專利名稱：用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。
背景技術(shù)：
帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常見的神經(jīng)變性疾病，在> 65歲的人群中，1%患有此病，在> 40歲的人群中則為0.4%，本病也可在兒童期或青春期發(fā)病。白種人發(fā)病率最高，其次是黃種人。H)是一終身性疾病，迄今為止尚無根治的方法，一旦患病則需要終身治療，由于手術(shù)治療價格昂貴而且有嚴(yán)格的手術(shù)指征，而基因治療和干細(xì)胞治療尚處于研究階段，因而藥物治療仍是目前治療H)的主要方法。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的神經(jīng)營養(yǎng)作用主要是通過其兩類受體亞基介導(dǎo)，即膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體alpha (GFRots)亞基和受體酪氨酸激酶Ret亞基。GFRots亞基靠其C端的磷酯酰肌醇鍵(GPI)錨定在細(xì)胞膜的外表面，屬膜外蛋白，不能直接轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。GDNF首先與GFRa I受體結(jié)合形成⑶NF-GFRotI復(fù)合物，此復(fù)合物再與Ret結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸殘基自磷酸化，從而引起下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮GDNF的生理作用。體內(nèi)外的許多實驗研究均證明⑶NF可以促進(jìn)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，顱神經(jīng)和脊髓運(yùn)動神經(jīng)元，腦干的去甲腎上腺素能神經(jīng)元，基底前腦膽堿能神經(jīng)元，背根神經(jīng)節(jié)，交感神經(jīng)元的存活。⑶NF在這些不同環(huán)境中的表達(dá)對于其在神經(jīng)變性性疾病研究及治療有著重要的意義。直接將GDNF注入腦內(nèi)到H)動物模型的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)，可改善這些模型動物的行為學(xué)癥狀 及其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的存活率。所以，GDNF以H)為適應(yīng)癥，潛在的治療對象還包括坐骨性神經(jīng)痛、周圍神經(jīng)損傷后造成的慢性神經(jīng)痛、其它神經(jīng)退行性疾病以及男性生殖干細(xì)胞疾病，因此具有廣泛的社會效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是，目前均采用大腸桿菌來表達(dá)生產(chǎn)GDNF，但是大腸桿菌作為原核細(xì)胞，其表達(dá)生產(chǎn)的⑶NF為人體所使用時，會產(chǎn)生抗體；同時，⑶NF的純度以及糖基化程度均十分重要，因此急需一種用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，從而消除上述背景技術(shù)中缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，包括如下步驟:
S1、構(gòu)建哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.Ι-h⑶NF ；S2、選用HEK293細(xì)胞作為工程細(xì)胞，利用Lipofectamine細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.Ι-h⑶NF導(dǎo)入所述HEK293細(xì)胞內(nèi)，并用G418進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)hffl)NF 的 HEK293 細(xì)胞；S3、用ELISA方法篩選出高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)h⑶NF的HEK293克隆細(xì)胞株作為生產(chǎn)hffl)NF的工程株；S4、蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述工程株，將上清液收集，并每隔4天更換新的DMEM培養(yǎng)基，收集后的上清液經(jīng)過離心、過濾、調(diào)pH值為8.2，得到含h⑶NF上清液；S5、通過離子交換層析法和凝膠過濾層析法對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，從而得到高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(rh⑶NF)。作為一種改進(jìn)，所述步驟SI中，以pcDNA3.1-為表達(dá)載體，利用限制內(nèi)切酶xho I和Not I將表達(dá)載體線性化，再用T4DNA連接酶把h⑶NF cDNA(用限制內(nèi)切酶xho I和NotI雙切后)連接至pcDNA3.1表達(dá)載體中，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3.l_h⑶NF。作為一種改進(jìn)，所述步驟S2中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的具體步驟為:A、把2μ g pcDNA3.l_h⑶NF加入到110 μ I Opt i_MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用；B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 轉(zhuǎn)染試劑)M 150 μ I Opt1-MEM 培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用；`C、將步驟A和步驟B的液體混合,得到DNA-Lipofectamine混合物；D、將步驟C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25°C室溫下放置30分鐘；E、然后加320 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基到步驟D的DNA-Lipofectamine混合物中，輕輕混勻；F、用2ml Opt1-MEM培養(yǎng)基洗HEK293細(xì)胞一次，然后取500 μ I步驟E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293細(xì)胞中；G、在37°C、5%C02 (體積濃度，下同)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時，然后去掉上清液，加入新鮮配制的3ml DMEM培養(yǎng)液，在37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；H、當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的覆蓋率達(dá)到80%后，用0.0lM PBS洗細(xì)胞一次，然后加入新鮮的、含有500 μ g/ml G418的DMEM培養(yǎng)液對已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組中插入了 h⑶NF基因的陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選，兩周后，得到穩(wěn)定表達(dá)hGDNF的HEK293細(xì)胞。作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟G、H的DMEM培養(yǎng)液中，還含有其中含有體積百分比為10%的胎牛血清、以及總量為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸和非必需氨基酸。作為一種改進(jìn)，所述步驟S3中，用ELISA方法對HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株克隆的上清液中hGDNF進(jìn)行定量測定，篩選出高表達(dá)克隆細(xì)胞株利用無血清DMEM培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)馴化，得到生產(chǎn)hffl)NF的HEK293工程株。上述ELISA方法即酶聯(lián)免疫吸附測定法，它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)②酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)③酶作用的底物(顯色劑)。測量時，抗原(抗體)先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體(抗原)與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物(標(biāo)記物)，此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原(抗體)反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(酶標(biāo)儀)加以測定。其方法簡單，方便訊速，特異性強(qiáng)。作為一種改進(jìn)，所述步驟S4中，將生產(chǎn)h⑶NF的HEK293工程株在無血清DMEM培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)12天，期間每4天收集一次上清液，并添加新鮮DMEM培養(yǎng)基；將收集的上清液合并后以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘；然后用0.45 μ m的過濾膜進(jìn)行過濾，得到的濾液用0.5M NaOH調(diào)節(jié)至pH值為8.2，得到得到含hffl)NF上清液。作為一種改進(jìn)，所述步驟S5中，離子交換層析法的步驟為:選用》(16/20層析柱(GE Healthcare)，先用1.5M的NaCl平衡液平衡所述XK 16/20層析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，調(diào)所述XK 16/20層析柱的pH值為8.2 ;將含h⑶NF上清液過柱，并利用
0.59M 0.82M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，得到含有h⑶NF的洗脫液。作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)，所述離子交換層析法中，1.5M的NaCl平衡液中含有IOmM磷酸鹽、5mM EDTA。作為一種改進(jìn)，所述步驟S5中，凝膠過濾層析法的步驟為:將含有hGDNF的洗脫液放入50mM的NaCl溶液中，用HiPr印26/10層析柱除鹽、濃縮、凍干，然后將樣品溶解在純凈水中，以0.5ml/分的速率上Superdex200HR10/30層析柱，使用AKTA純化儀10進(jìn)行純化，從而得到所述高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)，所述凝膠過濾層析法中50mM的NaCl溶液的pH為8.2，且含有1OmM磷酸鹽緩沖液。發(fā)明人對生產(chǎn)的高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行了糖基化程度檢測，方法步驟如下:將經(jīng)過純化的2 μ g h⑶NF懸浮于30 μ I生理鹽水中，在pH為
7.5、含有0.lwt%十二烷基硫酸鈉、20mM的磷酸鹽以及50πιΜβ -巰基乙醇的溶液中加熱到100°C，并保持5分鐘，使之變性；在冰上冷卻5分鐘后，再加入0.75wt%的NP-40 ;然后再添加0.0025單位的N-糖基化酶F，在37°C下放置6小時；陰性對照為不添加N-糖基化酶F處理的樣品，然后用蛋白印跡法進(jìn)行分析，得到的結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，經(jīng)過N-糖基化酶F處理后hGDNF的分子量明顯減小，從而可以獲知本發(fā)明中制備的hGDNF具有較高的糖基化程度。同時，發(fā)明人也對生產(chǎn)的高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行了體外生物活性的分析:利用純化的hGDNF用PC12細(xì)胞株(該細(xì)胞株對hGDNF的刺激有反應(yīng)能力)進(jìn)行體外生物活性的分析。在培養(yǎng)皿中加入DMEM培養(yǎng)基(含體積百分比為5%熱滅活的馬血清、體積百分比為10%胎牛血清、100單位/ml的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素)；然后將，每平方厘米接種PC12細(xì)胞20000個細(xì)胞；室溫下連續(xù)培養(yǎng)24個小時后，加入50ng純化的用HEK293所表達(dá)的糖基化的h⑶NF ;同時，設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性對照為用大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)的無糖基化的h⑶NF (R&D Sys tem貨號212-GD-010)，另外一個不加入h⑶NF作為陰性對照。