通過生物技術(shù)方法獲取低聚糖的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過生物技術(shù)手段獲取低聚物，改進生物技術(shù)方法來生產(chǎn)在母乳中特定存在的低聚糖，具體地是從乳糖-N-丙糖生產(chǎn)低聚糖乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，其中乳糖-N-丙糖來源于富含適于用其前體：乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺生產(chǎn)乳糖-N-丙糖的酶的培養(yǎng)上清液。
【專利說明】通過生物技術(shù)方法獲取低聚糖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過生物技術(shù)手段獲取存在于母乳中的特定低聚糖，尤其是乳糖 _N_ 新四糖(lacto-N-neotetraose)和乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose)。
【背景技術(shù)】
[0002]低聚糖為天然存在于水果、蔬菜、人乳以及蜂蜜中的短鏈碳?xì)浠衔?聚合度為
2-7)。由于其生物及生理特性，它們作為功能成分尤其是其益生元活性被認(rèn)為是非常重要的。
[0003]存在于人乳中的低聚糖具有重要的生物作用，因為它們可能與新生兒的抗感染有關(guān)。它們通過阻止某些病原體(病毒和細(xì)菌)粘附在腸的上皮組織，引發(fā)局部免疫系統(tǒng)，充當(dāng)益生元的作用。
[0004]母乳中包括130種以上不同的低聚糖，是第三豐富的組分。母乳哺育進行一年后其中的低聚糖含量低于初始數(shù)星期的一半。測量發(fā)現(xiàn)低聚糖在不同動物乳汁中的質(zhì)量和數(shù)量有所不同。人乳低聚糖中最豐富的單體為D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-海藻糖、N-乙酰甘露糖胺丙酮酸。所有的這些單體通過加成L-海藻糖和/或唾液酸基團而被修飾，分別生成所謂的中性或酸性低聚糖，其中的150-200已經(jīng)被描述。隨著母乳哺育進行，它們在乳汁中的含量 下降，然而，似乎在頭幾個月具有相關(guān)生理作用。
[0005]乳糖通過糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)形成最重要的中性低聚糖，例如人乳中形成的最豐富的中性低聚糖是乳糖-N-丙糖(lacto-N-triose)和乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose)以及乳糖-N-巖藻五糖(lacto-N-fucopentaose)的不同異構(gòu)體。母乳中未被消化的低聚糖部分刺激了結(jié)腸中雙歧桿菌的生長，并且這些菌落對保護預(yù)防腸道感染有益。因此，低聚糖是先天免疫系統(tǒng)的主要成分，通過母乳哺育過程媽媽們保護她們的孩子遠(yuǎn)離病原體(腸道病原體或作用其他部分的病原體)。
[0006]值得注意的是，在山羊奶，綿羊奶以及牛奶中沒有發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)品。并且，這些產(chǎn)品不存在與人造奶中，所以，向人造奶中添加它們具有明顯的社會和經(jīng)濟效益。在此意義上，對于它們的生產(chǎn)和隨后的應(yīng)用有四種可能。
[0007]i )第一種可能是從人奶中純化它們。這個選擇是不可取的，因為缺乏原材料。
[0008]ii)第二種可能是化學(xué)合成。雖然這是可能的，但它們的成本高且效率低。
[0009]iii)第三種選擇是以使用酶為基礎(chǔ)通過乳糖生產(chǎn)不同的低聚糖。該計劃是基于使用來自不同來源(微生物或哺乳動物)的不同的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選使用具有更高效率的糖基轉(zhuǎn)移酶，然而由于它們中許多來源于動物而太過昂貴。因此，在不同微生物(大腸桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母)中表達基因編碼這樣的一種酶的工作已經(jīng)實施，其目的是過度生成它們，雖然該途徑從沒達到半工業(yè)化規(guī)模。
[0010]iv)最終，最后的計劃包括通過遺傳工程技術(shù)構(gòu)建能夠生產(chǎn)低聚糖的微生物。在此意義上，通過表達腦膜炎雙球菌的三個基因取得了初步進展，在大腸桿菌菌株中編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、半乳糖轉(zhuǎn)移酶以及唾液酸轉(zhuǎn)移酶，其中乳糖轉(zhuǎn)移者的表達即編碼基因可以通過甘油誘導(dǎo)。雖然該方法取得成功，將獲得產(chǎn)品用于嬰兒食品的銷售是復(fù)雜的，因為致病的細(xì)菌是基因的供體和受體且獲得的材料是產(chǎn)生于要求特殊標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因生物體。當(dāng)在發(fā)酵罐中生長且透性化，不同的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌能夠生產(chǎn)不同的酶活性體，并且涉及合成感興趣的低聚糖的細(xì)胞前體也已經(jīng)成功構(gòu)建。所述方法涉及四種不同的微生物使得其工業(yè)應(yīng)用的可能困難。
[0011]關(guān)于該領(lǐng)域現(xiàn)狀在本文件中進行描述，較早方法如JP11253191A，提供了一種酶促合成乳糖-N-四糖的方法，適合以任何劑量用于食品及藥用產(chǎn)品中。該方法包括在β_1、
3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的存在下UDP-葡萄糖酰胺(UDP-GlcNac)在乳糖上反應(yīng)，合成乳糖-N-丙糖，隨后在β -半乳糖苷酶存在下與半乳糖結(jié)合，因此得到乳糖-N-四糖。
[0012]文件US2007/0275881 Al涉及藥劑組分及其在治療傳染性疾病中的用途。這些組分包括綁定在感興趣的低聚糖(例如乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖)上的多肽。該文件描述這些低聚糖是在相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶存在下在酵母菌中獲取。
