用于合成取代的內(nèi)酰胺的生物催化劑和方法
【專利摘要】本
【發(fā)明內(nèi)容】
涉及能夠胺化二羰基底物的轉(zhuǎn)氨酶多肽，并且涉及制備和使用所述轉(zhuǎn)氨酶多肽的多核苷酸、載體、宿主細胞和方法。
【專利說明】用于合成取代的內(nèi)酰胺的生物催化劑和方法
1.【技術領域】
[0001]本公開內(nèi)容涉及生物催化劑和使用該生物催化劑來制備含環(huán)氮原子的雜環(huán)的方法。
[0002]2.參考序列表、表格或計算機程序
[0003]序列表的正式復本作為ASCII格式化文本文件與說明書經(jīng)EFS-Web同時被提交，文件名為“CX2-097W02_ST25.txt”，創(chuàng)建日期為2012年9月7日，且大小為1，826，728字節(jié)。經(jīng)EFS-Web提交的序列表為本說明書的一部分，并且通過引用整體并入本文。
[0004]3.背景
[0005]內(nèi)酰胺為環(huán)酰胺，并在許多藥物化合物中形成關鍵結(jié)構(gòu)基序。實例包括基于 內(nèi)酰胺的抗生素、口服抗凝劑利伐沙班和抗驚厥藥左乙拉西坦。雖然這些化合物共享
內(nèi)酰胺核，但重要的差異出現(xiàn)在對內(nèi)酰胺環(huán)的氮原子和非羰基碳原子的取代。對內(nèi)酰胺碳環(huán)原子的取代針對降鈣素受體拮抗劑(Paone等人，2007, J.Med.Chem.，50:5564-5567 ；Burgey等人，2008，Org.Lett.，10 (15): 3235-3238)和類阿片受體拮抗劑(美國專利號6，852，713)被描述。各種方法已被開發(fā)用于制備內(nèi)酰胺?；衔锟捎伤峤閷У碾恐嘏磐ㄟ^貝克曼重排(Beckman rearrangement)來形成，例如由環(huán)己酮通過環(huán)己酮月虧(cyclohexanoxime)中間物形成己內(nèi)酰胺。可選的方法是氨基酸的環(huán)化，例如，賴氨酸環(huán)化以形成ε -己內(nèi)酰胺(美國專利公布2007/0149777Α1)。用于制備內(nèi)酰胺的其它方法描述于例如，美國專利號 4，870，173,6, 054，579,6, 150，535,6, 770，658,6, 852，713,7, 276，531和7，378，410。對于合成來說特別具有挑戰(zhàn)性的是取代的內(nèi)酰胺的立體異構(gòu)形式。例如，Burgey等人，同上，描述合成降鈣素基因相關的肽拮抗劑替卡格泮。該合成部分地采用化合物(IR)-1-{[ [2-(2，3-二氟苯基)丙-2-烯基](2, 4-二甲氧基芐基)氨基]擬基} 丁-3-烯基氨基甲酸芐酯的閉環(huán)，使用Grubbs催化劑，以形成受保護的內(nèi)酰胺中間體化合物，隨后是涉及Pd介導的還原，以非對映體過量形成反式內(nèi)酰胺中間體(3R，6S)-6-(2，3-二氟苯基)-2_氧代氮雜環(huán)庚烷(oxoaz印an)-3_基氨基甲酸叔丁酯的兩個步驟。
[0006]鑒于上述情況，希望提供合成內(nèi)酰胺，特別是取代的內(nèi)酰胺的簡易方法，其中合成方法顯示起始材料到內(nèi)酰胺產(chǎn)物的有效轉(zhuǎn)化率，采用溫和的條件，并且其中該方法對取代的內(nèi)酰胺的特定立體異構(gòu)體可以是立體選擇性的。
[0007]4.概述
[0008]本公開內(nèi)容提供具有轉(zhuǎn)氨酶活性的工程化多肽、編碼該多肽的多核苷酸、制備該多肽的方法、以及將該多肽用于二羰基底物化合物的生物催化胺化，然后可將該二羰底物化合物轉(zhuǎn)化為含環(huán)氮原子的雜環(huán)尤其是取代的內(nèi)酰胺的方法。
[0009]因此，在一個方面中，本公開內(nèi)容提供能夠?qū)⒌孜锘衔?轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物化合物I的工程化轉(zhuǎn)氨酶，如 方案I中說明的。
[0010]方案I
[0011]
【權利要求】
1.一種工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽，所述工程化轉(zhuǎn)氨酶多肽包括具有與參考序列SEQ ID NO:4至少80%的序列同一性和與SEQ ID NO:4相比至少在殘基位置X192上的氨基酸殘基差異的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的工程化多肽，其中X192選自A、G、H、K、N、Q、R和S。