7天后利用顯微鏡觀察PC12細(xì)胞株的生長狀況。結(jié)果:第一組的PC12細(xì)胞株具有很多的神經(jīng)元細(xì)胞分支，第二組分支較少，第三組基本無分支。這就證明，本發(fā)明生產(chǎn)的h⑶NF具有活性，能夠有效刺激PC12細(xì)胞株使之產(chǎn)生反應(yīng)。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的采用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(rh⑶NF)，而且經(jīng)過檢測生產(chǎn)的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子糖基化程度和純度較高，非常適合治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、神經(jīng)病變和外周神經(jīng)損傷。


圖1是h⑶NF糖基化程度檢測結(jié)果圖；圖2是純化h⑶NF之前對h⑶NF蛋白表達(dá)水平的測定結(jié)果圖；圖3是離子交換層析法線性洗脫的結(jié)果圖；圖4是pcDNA3.1-的質(zhì)粒圖譜。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實施例中，采用的溶劑、培養(yǎng)基、材料等均為公知。例如:pcDNA3.1-為Invitrogen公司生產(chǎn)的載體質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如圖4所示；Lipofectamine為Invitrogen公司出產(chǎn)的DNA轉(zhuǎn)染試劑。實施例1用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，包括如下步驟:S1、構(gòu)建哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.Ι-h⑶NF:詳細(xì)步驟為:以pcDNA3.1-為表達(dá)載體，利用限制內(nèi)切酶xho I和Not I將表達(dá)載體線性化，再用T4DNA連接酶把h⑶NF cDNA連接至pcDNA3.1表達(dá)載體中，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3.l_h⑶NF。S2、選用HEK293細(xì)胞作為工程細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.Ι-h⑶NF導(dǎo)入所述HEK293細(xì)胞內(nèi)，得到穩(wěn)定表達(dá)hGDNF的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的具體步驟為:A、把2 μ g pcDNA3.l_h⑶NF加入到110 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用；B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 轉(zhuǎn)染試劑)M 150 μ I Opt1-ΜΕΜ 培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用；C、將步驟A和步驟B的液體混合,得到DNA-Lipofectamine混合物；D、將步驟C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25°C室溫下放置30分鐘；E、然后加320 μ I Opt 1-MEM培養(yǎng)基到步驟D的DNA-Lipofectamine混合物中，輕輕混勻；F、用2ml Opt1-MEM培養(yǎng)基洗HEK293細(xì)胞一次，然后取500 μ I步驟E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293細(xì)胞中；G、在37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時，然后去掉上清液，加入新鮮配制的3ml DMEM培養(yǎng)液(其中含有10%體積百分比的胎牛血清、以及總量為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸和非必需氨基酸)，在37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；H、當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的覆蓋率達(dá)到80%后，用0.0lM PBS洗細(xì)胞一次，然后加入新鮮的、含有500 μ g/ml G418的DMEM培養(yǎng)液(其中含有體積百分比為10%的胎牛血清、以及總量為1 〖％的青霉素、鏈霉素、谷氨酸和非必需氨基酸)對已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組中插入了h⑶NF基因的陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選，兩周后，得到穩(wěn)定表達(dá)h⑶NF的HEK293細(xì)胞。S3、用ELISA方法篩選出高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)h⑶NF的HEK293克隆細(xì)胞株作為生產(chǎn)h⑶NF的工程株，詳細(xì)步驟為:用ELISA方法對HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株克隆的上清液中h⑶NF進(jìn)行定量測定，篩選出高表達(dá)克隆細(xì)胞株利用無血清DMEM培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)馴化，得到生產(chǎn)hffl)NF的HEK293工程株。S4、蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述工程株，將上清液不斷收集，并更換新的DMEM培養(yǎng)基，收集后 的上清液經(jīng)過離心、過濾、調(diào)pH值為8.2，得到含h⑶NF上清液，詳細(xì)步驟為:將生產(chǎn)MiDNF的HEK293工程株在無血清DMEM培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)12天，期間每4天收集一次上清液，并添加新鮮DMEM培養(yǎng)基；將收集的上清液合并后以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘；然后用0.45μ m的過濾膜進(jìn)行過濾，得到的濾液用0.5M NaOH調(diào)節(jié)至pH值為8.2，得到得到含MDNF上清液。