[0013]發(fā)明文件US7521212 BI涉及通過微生物方法生產(chǎn)低聚糖，例如在乳糖和葡萄糖酰胺以及酶β-1-3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和β-1-4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的存在下,得到乳糖-N-新四糖。其也描述了獲取中間產(chǎn)物乳糖-N-丙糖。
[0014]文件US 6204431 BI涉及制造非人類轉(zhuǎn)基因動物能夠在其乳汁中生產(chǎn)某些低聚糖。在所述文件中為了發(fā)明描述的目標(biāo)，選擇來自真核或原核生物的例如乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因序列，并且插入到胚胎的前核中從而獲得轉(zhuǎn)基因動物。
[0015]文件ES2162619 Τ3描述了三步驟獲得低聚糖組分的設(shè)備和方法，該方法使用人類葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，并且文件US 5879912描述了一種合成低聚糖、多糖、糖脂和糖蛋白的方法。它描述了在兩個細(xì)胞培養(yǎng)物提供兩種酶的條件下合成乳糖-N-新四糖，其中兩種酶具有糖基 轉(zhuǎn)移酶活性使得在UPD-葡萄糖酰胺和乳糖的存在下形成β -半乳糖1-4葡萄糖和β -葡萄糖酰胺1-3鍵。
[0016]發(fā)明目標(biāo)
[0017]本發(fā)明涉及改進生物技術(shù)生產(chǎn)方法來生產(chǎn)在母乳中特定存在的低聚糖，具體地是從乳糖-N-丙糖生產(chǎn)低聚糖乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，其中乳糖-N-丙糖來源于富含適于用其前體，乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺，生產(chǎn)乳糖-N-丙糖的酶的培養(yǎng)上清液。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1表不低聚糖:乳糖-N-丙糖、乳糖-N-新四糖,乳糖-N-四糖的酶促形成。
[0019]圖2表示平板檢測N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶的活性(實施例3)。
[0020]圖3表示溫度和培養(yǎng)基對于黑曲霉nagA酶活性的影響，其中黑曲霉nagA酶從釀酒酵母(S.cerevisiae)重組菌的液體培養(yǎng)基中重新獲得(實施例4)。
[0021]圖4表示在釀酒酵母或畢赤酵母(P.pastoris)重組體用于嗜熱鏈球菌(S.thermophilusMacZ酶的液體培養(yǎng)基(A)或細(xì)胞上清液(B)中對β-半乳糖苷酶活性的測定(實施例5)。
[0022]圖5表示在釀酒酵母中過度表達的嗜熱鏈球菌IacZ的亞細(xì)胞定位(實施例6)。
[0023]圖6表示在嗜熱鏈球菌IacZ基因的Ε.大腸桿菌轉(zhuǎn)化株中平板檢測β -半乳糖苷酶的活性體(實施例7)。[0024]圖7表示在培養(yǎng)基中獲取乳糖-N-丙糖的過程(實施例8)。
[0025]圖8表示底物濃度對培養(yǎng)基中體內(nèi)生產(chǎn)乳糖-N-丙糖的影響(實施例9)。
[0026]圖9表不在兩個連續(xù)步驟中獲取乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖的過程(實施例10)。
[0027]發(fā)明詳述
[0028]本發(fā)明獲得的低聚糖是四糖類乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖。這些四糖存在于母乳中并且通過N-乙酰氨基葡萄糖(β-1-3鍵)加成在一個單元的乳糖上產(chǎn)生乳糖-N-丙糖。乳糖_Ν_新四糖(β -1-4鍵)和乳糖-N-四糖(β -1-3鍵)可以通過乳糖-N-丙糖在β -半乳糖基轉(zhuǎn)移酶存在下獲得。因此，該四糖依靠兩個連續(xù)行為制得，即β -(I, 3)-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶行為，然后是(1，3)_或β- (1，4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶行為。
[0029]所感興趣的低聚物，即乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖以及作為中間體的乳糖-N-丙糖，需要遵循酶促轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的簡化方法(如圖1所示)。
[0030]生產(chǎn)乳糖-N-丙糖、乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖所需的酶是由S.釀酒酵母屬轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中的。為了使用生產(chǎn)供人類消耗的酶的微生物，必須達到在所謂的“GRAS”(通常認(rèn)為是安全的)列出的集中于這些微生物條件的一系列的法律要求，即，該微生物必須符合某些安全條例。有50種被認(rèn)可的GRAS微生物用于食品工業(yè)。在本發(fā)明中，所有編碼酶活性的基因源于GRAS微生物以防止被拒絕的問題。選擇的基因是:黑曲霉(Aspergill us niger) nagA基因和嗜熱鏈球菌IacZ基因。
[0031]在過程第一步所需酶活性已經(jīng)被證明存在于牛血清、牛初乳中，并且該酶被米曲霉(Aspergillus oryzae)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)菌的 nagA 基因編碼(兩個酶具有N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性)。
