優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQIDNO:1。本發(fā)明通過(guò)從枯草芽孢桿菌同源蛋白信號(hào)肽庫(kù)中，構(gòu)建各種信號(hào)肽與Savinase相結(jié)合的表達(dá)載體，結(jié)合高通量的篩選方法，篩選出能提高Savinase分泌的信號(hào)肽，從而使Savinase的分泌優(yōu)化，與原信號(hào)肽相比，Savinase的分泌量提高了3.7倍，對(duì)于Savinase生產(chǎn)成本的下降以及進(jìn)一步大規(guī)模應(yīng)用具有重要意義。
【專利說(shuō)明】?jī)?yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,更具體地,本發(fā)明涉及一種優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對(duì)產(chǎn)品安全性要求的日益增長(zhǎng)，生物酶制劑在食品加工、化合物酶法合成以及加酶洗滌劑等重大領(lǐng)域扮演著愈加重要的角色。
[0003]枯草芽孢桿菌作為一個(gè)通常被認(rèn)為是安全(GRAS, generally regarded as safe)的菌種，由于其低廉的發(fā)酵成本與優(yōu)良的蛋白分泌水平(可高達(dá)20-25g/L酶)，在生物酶制劑領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，60%的商業(yè)用酶的宿主均來(lái)自于芽孢桿菌屬。
[0004]其中，Savinase是以枯草芽孢桿菌作為宿主發(fā)酵的一種主要酶類。Savinase來(lái)自于嗜堿芽孢桿菌，是基因PB92成熟肽的商品名。
[0005]PB92基因由信號(hào)肽、前肽與成熟肽三部分組成?；蚪?jīng)過(guò)翻譯形成前體蛋白后，其中信號(hào)肽部分通過(guò)與SRP等元件的結(jié)合，將PB92基因翻譯蛋白引導(dǎo)至細(xì)胞膜處分泌，并在分泌過(guò)程中完成對(duì)信號(hào)肽的變構(gòu)與剪切，并最終與前肽和成熟肽的融合蛋白分離。在周質(zhì)空間處，每?jī)蓚€(gè)PB92前肽與成熟肽融合蛋白形成復(fù)合體，相互對(duì)對(duì)方的前肽進(jìn)行剪切，前肽在此過(guò)程中幫助成熟肽完成折疊，最終形成有活力的成熟肽一一Savinase。
[0006]Savinase在多方面具有良好的性能,其比酶活高達(dá)190U/mg,無(wú)明顯致敏性；最適PH為10.5，適合用于廣泛使用的堿性洗滌劑；耐受溫度為55°C，適用于常溫使用，且在4°C能夠存放較長(zhǎng)時(shí)間；此外，savinase在枯草芽孢桿菌中獲得良好的表達(dá)，經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵，能夠達(dá)到l_2g/L的水平，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。目前，對(duì)于savinase的生產(chǎn)成本的優(yōu)化，主要體現(xiàn)在savinase的產(chǎn)品優(yōu)化以及其分泌優(yōu)化上。對(duì)于savinase的產(chǎn)品優(yōu)化,現(xiàn)主要集中在突變體的構(gòu)建以及保護(hù)劑的添加。對(duì)于savinase的分泌上，主要集中在啟動(dòng)子的優(yōu)化，mRNA稀有密碼子的去除,二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化,mRNA stablizer的添加、核糖體的優(yōu)化以及高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化。
[0007]在savinase被發(fā)現(xiàn)后近40年間,針對(duì)savinase性質(zhì)改良的專利文獻(xiàn)逐漸增加，尤其在savinase的三維結(jié)構(gòu)解析后，通過(guò)相應(yīng)位點(diǎn)的半理性突變獲得相應(yīng)性質(zhì)改良，如獲得提高耐受自裂解、耐受過(guò)氧化氫以及與脂肪酶和諧共處的突變體變得可行。然而篩選出來(lái)的突變體雖然性質(zhì)發(fā)生優(yōu)化，但是綜合性能仍然無(wú)法和野生型savinase相比，且可能導(dǎo)致分泌難度的增加，最終導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提升；為了降低savinase的實(shí)際使用成本，諾維信novozyme公司也在劑型的改良上進(jìn)行了嘗試。通過(guò)添加硼酸鹽衍生物作為穩(wěn)定劑，有效的提高了 savinase的儲(chǔ)存時(shí)間，并對(duì)酶活沒(méi)有明顯的影響,最終開(kāi)發(fā)出高濃度ultrasavinase 16xL的產(chǎn)品，成為加酶洗滌劑的主要添加成分。然而硼酸鹽衍生物作為潛在毒性物質(zhì)，長(zhǎng)期使用將對(duì)人體造成慢性中毒以及對(duì)相應(yīng)環(huán)境造成污染，制約了 savinase包括洗滌劑等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。因而，仍需開(kāi)發(fā)新型無(wú)毒穩(wěn)定劑。
