卵巢癌特異的腫瘤抗原肽及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及卵巢癌特異的腫瘤抗原肽及其制備方法，將細(xì)胞HTB161A2在RPMI補(bǔ)充性培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)收集上清液；收集0.5ml磁珠子并用包被緩沖液洗；將磁珠子重懸、過(guò)濾、洗脫，洗脫下的物質(zhì)收集在離心管中，收集濾出液，所述的濾出液即為抗原肽的溶液，本發(fā)明所用的方法是一種稱(chēng)為直接的生化方法，即用免疫親和方法從腫瘤細(xì)胞或組織中純化MHC/多肽復(fù)合分子，并從中洗脫出MHC結(jié)合的抗原肽，這些抗原肽可被潛在地用于抗體治療，或產(chǎn)生卵巢癌特異的CTLs，或制備腫瘤疫苗；也可發(fā)展出用于診斷的試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】卵巢癌特異的腫瘤抗原肽及其制備方法
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤抗原肽及其制備方法，具體涉及一種卵巢癌特異的腫瘤抗原肽及其制備方法。
[【背景技術(shù)】] [0002]在美國(guó)，卵巢癌是最常見(jiàn)的導(dǎo)致死亡的婦科癌癥。早期發(fā)病只有極小的，非特異性的甚至無(wú)任何癥狀。因此，大多數(shù)病人只能在晚期得到診斷。標(biāo)準(zhǔn)的治療手段包括侵入性的手術(shù)治療并跟隨化療。卵巢癌已有許多組織學(xué)的描述，然而，超過(guò)90%的惡性腫瘤是上皮腫瘤。每年約22，430個(gè)新的卵巢癌病例被確診。估計(jì)表明，在70名婦女中就有I名將會(huì)在她的一生中患卵巢癌。卵巢癌占所有癌癥新發(fā)病例的3.3%。研究人員正在研究金屬蛋白酶抑制劑，抗血管生成劑和其他生物導(dǎo)向療法等治療卵巢癌的新方法。這些新類(lèi)型的化合物通過(guò)切斷腫瘤的血液供應(yīng)，以及通過(guò)干擾需要癌癥的生長(zhǎng)和擴(kuò)散的蛋白質(zhì)和酶。免疫系統(tǒng)可以在卵巢癌中發(fā)揮作用。從一半以上的卵巢癌患者中觀察到，T細(xì)胞是存在于腫瘤周?chē)?Raspollini2005，2003)。晚期卵巢癌患者的腫瘤被T細(xì)胞浸潤(rùn)，相比于沒(méi)有這些腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞的患者，腫瘤被T細(xì)胞浸潤(rùn)的晚期患者有一個(gè)更好的臨床成果(Dong2006;RaSpollini2005;Zhang2003)。具體地說(shuō)，更多的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，它能夠直接識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，并增加腫瘤的上皮細(xì)胞中毒性T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞之間的比率，這些都是與提高患者的存活率相關(guān)的(Sato2005)。
[0003]免疫療法是卵巢癌的新的治療策略之一。它的目的是誘導(dǎo)或提高激活腫瘤免疫應(yīng)答的能力，與標(biāo)準(zhǔn)療法的抗腫瘤效果合為一體，延緩并可能防止疾病的發(fā)展。具體來(lái)說(shuō)，抗原特異性的主動(dòng)免疫治療目的是通過(guò)給病人設(shè)置特異的抗原特異性疫苗，來(lái)激活針對(duì)特定靶抗原的獲得性免疫系統(tǒng)?？乖且环N大分子，通常是蛋白質(zhì)或多糖，它可以刺激免疫應(yīng)答。為了獲得一個(gè)腫瘤特異性免疫應(yīng)答，免疫治療利用正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間抗原表達(dá)的差異。卵巢癌中存在許多腫瘤細(xì)胞特異性抗原，例如精子蛋白17，MAGE-1, P53，Her-2/neu。關(guān)于免疫療法的安全性的一個(gè)主要挑戰(zhàn)在于在預(yù)防自身免疫，即誘導(dǎo)免疫細(xì)胞優(yōu)先識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，但避免破壞正常的身體細(xì)胞。從理論的角度來(lái)看，其它可能的副作用包括疫苗成分的過(guò)敏反應(yīng)以及注射部位的炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)在一些免疫治療戰(zhàn)略已被用在不同的腫瘤抗原。然而，這些研究通常尚未演變成過(guò)去的I/II期臨床研究。