[0032]由于與葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶-編碼基因已識別的菌種(MatsUO2003)相似，公眾可以得到其序列及其GRAS狀態(tài)，黑曲霉被選為實現(xiàn)本發(fā)明目標(biāo)的酶活性體的來源。必須表明的是，即使黑曲霉菌種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種活性體，相應(yīng)的基因的基因序列并未被識別。因此，為了本發(fā)明的目的，有必要首先識別黑曲霉中的基因，該基因與構(gòu)巢曲菌的nagA基因同源。黑曲霉nagA基因的核昔酸序列如序列表編號I所不。
[0033]第二步通過半乳糖基轉(zhuǎn)移酶實施的。該行為已經(jīng)在一些細(xì)菌和真菌半乳糖苷酶(絲狀真菌米曲霉，兩歧雙歧桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌)中證明。
[0034]這種情況下，編碼β -半乳糖苷酶的基因(IacZ)的嗜熱鏈球菌的酶被選為半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性體的來源用于實現(xiàn)本發(fā)明目的的方法，因為所述基因在其他乳酸菌中編碼這些行為，并且已知嗜熱鏈球菌能夠通過作用于乳糖而催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(Smartl991, Reuter etal.1999)。IacZ基因在嗜熱鏈球菌中被識別，并且如序列表編號2所示。
[0035]另一方面，由于釀酒酵母分泌克隆酶到液體培養(yǎng)基中，有必要使用分泌信號肽來融合它們。對于釀酒酵母的三種最廣泛研究的分泌物信號肽是α-因子分泌物信號肽(Brake et al.1989),序列表編號3, SUC2轉(zhuǎn)化酶分泌物信號妝(Perlman et al.1982),序列表編號4，和PH05酸性磷酸酶分泌物信號肽(Arima et al.1983)序列表編號5。
[0036]因此，編碼酶nagA和IacZ的基因可以在釀酒酵母轉(zhuǎn)化株中表達，釀酒酵母轉(zhuǎn)化株可以通過插入本發(fā)明的DNA到兩個載體，并將所述載體引入到寄主中獲得。早期釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法涉及去除細(xì)胞壁來生產(chǎn)去壁細(xì)菌細(xì)胞，用鈣和聚乙烯乙二醇處理去壁細(xì)菌細(xì)胞可以吸收DNA(Hinnen et al.1978)。該轉(zhuǎn)化株被種植在等壓選擇性培養(yǎng)基上進行細(xì)胞壁再生。后來發(fā)展了很多實踐方法使用經(jīng)受鋰離子的處理完整細(xì)胞(Ito et al.1983)。該方法迄今使用，雖然其比前述方法效率低；然而，使用二甲基亞砜的修飾使得轉(zhuǎn)化頻率增長高達25倍。第三種方法，近來使用電穿孔獲得非常高的效率(Meilhoc et al.1990)。
[0037]為本發(fā)明目的而使用的載體可以是任何在合適的寄主中能夠表達編碼酶基因的那些。所述載體例如可以包括:質(zhì)體、噬菌體、黏質(zhì)體載體。所述載體通常包括調(diào)節(jié)因子例如啟動子；它們必須在離啟動子短距離內(nèi)具有一個區(qū)域來提供基于核糖體轉(zhuǎn)錄的入口 ；并且最后它們必須包含一個復(fù)制來源允許其在寄主中增殖。此外，選擇的載體對于每個蛋白質(zhì)具有不同的篩選標(biāo)記基因用于解救不同的營養(yǎng)缺陷體，其可以一步內(nèi)同時引入一個載體并在該寄主中篩選。最廣泛用于篩選標(biāo)記釀酒酵母的是LEU2、TRPU URA3和HIS3，它們分別用于同亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶和組氨酸營養(yǎng)缺陷體相應(yīng)的突變菌株中(Beggsl978; Rose et al.1984; Struhl et al.1980; Tschumper et al.1980)。這些營養(yǎng)缺陷體菌株是可以得到的，并且它們的篩選要求使用不包含相關(guān)的營養(yǎng)物的最小生長媒介。以下類型培養(yǎng)基的集散地可以作為獲取所述菌株的來源被提及:美國典型培養(yǎng)物保藏中心的酵母基因保藏中心(Yeast Genetics Stock Culture Center of the American TypeCulture Collection) (http://www.atcc.0rg/SearchCatalogs/YeastGeneticStock.cfm.),EUR0SCARF(http://www.un1-frankfurt.de/fbl5/mikro/esuoscarf/col_index.html),基因研究所(Research Genetics) (http://www.resgen/products/YEASTD.php3),酵母菌培養(yǎng)物國家中心(National Collection of Yeast Cultures) (http://www.ncyc.c0.uk/Sacchgen.html.), Centraalbureau voor Schimmelcultures(http://www.cbs.knaw.nl/yeast/WebC.ASP)以及酵母屬釀酒酵母培養(yǎng)物中心(Culture Collection ofSaccharomyces cerevisiae) (http://www.natur.cun1.cz/fccm/federacs.htm#dgub)。
[0038]在以下提及的寄主可以用于引入包含本發(fā)明的DNA的表達載體:酵母菌、細(xì)菌、昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞、哺乳動物等。優(yōu)選使用釀酒酵母屬酵母菌，但是裂殖酵母、畢赤酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌也同樣理想。