在純化h⑶NF之前，取少量含h⑶NF上清液用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)進(jìn)行h⑶NF蛋白表達(dá)水平的鑒定。具體做法是:將15μ I含的h⑶NF的上清液中加入5μ I樣品緩沖液(含lwt%i3 -巰基乙醇)然后加熱到100°C，并保持5分鐘后使蛋白質(zhì)變性，放置冰上冷卻后，將20 μ I樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上。并用第一抗體抗h⑶NF的特異抗體(R&DSystem貨號AB-212-NA)和第二抗體偶聯(lián)HRP (SantaCruz貨號SC2354)來檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。S5、通過離子交換層析法和凝膠過濾層析法對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，從而得到高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhGDNF):其中，離子交換層析法的步驟為:選用XK 16/20層析柱(GE Healthcare)，先用1.5M的NaCl平衡液(含有IOmM磷酸鹽、5mMEDTA)平衡所述XK16/20層析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，調(diào)所述XK 16/20層析柱的pH值為8.2 ;將含h⑶NF上清液過柱，并利用0.71M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，得到含有h⑶NF的洗脫液；凝膠過濾層析法的步驟為:將含有hGDNF的洗脫液放入50mM的NaCl溶液(pH為
8.2，且含有IOmM磷酸鹽緩沖液沖，用HiPr印26/10層析柱除鹽、濃縮、凍干，然后將樣品溶解在純凈水中，以0.5ml/分的速率上Superdex200HR10/30層析柱，使用AKTA純化儀10進(jìn)行純化，從而得到所述高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。實施例2其他操作與實施例1相同，不同的是，本實施例在離子交換層析法中采用0.59M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫。實施例3其他操作與實施例1、2相同，不同的是，本實施例在離子交換層析法中采用0.82M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫。對比例:其他操作與實施例1、2、3相同，不同的是，本實施例在離子交換層析法中采用線性梯度濃度為150mM IM的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫液分管收集(每管2ml)，將收集管中的樣品用上述蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行hGDNF含量測定，有效的測定結(jié)果如圖3所示。從圖中可得知，12 30管(即NaCl溶液為0.59M 0.82M時)中收集到洗脫液中h⑶NF的含量最高，而其他濃度下，hGDNF幾乎沒有被洗脫。本發(fā)明不局限于上述具體實施方式
，一切基于本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思，所作出的結(jié)構(gòu)上的改進(jìn)，均落入 本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:包括如下步驟: 51、構(gòu)建哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.Ι-h⑶NF ； 52、選用HEK293細(xì)胞作為工程細(xì)胞，利用Lipofectamine細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.Ι-h⑶NF導(dǎo)入所述HEK293細(xì)胞內(nèi)，并用G418進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)hffl)NF 的 HEK293 細(xì)胞； 53、用ELISA方法篩選出高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)h⑶NF的HEK293克隆細(xì)胞株作為生產(chǎn)h⑶NF的工程株； 54、蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述工程株，將上清液收集，并每隔2— 3天更換新的DMEM培養(yǎng)基，收集后的上清液經(jīng)過離心、過濾、調(diào)pH值為8.2，得到含h⑶NF上清液； 55、通過離子交換層析法和凝膠過濾層析法對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，從而得到高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
2.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟SI中，以pcDNA3.1-為表達(dá)載體，利用限制內(nèi)切酶xho I和Not I將表達(dá)載體雙切線性化，再用T4DNA連接酶把h⑶NF cDNA連接至pcDNA3.1表達(dá)載體中，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3.l_h⑶NF。