[0004]細(xì)胞免疫治療腫瘤治療提供了廣闊的前景，可以防止或延緩復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性疾病?；谡T導(dǎo)腫瘤特異的輔助性T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的免疫治療可能具有潛在的療效，但卵巢癌的成功細(xì)胞免疫療法仍有許多障礙。然而，更好地理解腫瘤相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制為免疫學(xué)提供了很好的前景。卵巢癌中腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的存在存活率的提高是相關(guān)的，這表明T-細(xì)胞的免疫治療可能會(huì)受益于臨床。
[0005]由于腫瘤患者的體內(nèi)環(huán)境能使耐受機(jī)制在體內(nèi)被激活，獲得性T細(xì)胞治療的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它涉及T細(xì)胞在宿主環(huán)境中的遷移，這樣有助于該類(lèi)患者群的耐受機(jī)制無(wú)法響應(yīng)。CD8+T細(xì)胞是過(guò)繼性T細(xì)胞治療的不錯(cuò)選擇，因?yàn)樗鼈兛梢栽隗w外被刺激產(chǎn)生抗原特異性的CTL。采用早期獲得性免疫療法接近于使用活化的淋巴細(xì)胞可以作為治療各種癌癥的手段(Rubin et al., Biological Approaches to Cancer Treatment.Biomodulation(Mitehell, ed.), McGraw-Hi 11 (New York), pp.379-410 (1993))。在這些早期的研究中，淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)被使用，以及晚期的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)，都能在體外被IL-2激活。表現(xiàn)出療效是模棱兩可的，然而，這些早期的對(duì)照臨床試驗(yàn)中未能顯示出一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即體外活化細(xì)胞能夠越過(guò)IL-2對(duì)黑色素瘤患者的直接作用。Fred Hutchinson癌癥研究中心的 Yee (Yee et al.，PNAS, Vol.99，pp.16168-16173，2002)以及 NCI 的 Dudley 等的研究((Dudley et al., Science, Vol.298, pp.850-854, 2002)證明了獲得性 T 細(xì)胞治療方法的潛力。這些研究涉及使用MART-UgplOO和低劑量IL-2的特定的T細(xì)胞克隆或用異源供給細(xì)胞和高劑量IL-2體外擴(kuò)增的TILs。這些研究證實(shí)，獲得性免疫療法有治療癌癥的希望，雖然由于缺乏能夠體外產(chǎn)生達(dá)到治療數(shù)目的抗原特異性CDS+CTLs的可重復(fù)方法，這種方法的全面發(fā)展受到阻礙。(Oelke et al., Nat.Med., Vol.9:619-624 (2003)).[0006]人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPCS)的使用是有前途的新方法，它可重復(fù)生成到達(dá)治療數(shù)目的抗原特異的CD8+細(xì)胞。雖然也可以使用自然產(chǎn)生的，能體外激活的原始T細(xì)胞的APCs(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞，或自體腫瘤細(xì)胞)，但由于天然APCs的MHC分子包含許多其他的多肽抗原表位，其激活的效率是低的。導(dǎo)致的結(jié)果是，可能有非常小、有選擇的抗原決定表位被遞呈。另外，大多數(shù)這些被遞呈的肽是正常的，無(wú)害的內(nèi)源性蛋白。解決這個(gè)問(wèn)題的一種更直接的方法是，特異地激活與戰(zhàn)勝疾病有關(guān)抗原決定表位的CD8+T細(xì)胞。這種方法通過(guò)人工抗原提呈細(xì)胞(aAPCs)是可行的。
[0007]一個(gè)這樣aAPC已經(jīng)利用黑腹果蠅(果蠅)胚胎細(xì)胞系被開(kāi)發(fā)出來(lái)，表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類(lèi)分子。由于果蠅缺乏先進(jìn)的免疫系統(tǒng)，即缺乏人TAP-1和TAP-2肽轉(zhuǎn)運(yùn)子同源的染色體，該染色體涉及到裝載多肽的抗原決定簇到人類(lèi)的MHC分子上。因此，轉(zhuǎn)染I類(lèi)分子和II類(lèi)分子是作為空的管道出現(xiàn)在果蠅細(xì)胞表面。通過(guò)孵育轉(zhuǎn)染MHC類(lèi)I或II類(lèi)MHC編碼表達(dá)載體的果蠅細(xì)胞與結(jié)合到特定的MHC分子的外源表達(dá)的多肽(即，腫瘤抗原的T細(xì)胞多肽表位)，所有的可用的MHC分子可能已被MHC限制性的、特定的多肽抗原決定表位所占用。特別是，高密度表達(dá)的MHC I類(lèi)分子呈現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)抗原表位，再加上關(guān)鍵的共刺激分子 B7-1 (CD80), CD70, LFA-3 (CD58)，ICAM-1 (CD54)到這些果蠅 aAPCs上，更夠在體外產(chǎn)生針對(duì)于特異多肽的，強(qiáng)有力的，自體同源的細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞(Cai etal., Tmmun01.Rev., Vol.165, pp, 249-265(1998)