`[0039]為了檢測nagA基因在寄主中的表達，可以使用合成基質(zhì)甲基傘基(MU) -N-乙酰氨基葡萄糖或P-硝基苯基(PNP) -N-乙酰氨基葡萄糖，通過平板檢測，或在液態(tài)介質(zhì)中，來檢測在所獲取的轉(zhuǎn)化株中表達的酶的水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性(Borooah etal.1961)。在平板檢測中，作為水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的結(jié)果，甲基傘型酮的形成通過紫外燈下熒光分析進行定性檢測。甲基傘型酮是熒光化合物，在366nm紫外燈的照射下發(fā)出熒光。液態(tài)分析可以通過分析在405nm處的吸收度來定量活性，這是由于作為水解的N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶活性的結(jié)果，所釋放的有色化合物P-硝基酚在堿性溶液中吸收405nm波長。
[0040]相似地，為了鑒定在寄主中IacZ基因的表達，分別使用合成基質(zhì)甲基傘型基(MU)-半乳糖或P-硝基苯基(PNP)-半乳糖皮蒽，通過平板檢測或在液體培養(yǎng)基中，合理分析獲取轉(zhuǎn)化株中表達的酶的水解半乳糖苷酶活性(Maruhnl976)。在平板檢測中，作為水解N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的結(jié)果，甲基傘型酮的形成通過紫外燈下熒光分析進行定性檢測。甲基傘型酮是熒光化合物，在366nm紫外燈的照射下發(fā)出熒光。液態(tài)分析可以通過分析在405nm處的吸收度來定量活性，這是由于作為水解的N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶活性的結(jié)果，所釋放的有色化合物P-硝基酚在堿性溶液中吸收405nm波長。
[0041]平板檢測可以快速篩選具有更高基因表達的克隆體。另一方面，液體分析可以定量活性和分泌物，因為在培養(yǎng)基中的和在單獨細(xì)胞中的活性是各自被分析的。
[0042]一旦鑒定了篩選的重組酶的活性，有可能同時在相同的菌株中使用解救不同營養(yǎng)缺陷體的質(zhì)體來表達它們。使用的質(zhì)體可以是屬于Mumberg等人描述的那些收集的(1995)，它們由一些表達載體與四個啟動子、兩個復(fù)制來源以及四個不同的標(biāo)記物結(jié)合形成。通過使用這些載體，能夠控制不同程度的基因表達，控制轉(zhuǎn)錄水平以及重組基因的復(fù)制數(shù)量。
[0043]一旦篩選了每個酶具有更大活性的轉(zhuǎn)化株或在相同菌株具有同步活性的轉(zhuǎn)化株，能夠使它們生長到較高濃度獲取具有高的酶促活性的培養(yǎng)基或大量具有細(xì)胞內(nèi)活性的細(xì)胞，前提是該酶不是被分泌出的。這些培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物可以直接作為體內(nèi)反應(yīng)床使用，來通過它們的前體細(xì)胞乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖獲取感興趣的低聚糖，而無需純化相應(yīng)的蛋白質(zhì)。或者，酶可以被純化以用來獲得感興趣的低聚糖。
[0044]因此，最終獲得感興趣的低聚糖包括兩個階段，第一階段在43_47°C下持續(xù)70_74個小時，優(yōu)選在45°C持續(xù)72小時，在該階段使用培養(yǎng)基或者細(xì)胞提取物(前提是該蛋白質(zhì)分別是分泌的或者不是分泌的)或者純化蛋白的nagA活性，通過其前體乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖生成乳糖-N-丙糖。當(dāng)這個階段結(jié)束，純化乳糖-N-丙糖或者繼續(xù)進行第二階段生成乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。第二個階段在45°C下持續(xù)36小時，使用液反應(yīng)培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物的IacZ活性，取決于是否有重組酶被分泌，或有適當(dāng)?shù)募兓鞍踪|(zhì)，在第二階段中由第一階段得到的液體反應(yīng)基中的乳糖-N-丙糖和半乳糖生成的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。
[0045]在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，獲取乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖的微生物的方法被實施，使得從由富含nagA活性的培養(yǎng)基和具有IacZ活性的細(xì)胞提取物，源自表達且分泌nagA和表達且不分泌IacZ的單一菌株，經(jīng)兩連續(xù)步驟，在體內(nèi)所得的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖為l-100g/l反應(yīng)基。
[0046]為達到本發(fā)明的目的，也計劃可能通過使用同時存在于相同培養(yǎng)基或相同具有IagZ活性的細(xì)胞提取物的兩種酶的活性來實施該反應(yīng)，該細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物源自表達且分泌nagA和IacZ的單一菌株。
[0047]最后，根據(jù)本發(fā)明獲取的低聚物通過本領(lǐng)域現(xiàn)今知悉的普通技術(shù)從反應(yīng)介質(zhì)中提取和純化。在木炭上色譜分離(Whistler et al.1950)是優(yōu)選使用的低聚物純化技術(shù)。
[0048]一旦純化，這些低聚物作為食品材料組成食品產(chǎn)品用于消費。
實施例
[0049]實施例1:黑曲霉nagA基因的核苷酸序列(圖2)
[0050]在黑曲霉中編碼N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性的基因通過與構(gòu)巢菌nagA基因同源而被識別。所述參照基因的序列可獲得自，并被注釋，數(shù)據(jù)庫(http://www.broad, mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group) (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/viewer/fcgi?db=protein&id=10039359)。它們表達得到的蛋白質(zhì)與序列表編號6 —致。
