EcoRI 5’ -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGCPproBR SalI 5’ -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC第二輪PCR引物序列:PAproB R 5’ -CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATCPAproB F 5’ -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT。
2.一株重組鈍齒棒桿菌SYPA 5-5 Λ proB，其特征是將權(quán)利要求1所述的缺失AproB基因利用電轉(zhuǎn)化的方法通過同源重組整合至鈍齒棒桿菌SYPA 5-5染色體中獲得。
3.一種利用權(quán)利要求2中所述的重組鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸的方法，其特征在于該菌株的脯氨酸的合成顯著降低，L-精氨酸的產(chǎn)量顯著提高。
全文摘要
L-精氨酸是人體和動物體內(nèi)的半必需堿性氨基酸，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。本發(fā)明主要針對精氨酸合成的競爭旁路代謝關(guān)鍵酶基因進(jìn)行敲除。以鈍齒棒桿菌基因組為模板，分別以proB基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用重疊PCR擴(kuò)增獲得缺失型基因proB’。連接重組質(zhì)粒pK18mobsacB-proB’電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入鈍齒棒桿菌，篩選二次同源重組基因缺失型菌株。將上述重組菌鈍齒棒桿菌ΔproB進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，鈍齒棒桿菌中proB基因的功能缺失，使得脯氨酸合成的能力大大降低，同時提高了糖耗，發(fā)酵液中脯氨酸的積累量只有對照菌株的2.7％，從而使目標(biāo)氨基酸L-精氨酸產(chǎn)量提高。
文檔編號C12R1/15GK103173466SQ20121021042
公開日2013年6月26日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者饒志明, 許正宏, 徐美娟, 孫紅梅, 竇文芳 申請人:江南大學(xué)