[0008]細(xì)胞療法的各種改進(jìn)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)。例如，三個(gè)對(duì)晚期惡性黑色素瘤患者的臨床研究已進(jìn)行，從患者自體分離的CD8+T細(xì)胞，經(jīng)體外的刺激和擴(kuò)增后，作為抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)然后再回輸給患者。
[0009]一個(gè)這樣的細(xì)胞療法，包括自體免疫產(chǎn)物的制備與體外激活的自體⑶8+的CTLs，對(duì)黑色素瘤相關(guān)抗原中6個(gè)選定的HLA-A2.1限制的多肽的表現(xiàn)出特異性。細(xì)胞治療產(chǎn)品的活性成分是患者自身的CD8+細(xì)胞，并已通過(guò)暴露于抗原肽負(fù)載的aAPCs上被激活，至少對(duì)6個(gè)HLA-A2.1限制性肽中的I個(gè)有特異性。這些CTL來(lái)自于自體天然的T細(xì)胞，是從臨床的淋巴細(xì)胞提取的樣本中分離得到，用果蠅細(xì)胞作為aAPCs，在體外用黑色素瘤抗原肽表位誘導(dǎo)產(chǎn)生。在白介素-2 (IL-2)和白介素7 (IL-7)的存在下，用負(fù)載黑色素瘤抗原表位的自體單核細(xì)胞再刺激使之?dāng)U增，接著再用0KT3進(jìn)行非特異的擴(kuò)增，收獲，洗滌，重新懸浮在最終輸液中，再輸注到原患者體內(nèi)。再次輸注的最終產(chǎn)物有:300mL的乳酸林格氏注射液中有1-1OXIO9CTl細(xì)胞(76% v/v)，5%葡萄糖在生理鹽水中(D5NS)(4% v/v)，和人的血清白蛋白(HSA) (20% v/v)。
[0010]利用特定抗原體外激活自體CDS+CTLs是用于治療或預(yù)防癌癥的新免疫療法，這為目前治療不治之癥的癌癥提供了一個(gè)有前途且令人興奮的發(fā)展與戰(zhàn)略。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0011]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足和缺陷，本發(fā)明提供一種卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于由以下步驟組成:
[0012]1.將細(xì)胞HTB161A2在RPMI補(bǔ)充性培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，將細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)在0.5 X IO6個(gè)/ml ；
[0013]i1.倒去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的IxPBS緩沖液洗細(xì)胞3次，用3ml細(xì)胞裂解緩沖液將裂解液沖洗和收集細(xì)胞，且在4°C下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)I小時(shí)。懸液以高速15Krpm，20分鐘下離心，收集上清液保存在_80°C備用；
[0014]ii1.收集0.5ml磁珠子并用包被緩沖液洗4次；
[0015]iv.將磁珠子與 0.42ml，4.8mg/ml 的 BB7.2 抗體孵育，加 2.08ml，3M 的(NH4) 2S04，在3.26ml包被緩沖液中室溫孵育72小時(shí)；
[0016]V.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同體積的含0.5%BSA與0.05%Tween20的PBS并在室 溫中再孵育48小時(shí)；
[0017]v1.用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗磁珠子，將磁珠子重懸在2ml含有0.02%疊氮化鈉的PBS中備用；
[0018]vi1.1XlO9個(gè)在裂解液中的卵巢癌細(xì)胞，以100，OOOXg，離心I小時(shí)，丟棄沉淀，將上清用0.22-1im過(guò)濾器過(guò)濾后與BB7.2抗體連接的磁珠子在4°C旋轉(zhuǎn)孵育24小時(shí)，裝柱后用50ml洗液洗4遍；
[0019]vii1.將洗后的珠子用2mll0%的HAC洗脫BB7.2抗體連接的磁珠子；
[0020]ix.洗脫下的物質(zhì)收集在離心管中，加10%HAC后煮沸5分鐘；