[0051]比較前述氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(http://genome.1gi_ps1.0rg/Asonil/Asonil.home, html)中得到的黑曲霉基因組，至少有兩個可能的基因與構(gòu)巢菌nagA基因直系同源。這兩個基因中，序列表編號I的基因序列是由它的更大同源性而被克隆的，并且在數(shù)據(jù)庫中作為編碼假定的N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性來描述的。通過兩個基因編碼的氨基酸序列校準(zhǔn)顯示71.3%同源。按照Mullis等(1986)描述的方法和材料，通過來自黑曲霉的DNA基因組的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進行克隆。
[0052]實施例2:嗜熱鏈球菌的IacZ基因的核苷酸序列
[0053]編碼嗜熱鏈球菌β -半乳糖苷酶的IacZ基因的序列被識別，并且可在數(shù)據(jù)庫中得至|J，且其與序列表編號2—致。蛋白質(zhì)描述為大約124kDa的四聚物。IacZ基因按照Mullis等(1986)描述的方法和材料，通過來嗜熱鏈球菌的DNA基因組的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進行克隆。
[0054]實施例3:平板檢測在釀酒酵母中過度表達的黑曲霉nagA基因的N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性體
[0055]由質(zhì)體p415GPD-nagA-LEU2 在單倍體菌株 BY4741 (MATaHIS3DILEU2D0MET15D0URA3D0)中生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化株，在富含YI3D的介質(zhì)中生長，介質(zhì)由10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.), 20g/l的細(xì)菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源,使用2%瓊脂(Pronadisa)凝固配制而成。
[0056]含有濃度為ImM的甲基傘型(MU)N-乙酰-氨基葡萄糖基質(zhì)的在45mM的檸檬酸緩沖液中的液化溶液，PH值為4.8，1%瓊脂糖，被傾倒到平板上，在50°C下遮光培育30分鐘后在紫外燈下觀察。N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性產(chǎn)生熒光物質(zhì)甲基傘型酮，當(dāng)其被366nm紫外燈照射發(fā)出熒光。
[0057]如圖2所示，相對于不表達nagA (B)的對照組菌株，在那些能夠分泌nagA酶(A)的克隆體周圍發(fā)現(xiàn)熒光光 暈。
[0058]實施例4:溫度和培養(yǎng)基對于黑曲霉nagA酶活性的影響，其中黑曲霉nagA酶從釀酒酵母(S.cerevisiae)重組菌株的培養(yǎng)基中重新獲得
[0059]為了優(yōu)化在釀酒酵母中nagA基因的表達，進行了介質(zhì)組分和/或生長溫度是否能夠影響酶表達和/或分泌的研究。
[0060]為了該目的，使用質(zhì)體p415GPD-nagA-LEU2，通過轉(zhuǎn)化單倍體菌株BY4741 (MATaHIS3DILEU2D0MET15D0URA3D0)生產(chǎn)重組菌株。轉(zhuǎn)化株在合成的SD介質(zhì)中篩選，SD介質(zhì)基于6.7g/l的沒有氨基酸的酵母氮基(Difco)并補充20g/l的葡萄糖(Panreac QuimicaS.A.U.)作為碳源和200mg/l的組氨酸(Merck),尿嘧唳(Calbiochem)以及蛋氨酸(Fluka)
作為所需營養(yǎng)。
[0061]首先，細(xì)胞在最小篩選介質(zhì)和肥沃介質(zhì)中平行培養(yǎng)?；?.7g/l的沒有氨基酸的酵母氮基(Difco)并補充20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源和200mg/I的組氨酸(Merck),尿喃唳(Calbiochem)以及蛋氨酸(Fluka)作為所需營養(yǎng)合成SD介質(zhì)作為最小介質(zhì)；使用10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.)，20g/l的細(xì)菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源配制YPD作為肥沃介質(zhì)。
[0062]在兩種介質(zhì)中生長的菌株產(chǎn)生的培養(yǎng)基用于N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性的檢測，該檢測在液體介質(zhì)中使用P-硝基苯基(PNP) -N-乙酰-氨基葡萄糖作為反應(yīng)基質(zhì)。為了該目的，使用小份的每個液體培養(yǎng)基并且用存在基質(zhì)的PH值為4.8的濃度為0.09M檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液稀釋，在30°C下培育30分鐘。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其釋放P-硝基酚，通過測定在405nm處的吸光度進行定量，p_硝基酚為顏色化合物，在堿性溶液中在波長405nm處有吸收，作為相同結(jié)果。
[0063]如圖3中觀察的，在肥沃介質(zhì)中生長的菌株的培養(yǎng)基上清液中活性是在最小篩選介質(zhì)中生長的菌株的培養(yǎng)基上清液中活性的幾乎三倍，清楚的表明培養(yǎng)介質(zhì)對于nagA酶表達和/或分泌的影響。