[0008]為了進(jìn)一步提高savinase的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值,人們嘗試對(duì)其生產(chǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以其降低實(shí)際使用成本。而Savinase作為在枯草芽孢桿菌優(yōu)良分泌表達(dá)蛋白種類，對(duì)于其產(chǎn)量提升，主要集中在對(duì)于啟動(dòng)子、mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高密度發(fā)酵工藝的改良。然而，過(guò)強(qiáng)的啟動(dòng)子、過(guò)剩的外源蛋白胞內(nèi)積累，形成包涵體或者造成分泌通道的阻塞，進(jìn)而導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不良以及分泌蛋白量的下降，風(fēng)險(xiǎn)較大；高密度發(fā)酵的工藝經(jīng)過(guò)多次的改良，具有一定的發(fā)展?jié)摿Γ怯捎诠に嚦墒?，不容易在行業(yè)中獲得較大的優(yōu)勢(shì)。因而現(xiàn)在savinase的價(jià)格仍然維持在較高水平，這制約了 savinase的進(jìn)一步大規(guī)模使用。 [0009]通過(guò)改變信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)異源蛋白的分泌優(yōu)化是一項(xiàng)常見(jiàn)的技術(shù)，Savinase對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽是嚴(yán)格Sec途徑依賴型的信號(hào)肽，作為常用的異源蛋白在枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的信號(hào)肽，Savinase對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽能夠不同程度改變異源蛋白在枯草芽孢桿菌的分泌表達(dá)，隨著人們對(duì)芽孢桿菌分泌蛋白種類認(rèn)識(shí)的加深，人們開(kāi)始嘗試大規(guī)模篩選針對(duì)特定蛋白具有分泌優(yōu)化性質(zhì)的信號(hào)肽。
[0010]Christian Degering等在2010年通過(guò)建立來(lái)源于枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌的信號(hào)肽庫(kù)，以同樣在枯草芽孢桿菌中獲得良好分泌表達(dá)的商業(yè)蛋白酶BPN作為標(biāo)記蛋白，通過(guò)構(gòu)建不同信號(hào)肽與BPN融合蛋白的組合，嘗試通過(guò)信號(hào)肽對(duì)目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)分泌提升。結(jié)果表明，來(lái)自于地衣芽孢桿菌的dbi0038獲得最好的分泌表達(dá)，與原信號(hào)肽相比，分泌效果提升至原來(lái)的7倍。這提示我們，不僅分泌表達(dá)不好的異源蛋白，即便已經(jīng)獲得良好分泌表達(dá)的同源蛋白，也能通過(guò)更換信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)該蛋白的分泌優(yōu)化。
[0011]然而現(xiàn)在使用的信號(hào)肽的改動(dòng)局限在NprB、NprE以及AmyQ等幾種常見(jiàn)高水平分泌蛋白相應(yīng)的信號(hào)肽中，而不同信號(hào)肽對(duì)不同的蛋白的表達(dá)具有不同的效果，所以這幾種信號(hào)肽并不一定能夠獲得理想的Savinase的分泌表達(dá)的優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種可以優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
一種優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]本發(fā)明還提供了上述信號(hào)肽在優(yōu)化Savinase的高效分泌表達(dá)方面的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽。
[0016]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述多核苷酸的序列為SEQ ID N0:2所示。
[0017]本發(fā)明通過(guò)從枯草芽孢桿菌同源蛋白信號(hào)肽庫(kù)中，構(gòu)建各種信號(hào)肽與Savinase相結(jié)合的表達(dá)載體，結(jié)合高通量的篩選方法，篩選出能提高Savinase分泌的信號(hào)肽，從而使savinase的分泌優(yōu)化，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
1、本發(fā)明篩選獲得的信號(hào)肽，實(shí)現(xiàn)了savinase的高效分泌優(yōu)化，與原信號(hào)肽相比，savinase的分泌量提高了 3.7倍,對(duì)于savinase生產(chǎn)成本的下降以及進(jìn)一步大規(guī)模應(yīng)用具有重要意義；