3.如權(quán)利要求2所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟S2中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的具體步驟為: A、把2 μ g pcDNA3.l_h⑶NF加入到110 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用; B、加15 μ I的Lipofectamine至150 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后放置室溫備用； C、將步驟A和步驟B的液體混合,得到DNA-Lipofectamine混合物； D、將步驟C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25°C室溫下放置30分鐘； E、然后加320μ I Opt 1-MEM培養(yǎng)基到步驟D的DNA-Lipofectamine混合物中，輕輕混勻； F、用2ml Opt1-MEM培養(yǎng)基洗HEK293細(xì)胞一次，然后取500 μ I步驟E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293細(xì)胞中； G、在37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時，然后去掉上清液，加入新鮮配制的3mlDMEM培養(yǎng)液，在37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時； H、當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的覆蓋率達(dá)到80%后，用0.0lM PBS洗細(xì)胞一次，然后加入新鮮的、含有500 μ g/ml G418的DMEM培養(yǎng)液對已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組中插入了 h⑶NF基因的陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選，兩周后，得到穩(wěn)定表達(dá)hGDNF的HEK293細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟G、H的DMEM培養(yǎng)液中，還含有其中含有體積百分比為10%的胎牛血清、以及總量為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸和非必需氨基酸。
5.如權(quán)利要求3或4所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟S3中，用ELISA方法對HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株克隆的上清液中hGDNF進(jìn)行定量測定，篩選出高表達(dá)克隆細(xì)胞株利用無血清DMEM培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)馴化，得到生產(chǎn)h⑶NF的HEK293工程株。
6.如權(quán)利要求5所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟S4中，將生產(chǎn)hGDNF的HEK293工程株在無血清DMEM培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)12天，期間每4天收集一次上清液，并添加新鮮DMEM培養(yǎng)基；將收集的上清液合并后以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘；然后用0.45 μ m的過濾膜進(jìn)行過濾，得到的濾液用0.5M NaOH調(diào)節(jié)至pH值為8.2，得到得到含h⑶NF上清液。
7.如權(quán)利要求6所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟S5中，離子交換層析法的步驟為:選用》(16/20層析柱，先用1.5M的NaCl平衡液平衡所述XK16/20層析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，調(diào)所述XK16/20層析柱的pH值為8.2 ;將含h⑶NF上清液過柱，并利用0.59M 0.82M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，得到含有hGDNF的洗脫液。
8.如權(quán)利要求7所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述離子交換層析法中，1.5M的NaCl平衡液中含有IOmM磷酸鹽、5mM EDTA。
9.如權(quán)利要求7所述的用哺 乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述步驟S5中，凝膠過濾層析法的步驟為:將含有hGDNF的洗脫液放入50mM的NaCl溶液中，用HiPr印26/10層析柱除鹽、濃縮、凍干，然后將樣品溶解在純凈水中，以0.5ml/分的速率上Superdex200HR10/30層析柱，使用AKTA純化儀10進(jìn)行純化，從而得到所述高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
10.如權(quán)利要求9所述的用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于:所述凝膠過濾層析法中50mM的NaCl溶液的pH為8.2，且含有IOmM磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)高純度糖基化的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，包括如下步驟構(gòu)建哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hGDNF；選用HEK293細(xì)胞作為工程細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1-hGDNF導(dǎo)入所述HEK293細(xì)胞內(nèi)，得到穩(wěn)定表達(dá)hGDNF的HEK293細(xì)胞；用ELISA方法篩選出高產(chǎn)率穩(wěn)定表達(dá)hGDNF的HEK293克隆細(xì)胞株作為生產(chǎn)hGDNF的工程株；在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述工程株，將上清液不斷收集，并更換新的DMEM培養(yǎng)基，收集后的上清液經(jīng)過離心、過濾、調(diào)pH值為8.2，得到含hGDNF上清液；通過離子交換層析法和凝膠過濾層析法對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。利用本發(fā)明生產(chǎn)的重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子糖基化程度和純度均高于用原核細(xì)胞生產(chǎn)的同類產(chǎn)品。
文檔編號C07K14/475GK103173489SQ20131005861
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者曹杰 申請人:濰坊易思特生物科技有限公司