[0064]對于生長溫度，篩選的轉(zhuǎn)化株分別在三個不同溫度28，30和32°C下在YPD介質(zhì)中平行生長，YPD介質(zhì)使用10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.), 20g/l的細(xì)菌蛋白胨(Pronadisa)和20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源配制。該液體培養(yǎng)基以其在液體介質(zhì)中的水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性進行分析。為了該目的，使用小份的每個液體培養(yǎng)基并且用存在基質(zhì)P-硝基苯基(PNP) -N-乙酰-氨基葡萄糖的pH值為4.8的濃度為0.09M的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖溶液稀釋，在30°C下培育30分鐘。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其釋放P-硝基酚，通過測定在405nm處的吸光度進行定量，P-硝基酚為顏色化合物，在堿性溶液中在波長405nm處有吸收，作為相同結(jié)果。
[0065]如圖3所示，隨著生長溫度的下降，在培養(yǎng)基上清液中的重新獲得的活性逐漸增加，生長溫度從32降到28°C活性體增大50%。因此，對于nagA的生長和分泌而言，26-30°C是優(yōu)選的生長溫度。
[0066]如圖4所示，當(dāng)nagA轉(zhuǎn)化株在肥沃介質(zhì)中生長時，在液體培養(yǎng)基中重新獲得的N-乙酰-氨基葡萄 糖苷酶活性高達3倍，當(dāng)生長溫度進一步降低到28°C時，重新獲得的活性多于4倍。
[0067]實施例5:測定在釀酒酵母和畢赤酵母中過度表達的嗜熱鏈球菌IacZ基因的g-半乳糖苷酶活性
[0068]分別使用質(zhì)體p416GPD-lacZ_URA3來轉(zhuǎn)化單倍體菌株BY4741 (MATaHIS3DILEU2D0MET15D0URA3D0)并且使用質(zhì)體pPICzaB_lacZ來轉(zhuǎn)化野生型單倍體菌株X-33來生產(chǎn)釀酒酵母和畢赤酵母的重組菌株。釀酒酵母轉(zhuǎn)化株在合成的SD介質(zhì)中篩選，SD介質(zhì)的合成基于6.7g/l的沒有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并補充20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源和 200mg/l 的組氨酸(Merck),亮氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作為所需營養(yǎng)。畢赤酵母轉(zhuǎn)化株在YPDS介質(zhì)中篩選,YPDS介質(zhì)的配方為IOg/I的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.), 20g/l的細(xì)菌蛋白胨(Pronadisa), 20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源,IM 的山梨醇(Applichem VffR)和 100 μ g/ml 的抗生素 Zeocin (Invivogen)。
[0069]它們在指定的媒介中生長，并且決定了在培養(yǎng)基和在細(xì)胞上清液中的水解半乳糖苷酶活性。為了該目的，指定數(shù)量的培養(yǎng)基或細(xì)胞上清液用PH值為7的有基質(zhì)P-硝基苯基(PNP)-半乳糖皮蒽存在下濃度為IOOmM的磷酸鹽緩沖液稀釋，在55°C下培育30分鐘。水解β_半乳糖苷酶活性由于其釋放P-硝基酚，通過測定在405nm處的吸光度進行定量，P-硝基酚有顏色在堿性溶液中在波長405nm處有吸收，作為相同結(jié)果。
[0070]如圖4所示，在培養(yǎng)基上清液中沒有檢測到β -半乳糖苷酶活性。也沒有檢測到畢赤酵母的重組菌株或嗜熱鏈球菌(Α)。在細(xì)胞上清液中活性體的水平在兩種生物體中是相近的(B)。
[0071]實施例6:嗜熱鏈球菌IacZ重組體的IacZ在釀酒酵母中的亞細(xì)胞定位
[0072]使用質(zhì)體p416GPD-lacZ_URA3來轉(zhuǎn)化單倍體菌株BY4741 (MATaHIS3DILEU2D0MET15D0URA3D0)生產(chǎn)釀酒酵母的重組菌株，并且釀酒酵母轉(zhuǎn)化株在合成的SD介質(zhì)中篩選，SD介質(zhì)的合成基于6.7g/l的沒有氨基酸的酵母含氮堿基(Difco)并補充20g/l的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源和200mg/l的組氨酸(Merck),亮氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作為所需營養(yǎng)。
[0073]重組體在肥沃YPD介質(zhì)中生長,YPD介質(zhì)由10g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie
S.A.), 20g/l 的細(xì)菌蛋白胨(Pronadisa)，20g/l 的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源在28°C下配制。分開三個具有相同細(xì)胞數(shù)量的樣本:準(zhǔn)備完整細(xì)胞的懸浮液，其中一個用于分析細(xì)胞壁中的活性；樣本中的另一個通過使用3mg/ml的裂解酶20T(Seikagaku)在37°C下處理15分鐘制備原生質(zhì)體，來評定細(xì)胞膜中的IacZ活性；最后，第三個樣本機械細(xì)胞溶解并且制備細(xì)胞提取物評定細(xì)胞質(zhì)中的IacZ活性。三個樣本在相同的體積下準(zhǔn)備的。
[0074]使用每個樣品中的一份來實施測定液體介質(zhì)中的水解半乳糖苷酶活性的實驗，通過用PH值為7的有基質(zhì)P-硝基苯基(PNP)半乳糖皮蒽存在下濃度為IOOmM的磷酸鹽緩沖液稀釋每個樣品，并且在55°C下培育30分鐘。水解β_半乳糖苷酶活性體由于其釋放P-硝基酚，通過測定在405nm處的吸光度進行定量，p_硝基酚有顏色在堿性溶液中在波長405nm處有吸收,作為相同結(jié)果。
[0075]如圖5中觀察的，重新獲得的活性在細(xì)胞溶液物中是細(xì)胞壁中的3倍多。來自制備的原生質(zhì)體的細(xì)胞膜中極其少量的檢測到活性。因此，在這種重組體中的IacZ活性大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中且小部分保留在細(xì)胞壁中。