[0021]X.把洗脫下的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)濕的孔徑為5kDa的Ultrafree-CL膜上,3500X g在4°C離心5小時(shí)，收集濾出液，所述的濾出液即為抗原肽的溶液。
[0022]所述的細(xì)胞裂解緩沖液為pH8.0 的 50mM Tris, 150mM NaCl, 1%CHAPS,5uM EDTA,0.2%疊氮化鈉，17.4 u g/ml PMSF，蛋白酶抑制劑。
[0023]所述的BB7.2通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清純化而來(lái)。
[0024]用上述述制備方法制備的抗原肽，蛋白質(zhì)序列為:
[0025]FLYDDNQRV,
[0026]或ALMEQQHYV，
[0027]或NLTISDVSV，
[0028]或GVYDGEEHSV，
[0029]或KLQELNYNL
[0030]或NLMEQPIKV，
[0031]或FLAEDALNTV。[0032]本發(fā)明所用的方法是一種稱(chēng)為直接的生化方法，即用免疫親和方法從腫瘤細(xì)胞或組織中純化MHC/多肽復(fù)合分子，并從中洗脫出MHC結(jié)合的抗原肽，這些抗原肽可被潛在地用于抗體治療，或產(chǎn)生卵巢癌特異的CTLs，或制備腫瘤疫苗；也可發(fā)展出用于診斷的試劑盒。
[【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】]
[0033]圖1為親和層析純化MHC/多肽復(fù)合物的洗脫峰示意圖；
[0034]圖2為Bioanalyzer分析滯留物的層析和電泳圖；
[0035]圖3為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖；
[0036]圖4為MS/MS測(cè)定多肽的氨基酸序列示意圖；
[0037]圖5為合成的多肽結(jié)合細(xì)胞表面MHC I的能力示意圖；
[0038]圖6為測(cè)定CTL毒性示意圖。
[【具體實(shí)施方式】]
[0039]為了使本發(fā)明更加清楚，結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，本實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040]實(shí)施例1:卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備
[0041]1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0042]用于抗原肽鑒定的細(xì)胞株是HTB161A2。細(xì)胞在RPMI補(bǔ)充性培養(yǎng)基(Invitrogen)中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)。第一天，將細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)在0.5X IO6個(gè)/ml，一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)細(xì)胞濃度到達(dá)2X IO6個(gè)/ml時(shí)(3~4天)細(xì)胞會(huì)分裂。
[0043]2 .細(xì)胞收集
[0044]從T75培養(yǎng)瓶中倒去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的I XPBS緩沖液洗細(xì)胞3次，用3ml細(xì)胞裂解緩沖液將裂解液[50mMTris(pH8.0)，150mMNaCl, I%CHAPS(Aldrich, Cat.N0.226947)，5uM EDTA，0.2% 疊氮化鈉，17.4 u g/ml PMSF (Calbiochem-Novabiochem)，蛋白酶抑制劑(Roche, Cat.N0.1697498)]，沖洗和收集細(xì)胞，且在4 °C下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)I小時(shí)，懸液以高速15Krpm, 20分鐘下離心，收集上清液保存在_80°C備用。
[0045]3.將HLA-A2抗體鏈接在磁珠上
[0046]抗HLA-A2 抗體(BB7.2)通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株[八TC'CX Number: HB-82? (Parhamand Brodsky, Hum Immunol.3(4):277-99(1981))]的培養(yǎng)上清純化而來(lái)。BB7.2抗體是鼠單克隆抗HLA-A2的抗體并且是IgG2b表型?？贵w是識(shí)別人HLA-A2組織相容性抗原中C端的a-2螺旋上的抗原決定簇并且打開(kāi)其中一個(gè)潛在的P折疊。BB7.2會(huì)識(shí)別所有的HLA-A2亞型，HLA-A2.1代表了 90%的A2亞型，剩余的10%主要包括A2.2，A2.3，A2.5和A2.7。在連接 BB7.2 (HLA-A2 抗體)之前，收集 0.5ml Dynabeads? MyOne?Tosylactivated 磁珠