2、本發(fā)明篩選獲得優(yōu)化savinase的分泌信號(hào)肽的方法，相對(duì)于轉(zhuǎn)錄效率的優(yōu)化，不會(huì)引起包涵體或者分泌通道的阻塞，進(jìn)而影響下游的發(fā)酵；而相對(duì)于突變體的優(yōu)化而言，通過(guò)信號(hào)肽獲得的蛋白仍為野生型的savinase，仍為目前綜合性能最好的蛋白酶之一。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0019]如無(wú)特別說(shuō)明，以下實(shí)施例中所采用的各種原料均來(lái)源于市售。所采用的方法均為常規(guī)技術(shù)手段。
[0020]實(shí)施例1優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽的篩選
參考(Christian Degering et.al，2010)的方法,通過(guò)從枯草芽孢桿菌同源蛋白信號(hào)肽庫(kù)中，構(gòu)建各種信號(hào)肽與Savinase相結(jié)合的表達(dá)載體，結(jié)合高通量的篩選方法，從克隆中獲得不同程度提高savinase分泌效果的信號(hào)肽，具體包括以下步驟:
I全基因合成savinase前肽與成熟肽DNA片段。
[0021]2構(gòu)建Pnw33n-pro_mature PB92:將savinase前肽與成熟肽DNA片段與載體Pnw33N (購(gòu)于clontech公司，已加入Bacillus subtilis BSn5組成型啟動(dòng)子P43)相連接，構(gòu)建成Pnw33n-pro_mature PB92質(zhì)粒。測(cè)序確定其序列正確性。
[0022]3 構(gòu)建 Pnw33n_signal peptide database-pro-mature PB92 質(zhì)粒:提取Bacillus subtilis BSn5基因組DNA(Magen細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒)，使用相應(yīng)引物進(jìn)行選取信號(hào)肽DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物回收(MagenDNA凝膠回收試劑盒)，經(jīng)過(guò)克隆轉(zhuǎn)化插入第2步構(gòu)建好的Pnw33n-pro_mature PB92載體中，使用酶切位點(diǎn)為EcoRI與BamH,插入 savinase 前妝序列之間。構(gòu)建成 Pnw33n_signal peptide database-pro-mature PB92質(zhì)粒。
[0023]5、電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N于酪蛋白平板上獲得克隆子；
6、挑取透明圈明顯的克隆子，使用96孔板培養(yǎng)，使用sucAAPF-pnA對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定，確定分泌優(yōu)化克隆子；
7、對(duì)分泌優(yōu)化克隆子進(jìn)行測(cè)序，確定信號(hào)肽是否被修改。
[0024]經(jīng)上述步驟篩選獲得能提高savinase分泌效果的信號(hào)肽，命名為RlpA，氨基酸序列為MK KVI LAA FIL VGS TLG AFS FSS DAS A(SEQ ID NO:1)，編碼該氨基酸序列的多核苷酸的序列為 ATGAAGAAAGTCAITTTAGCCGCTITTATC
TTAGTAGGAAGTACTTTGGGAGCTTTTAGTTTTTCATCAGATGCCAGTGCG (SEQ ID NO:2)。
[0025]實(shí)施例2實(shí)施例1獲得的信號(hào)肽對(duì)Savinase分泌表達(dá)的優(yōu)化效果
采用Suc-AAPF-PNA法測(cè)定實(shí)施例1獲得的信號(hào)肽、野生型信號(hào)肽和現(xiàn)有使用的信號(hào)肽對(duì)分泌的Savinase的酶活。
[0026]將菌液搖床振蕩培養(yǎng)，按照以下操作測(cè)量酶活:
1、離心取上清用于測(cè)量分泌至培養(yǎng)基的Savinase的酶活；
2、取上清與磷酸氫鈉緩沖液混合，向混合液中加入Suc-AAPF-PNADMSO溶液，水浴，同時(shí)使用相應(yīng)體積的磷酸氫鈉緩沖液與Suc-AAPF-PNA DMSO混合溶液作為對(duì)照；
3、水浴結(jié)束后，將溶液進(jìn)行離心，取上清于波長(zhǎng)405nm處測(cè)量不同組別吸光值的大小，作為衡量酶活的標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]得到的酶活結(jié)果如表1所示。
[0028]表1實(shí)施例1的信號(hào)肽和野生型信號(hào)肽對(duì)分泌的Savinase的酶活
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽，其特征在于，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為 SEQ ID NO:1。
2.權(quán)利要求1所述的信號(hào)肽用于優(yōu)化Savinase的高效分泌表達(dá)。
3.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的優(yōu)化Savinase高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列為SEQIDN0:2。
【文檔編號(hào)】C07K14/32GK103483432SQ201310422659
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】王建暉, 馬坤, 汪慶萍 申請(qǐng)人:廣州吉格生物科技有限公司