轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP17及編碼基因與其在響應(yīng)逆境中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP17及編碼基因與其在響應(yīng)逆境中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的基因，稱為ZmbZIP17，來源于玉米（Zea?mays?L.），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，ZmbZIP是與植物耐旱及抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的基因；對于培育耐旱性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫抗性提高的作物、林草等新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
【專利說明】轉(zhuǎn)錄因子ZmbZ I P1 7及編碼基因與其在響應(yīng)逆境中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP17及編碼基因與其在響應(yīng)逆境中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著全球水資源的缺乏和極端氣候事件頻率的不斷上升，干旱對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的負(fù)作用日趨顯著。植物遭受逆境后會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(ER stress).脫落酸(ABA)是一個(gè)響應(yīng)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子。在脅迫條件下，ABA可調(diào)控氣孔關(guān)閉和基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的耐逆性。玉米是重要的糧食、飼料和能源作物，然而許多玉米產(chǎn)區(qū)干旱和鹽潰化等問題嚴(yán)重影響其生長和產(chǎn)量。因此，通過分子操作技術(shù)提高玉米及其他作物的耐旱性以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫變得日趨重要。
[0003]在植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答過程中轉(zhuǎn)錄因子扮演著非常重要的角色。操縱一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就可通過它促使多個(gè)功能基因發(fā)揮作用，從而達(dá)到使植株性狀獲得綜合改良的效果，因此導(dǎo)入或改良一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是提高作物抗逆性的非常有效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP17及編碼基因。
[0005]本發(fā)明提供的蛋 白，稱為ZmbZIP17,來源于玉米(Zea mays),是如下(a)或(b):
[0006](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]上述蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009]編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0010]上述DNA分子是如下(I) - (4)中任意一種的DNA分子:
[0011](I)編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第120-1811位核苷酸所示的DNA分子；
[0012](2)編碼區(qū)為序列表中序列3自5’末端第1128-2819位核苷酸所示的DNA分子；
[0013](3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0014](4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白和/或RNA的DNA分子。
[0015]上述嚴(yán)格條件下為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0016]上述序列表中的序列I由1914個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第120-1811位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的ZmbZIP17。
[0017]含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0019]上述重組載體具體為將編碼上述蛋白的DNA分子的表達(dá)盒(序列3)插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0020]在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為pLeela ;上述重組載體為將編碼上述蛋白的DNA分子表達(dá)盒插入pLeela的attRl和attR2重組位點(diǎn)間得到的載體；編碼上述蛋白的DNA分子表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中的序列3。
[0021]用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等,如 pBinl9、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300 或其它衍生植物表達(dá)載體。
[0022]使用ZmbZIP17基因構(gòu)建重組表達(dá) 載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0023]為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024]擴(kuò)增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025]在本發(fā)明的實(shí)施例，引物對由如下序列所示的引物組成:5’-CACCAGATCGGCTGAGCCAAGG-3’ 和 5’-CAGACCTAAAGGTGAGGGCTATGG-3’ 。
[0026]上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中所述調(diào)節(jié)植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆性具體為耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫或耐旱性；
[0027]上述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，上述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼上述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0029]上述方法中，所述耐逆性為耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫或耐旱性；
[0030]上述編碼上述蛋白的DNA分子通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
[0031]上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0032]上述耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫通過如下I)或2)體現(xiàn):[0033]I)通過DTT脅迫作用下轉(zhuǎn)基因植物的葉片大于所述目的植物體現(xiàn)；具體為轉(zhuǎn)基因植物的葉片寬度大于所述目的植物。
[0034]2)通過 DTT 脅迫作用下轉(zhuǎn)基因植物的 BiPl、BiP2、BiP3、CNXl、ERdj3A、CRTl、GRP94基因至少一個(gè)的表達(dá)量大于所述目的植物體現(xiàn)。
[0035]上述耐旱性通過如下a)或b)體現(xiàn):
[0036]a)通過PEG脅迫作用下轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于大于所述目的植物體現(xiàn)；
[0037]b)通過ABA脅迫作用下轉(zhuǎn)基因植物的ADHl、Rabl8、RD29A基因至少一個(gè)的表達(dá)量高于所述目的植物體現(xiàn)。
[0038]攜帶有本發(fā)明的與植物耐旱、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白編碼基因ZmbZIP17的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花等農(nóng)作物，也可以是苜蓿、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬花卉植物。
[0039]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從玉米中篩選到一個(gè)響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的ZmbZIP17基因，將該基因?qū)胍吧蛿M南芥，得到轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥，與野生型擬南芥相比，該轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)激能力以及耐旱性明顯提高，同時(shí)可以誘導(dǎo)和提聞脅迫相關(guān)的Marker基因的表達(dá)。說明ZmbZIP17是與耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和耐旱性相關(guān)的蛋白，參與脅迫響應(yīng)。因此ZmbZIP是與植物耐旱及耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫相關(guān)的基因；對于培育耐旱性及耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的作物、林草等新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為ZmbZIP17基因在玉米中經(jīng)干旱、ΑΒΑ、及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中的表達(dá)
[0042]圖2為Τ2代轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的RT-PCR檢測表達(dá)量的結(jié)果
[0043]圖3為T2代轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的耐PEG鑒定結(jié)果
[0044]圖4為T2代轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫鑒定結(jié)果
[0045]圖5為T2代轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的ABA脅迫后響應(yīng)基因的表達(dá)
[0046]圖6為T2代轉(zhuǎn)ZmbZIP17擬南芥的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后響應(yīng)基因的表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0047]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]實(shí)施例1、ZmbZIP17基因的獲得及在玉米脅迫處理中的表達(dá)
[0050]l、ZmbZIP17 基因的克隆
[0051]提取三葉一心期的玉米自交系B73 (Zea mays L.；ZmbZIP60mRNA is spliced inmaize in response to ER stress,BMC Research Notes (2012)5:144.;公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)葉片的總RNA并以其為模板，RNase抑制劑(購自Takara公司)，反轉(zhuǎn)錄酶 Superscript TM III Reverse Transcriptase (購自 Invitrogen 公司)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:
[0052](I)DNA 消化:
[0053]1ul 體系
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(I)-(4)中任一種的DNA分子: (1)編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第120-1811位核苷酸所示的DNA分子； (2)編碼區(qū)為序列表中序列3自5’末端第1128-2819位核苷酸所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要 求2或3所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用； 所述耐逆性具體為耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫或耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫或耐旱性； 所述編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子通過權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號】C07K14/415GK104017061SQ201310065802
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月1日
【發(fā)明者】鄧馨, 楊艷歌, 呂維濤 申請人:中國科學(xué)院植物研究所