子(Dynal? Biotech, Cat.N0.655.01)并用包被緩沖液(0.1M硼酸鈉緩沖液，pH9.5)洗4次。接著將珠子與0.42ml, 4.8mg/ml的BB7.2抗體孵育，加2.08ml，3M的(NH4)2SO4,在
3.26ml包被緩沖液中室溫孵育72小時(shí)。用Dynal⑩MPCtm-1磁力集中器(Dynal BiotechASA, OSLO, Norway)移走上清，珠子里加入相同體積的含0.5%BSA與0.05%Tween20的PBS并在室溫中再孵育48小時(shí)。用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗珠子，將珠子重懸在2ml含有0.02%疊氮化鈉的PBS中備用。
[0047]4.分離HLA-A2連接的抗原肽
[0048]IX IO9個(gè)在裂解液中的卵巢癌細(xì)胞，以100，OOOXg，離心I小時(shí)。丟棄沉淀，將上清用0.22-Um過(guò)濾器過(guò)濾后與BB7.2抗體連接的Dynabeads? (lmg BB7.2抗體/25mg DynabeadsS )在4°c旋轉(zhuǎn)孵育24小時(shí)，裝柱后用50ml以下4種不同的洗液洗4遍。
[0049]洗液1:50mMTris (pH8.0)，150mMNaCl, 0.05%CHAPS, 5uM EDTA, 0.2% 疊氮化鈉，17.4u g/ml PMSF
[0050]洗液2: 5OmM Tris (pH8.0)，I5OmM NaCl
[0051]洗液3:50mM Tris (pH8.0), 450mM NaCl
[0052]洗液4Z5OmM Tris (pH8.0)
[0053]將洗后的珠子用2ml，10%HAC洗脫，將MHC/多肽復(fù)合分子從BB7.2抗體連接的Dynabeads^上洗脫下來(lái)(圖1)。洗脫下的物質(zhì)收集在離心管中，為了進(jìn)一步從I類(lèi)MHC分離HLA-A2重鏈結(jié)合的多肽，將樣品加10%HAC后煮沸5分鐘。
[0054]為了將多肽與共純化下來(lái)的重鏈及@ 2微球蛋白分離開(kāi)來(lái)，將樣品用孔徑為 5kDa 的 Ultrafree-CL 膜(Amicon, Cat.N0.UFC4LCC25,Mi11iporeCorporation, Bedford, Mass.)離心。使用前，將 Ultrafree-CL 膜用 lmll0% 的醋酸預(yù)濕，離心I小時(shí)后，丟棄所有的液體。把從珠子上洗脫下的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)濕的Ultrafree-CL膜上，3500Xg在4°C離心5小時(shí)。收集過(guò)濾物和滯留物，滯留物是無(wú)抗原肽的成分，包括I類(lèi)MHC的HLA-A2分子，滯留物用做SDS-PAGE分析。該成分分別是44kDa的I類(lèi)MHC重鏈以及12kDa的P 2微球蛋白(圖2)。濾出液也就是抗原肽溶液。
[0055]實(shí)施例2:抗原肽的檢測(cè)
[0056]如圖2所示,上述滯留物I y I加入蛋白質(zhì)份分析的板中，用Bioanalyzer分析,根據(jù)對(duì)照比較，左圖給出層析圖，右圖給出電泳圖，均顯示分子量為44kD的MHC I的存在。
[0057]5.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)
[0058]從HLA-A2連接的多肽中分離并過(guò)濾出的多肽溶液，用1%三氟乙酸(TFA)酸化。每個(gè)樣品中注入 IOyl EksigentnanoLC (Eksigent Technologies, Inc.)脫鹽及捕獲過(guò)程如下:捕獲柱=LC填充的C18P印maplOO，5u, 100A, 300um idX5mm;捕獲移動(dòng)相=水，2%甲醇，0.05%TFA;捕獲流量率=5 u 1/min;分析柱=Vydac; Everest C18, 5u, 300A, 75umidX 150mm;分析移動(dòng)相:A=水，2%甲醇，0.1%乙酸；B=10%水，90%乙腈，0.1%蟻酸；流率=0.2u 1/min.;分析斜率=0_80min; 10_30%B, 80-120min30_60%。分離的每個(gè)多肽作為一個(gè)LC-MS峰，由串聯(lián)在一起的質(zhì)譜分析，基于每一個(gè)峰的強(qiáng)度和離子電荷，MS/MS測(cè)定多肽的氨基酸順序(圖3)。
[0059]5.抗原肽的序列測(cè)定
[0060]由于不完整的肽碎片，用LC/MS/MS重頭測(cè)序法得到的多肽序列通常是不明確的，當(dāng)一個(gè)肽段與氬氣碰撞后，不是每一個(gè)可能的片段都會(huì)產(chǎn)生。事實(shí)上，有些多肽鍵可能是一直保持連接狀態(tài)。而且，由于各種原因(如共洗脫，離子抑制，或者是片段不帶有正電荷)，不是所有的多肽片段能被質(zhì)譜所檢測(cè)。因此，某些特定肽的LC/MS/MS光譜可能不夠完全。在本發(fā)明中，含糊不清的多肽序列用ProteinLynX2.0測(cè)序工具篩選，接著，將LC/MS/MS中至少5個(gè)重復(fù)的分析中的3個(gè)有類(lèi)似大小峰值的肽序列，與人類(lèi)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(Deduced peptide sequence)。圖4是舉例樣品經(jīng)質(zhì)譜后其中的一個(gè)質(zhì)譜圖。