`[0076]實施例7:平板檢測在大腸桿菌中過度表達的嗜熱鏈球菌IacZ基因的β _半乳糖苷酶活性體
[0077]使用質(zhì)體p416GPD_lacZ URA3,通過轉(zhuǎn)化菌株 DH5 a (fhuA2 Δ (argF-lacZ)U169phoA glnV4 V 480 Δ (IacZ) M15gyrA96recAlrelAlendAlth1-lhsdR17)生產(chǎn)用于嗜熱鏈球菌IacZ的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株,并且在LB介質(zhì)中篩選，LB介質(zhì)由5g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.), 10g/l 的膜化蛋白腺(Scharlau Chemie S.A.), 10g/l 的氯化鈉(NaCl)和濃度為100mg/l的氨節(jié)西林(Calbiochem)配制而成.[0078]pH值為6濃度為IOOmM的1%瓊脂糖的磷酸鹽緩沖液中含有濃度為ImM的甲基傘型(MU)-半乳糖皮蒽的液化溶液，其被傾倒到感光底片上，在50°C下遮光溫育30分鐘后在紫外燈下觀察。β -半乳糖苷酶活性產(chǎn)生熒光物質(zhì)甲基傘型酮，當(dāng)其被366nm紫外燈照射發(fā)出熒光。
[0079]如圖6所示，相對于不表達nagA (B)的對照組菌株，在那些能夠分泌nagA酶(A)的克隆體周圍發(fā)現(xiàn)熒光光暈。
_0] 實施例8:從富含naRA活性的培養(yǎng)基和其前體乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖進行體內(nèi)獲取乳糖—N—丙糖
[0081]為了實施獲得乳糖-N-丙糖的反應(yīng)，使用質(zhì)體p415GPD-nagA_LEU2通過轉(zhuǎn)化單倍體菌株BY4741 (MATa HIS3DILEU2D0MET15D0URA3D0)生產(chǎn)重組菌株。轉(zhuǎn)化株在合成的SD介質(zhì)中篩選，SD介質(zhì)的合成基于6.7g/l的沒有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并補充20g/I的葡萄糖(Panreac Quimica S.A.U.)作為碳源和200mg/l的組氨酸(Merck),尿嘧唳(Calbiochem)和蛋氨酸(Fluka)作為所需營養(yǎng)。
[0082]篩選的菌株分批的在4xYPD介質(zhì)中長到0D40，4xYPD介質(zhì)由40g/l的酵母菌提取物(Scharlau Chemie S.A.), 80g/l 的細(xì)菌蛋白腺(Pronadisa)和 80g/l 的葡萄糖(PanreacQuimica S.A.U.)作為碳源在28°C下配置直至飽和。
[0083]在培養(yǎng)基上清液中nag酶的存在通過測定小份液體培養(yǎng)基中水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性而驗證，小份培養(yǎng)基用存在基質(zhì)的PH值為4.8的濃度為0.09M檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液稀釋，在30°C下培育30分鐘。水解N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶活性由于其釋放P-硝基酚，通過測定在405nm處的吸光度進行定量，p_硝基酚有顏色在堿性溶液中在波長405nm處有吸收,作為相同結(jié)果。
[0084]如圖7中統(tǒng)計的，乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖以高濃度(分別是330g/l和100g/I)隨后相繼直接加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，并且在45°C下培育72小時。過濾上清液部分并且此處存在的乳糖-N-丙糖用HPLC測定。
[0085]實施例9:基礎(chǔ)濃度對在培養(yǎng)基中體內(nèi)乳糖-N-丙糖的生產(chǎn)的影響
[0086]為了優(yōu)化體內(nèi)乳糖-N-丙糖生產(chǎn)過程，使用遞減數(shù)量的底物乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖實施上文描述的實驗。使用416g/l的乳糖和125g/l的N-乙酰-氨基葡萄糖的反應(yīng)作為參考，使用50%，33%，25%，10%和1%的底物濃度進行平行實驗。
[0087]如圖8所示 ，隨著在介質(zhì)中底物濃度的下降反應(yīng)收率有所下降。然而，該趨勢不成比例的，當(dāng)?shù)孜餄舛认陆蹈哌_50%時只丟失7%的產(chǎn)物，下降高達99%時丟失33%。
[0088]實施例10:通過兩個連續(xù)步驟從富含naRA活性和具有IacZ活性的細(xì)胞提取物的培養(yǎng)基中，在體內(nèi)獲取乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖，nagA活性和具有IacZ活性細(xì)胞提取物源自表汰目.分泌、nagA矛口表汰目.不分泌、IacZ的單一菌株
[0089]同時使用質(zhì)體p415GPD-nagA_LEU2和p416GPD-lacZ_URA4轉(zhuǎn)化單倍體菌株BY4741 (MATa HIS3DlLEU2D0METiro0URA3D0)。轉(zhuǎn)化株在合成的SD介質(zhì)中篩選，SD介質(zhì)的合成基于6.7g/l的沒有氨基酸的酵母含氮基(Difco)并補充20g/l的葡萄糖(PanreacQuimica S.A.U.)作為碳源和200mg/l的組氨酸(Merck)和蛋氨酸(Fluka)作為所需營養(yǎng)。獲得的菌株為兩種酶的重組體，只分泌nagA蛋白。這能夠在相同的單一培養(yǎng)基中分離兩種活性；nagA活性在培養(yǎng)基中富集而IacZ活性富集在細(xì)胞內(nèi)。