[0061]用這種方法，測(cè)定了 35個(gè)肽序列，每個(gè)多肽有9~12個(gè)氨基酸序列，用生物信息方法分析其中7個(gè)多肽可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相應(yīng)的蛋白(表一)。
[0062]表一:質(zhì)譜和生物信息分析可能的抗原肽
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于由以下步驟組成: 1.將細(xì)胞HTB161A2在RPMI補(bǔ)充性培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，將細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)在0.5 X IO6個(gè)/ml ； i1.倒去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的IXPBS緩沖液洗細(xì)胞3次，用3ml細(xì)胞裂解緩沖液將裂解液沖洗和收集細(xì)胞，且在4°C下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)I小時(shí)。懸液以高速15Krpm，20分鐘下離心，收集上清液保存在_80°C備用； ii1.收集0.5ml磁珠子并用包被緩沖液洗4次； iv.將磁珠子與0.42ml, 4.8mg/ml 的 BB7.2 抗體孵育，加 2.08ml，3M 的(NH4)2SO4,在3.26ml包被緩沖液中室溫孵育72小時(shí)； V.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同體積的含0.5%BSA與0.05%Tween20的PBS并在室溫中再孵育48小時(shí)； v1.用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗磁珠子，將磁珠子重懸在2ml含有0.02%疊氮化鈉的PBS中備 用； vi1.1XlO9個(gè)在裂解液中的卵巢癌細(xì)胞，以100，000X g，離心I小時(shí)，丟棄沉淀，將上清用0.22-1im過(guò)濾器過(guò)濾后與BB7.2抗體連接的磁珠子在4°C旋轉(zhuǎn)孵育24小時(shí)，裝柱后用50ml洗液洗4遍； vii1.將洗后的珠子用2mll0%的HAC洗脫BB7.2抗體連接的磁珠子； ix.洗脫下的物質(zhì)收集在離心管中，加10%HAC后煮沸5分鐘； X.把洗脫下的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到預(yù)濕的孔徑為5kDa的Ultrafree-CL膜上,3500 X g在4°C離心5小時(shí)，收集濾出液，所述的濾出液即為抗原肽的溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞裂解緩沖液為 pH8.0 的 50mMTris，150mMNaCl, 1%CHAPS, 5uMEDTA, 0.2% 疊氮化鈉，17.4 u g/ml PMSF，蛋白酶抑制劑。
3.如權(quán)利要求1所述的卵巢癌特異的腫瘤抗原肽的制備方法，其特征在于所述的BB7.2通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清純化而來(lái)。
4.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: FLYDDNQRV。
5.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: ALMEQQHYV。
6.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下:
NLTISDVSVo
7.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: GVYDGEEHSVo
8.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: KLQELNYNL。
9.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: NLMEQPIKV。
10.一種用權(quán)利要求1所述制備方法制備的抗原肽，其特征在于蛋白質(zhì)序列如下: FLAEDALNTV。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK103739667SQ201310439063
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】施煒星, 楊春霞, 房永生 申請(qǐng)人:上海宇研生物技術(shù)有限公司