[0090]如圖9所示，菌株在4xYPD介質(zhì)中生長到高濃度，4xYPD介質(zhì)由40g/l的酵母提取物(Scharlau Chemie S.A.), 80g/l 的細(xì)菌蛋白腺(Pronadisa)和80g/l 的葡萄糖(PanreacQuimica S.A.U.)作為碳源在28°C下配置直至飽和。然后該細(xì)胞從培養(yǎng)基上清液中分離。乳糖和N-乙酰-氨基葡萄糖以濃度分別是330g/l和100g/l加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，并且在45°C下培育72小時。然后細(xì)胞進行細(xì)胞溶解并且準(zhǔn)備加入到反應(yīng)中的細(xì)胞分泌物，在相同溫度下再培育36小時。過濾一小部分反應(yīng)液并且通過HPLC測定存在于其中的乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖。乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖測定在反應(yīng)液中的量為3.5克每升。
[0091]參考文獻
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【權(quán)利要求】
1.一種生廣乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的方法，該方法包括使用至少一種微生物培養(yǎng)基進行反應(yīng)，該培養(yǎng)基具有從乳糖生產(chǎn)乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的酶的活性，該方法包括: a)在β- (1，3) -N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的存在下加入N-乙酰氨基葡萄糖以形成乳糖-N-丙糖，并且 b)在半乳糖轉(zhuǎn)移酶的存在下加入半乳糖以形成乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖， c)允許乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖的積累，并且 d)從所述反應(yīng)混合物中恢復(fù)乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物方法，其特征在于用于生產(chǎn)乳糖-N-丙糖和/或乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖所需的酶通過釀酒酵母屬的轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一種來自釀酒酵母屬的酵母菌攜帶了包含有序列表編號I的黑曲霉nagA基因的重組載體，該基因表達的酶具有β -1-3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物方法，其特征在于至少一種來自釀酒酵母屬的酵母菌攜帶了包含有序列表編號2的嗜熱鏈球菌IacZ基因的重組載體，該基因表達的酶具有β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于來自釀酒酵母屬的單一的酵母菌攜帶了一種或多種載體包含有序列表編號I的黑曲霉nagA基因，該基因表達的酶具有β -1-3-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性，和序列表編號2的嗜熱鏈球菌IacZ基因，該基因表達的酶具有β_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和/或β -半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性從液體培養(yǎng)基、細(xì)胞提取物或培養(yǎng)介質(zhì)中純化的酶中恢復(fù)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于該方法的所述步驟(a)在43-47°C中持續(xù)大約70-74小時。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于該方法的所述步驟(b)在45°C中持續(xù)大約72小時。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于其另外包含萃取和純化步驟Ca)中得到的乳糖-N-丙糖的步驟。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(b)中使用的β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是β -1_3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶來形成乳糖-N-四糖和/或β -1-4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶來形成乳糖-N-新四糖。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖從源自富含nagA活性的培養(yǎng)基和具有IacZ活性的細(xì)胞提取物體內(nèi)獲取，nagA活性和IacZ活性源自釀酒酵母屬的單一的酵母菌表達且分泌序列表編號I的nagA基因且表達且不分泌序列表編號2的IacZ基因。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖從源自富含nagA活性的培養(yǎng)基和具有IacZ活性的細(xì)胞提取物體內(nèi)獲取，nagA活性和IacZ活性源自釀酒酵母屬的單一的酵母菌表達且分泌序列表編號I的nagA基因并且表達且分泌序列表編號2的IacZ基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法獲取的乳糖-N-丙糖、乳糖-N-四糖和/或乳糖-N-新四糖，在食品產(chǎn)品中作為食品成 分的用途。
【文檔編號】C12R1/46GK103764835SQ201180071512
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月7日
【發(fā)明者】以斯帖·馬特恩寇·希拉, 薇若妮卡·納瓦羅·巴雷拉, 瑪利亞·恩里克·洛佩斯, 瑪爾塔·托塔哈達·塞拉, 杜尼婭·盧科維奇, 迭戈·羅德里格斯·吉梅內(nèi)斯, 丹尼爾·拉蒙·威代爾, 比阿特麗斯·阿爾瓦雷斯·佩雷斯 申請人:海羅公司