3.如權利要求2所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列與SEQID N0:4相比還包括選自以下的一個或多個殘基差異:X2M ；X4F, X4L, X4Y ；X5C, X5F, X5I, X5H, X5K, X5L, X5M,X5N,X5P,X5S,X5T, X5V, X5Y；X6F,X6R, X6S, X6T；X8H ；X9L,X9I,X9Q,X9F ；X10L ；X12H ；X13A,X13F ；X17L ；X18I ；X21L ;X22A,X22H ；X25A ;X27L, X27H, X27P ；X28N ;X29N, X29T ;X30F,X30G ；X31H, X31R ；X34V ；X37S ；X42G ；X43S ；X46R ；X47R ；X48A, X48G, X48R, X48S, X48W ；X49I,X49P ；X50S ；X52H ；X54A, X54L, X54M, X54P, X54R ；X55M ；X56D, X56E, X56W ；X61G ；X61ff ；X62A, X62L,X62N，X62S ；X64C ；X66A,X66S ；X68I ；X69A,X69G, X69T ；X72A ；X80Q；X81K ；X84T ；X85L,X85R ；X88W ；X89L ；X97P, X97T ；X99L ；X101G, X101L, XlOlR ；X102H, X102R ；X102T, X102W ；X103G,X103N, X103V ；X106L, X106S, X106T, X106V ；X107V ；X108T ；X115R ；X117V ；X120F ；X122F,X122M, X122W, X122Y ；X124F, X124K, X124L, X124M, X124N, X124R, X124S, X124W ；X126A,X126C, X126G, X126I, X126T ；X127T ；X128A ；X131F ；X132H ；X134G, X134L, X134S, X134V,X134Y, X134W ；X136F, X136K, X136L, X136M, X136Y ；X139E ；X140A, X140K ；X140M, X140T,X140V ；X141A ；X142M ；X143V ；X144D, X144I ；X146R ；X150L, X150S ；X152A, X152C, X152F,X152G, X152I, X152L, X152R, X152S, X152W ；X155C, X155I, X155L, X155T ；X156A, X156F,X156S, X156T ；X157L ；X159G ；X160L ；X161M, X161N ；X165L, X165N, X165V ；X168E, X168R ；X176C ；X179K ；X185A ；X190M ；X191A, X191G, X191S ；X196L, X196V ；X199L, X199V ；X203M ；X208K ；X209F, X209M, X209Q, X209V ；X210G, X210S ；X215F, X215H, X215L ；X217L ；X223A,X223S, X223T, X223V ；X227I ；X231T ；X233D ；X234L ；X241R ；X256R ；X260Q ；X263V ；X265Y,X265W ；X266N ；X267V ； X269L, X269T ；X270R, X270T ；X273D, X273H, X273M, X273R, X273V ；X274F, X274L, X274R, X274T ；X282I, X282L, X282T, X282V ；X284A, X284P, X284S, X284T,X284V ；X295N, X295S ；X296D, X296L, X296R, X296S, X296W ；X297D ；X297G ；X300G, X300L ；X305Q, X305T ；X308A ；X309L, X309T, X309W ；X311Q, X311T ；X312C, X312M ；X316L, X316R ；X319R, X319T, X319Y ；X320G, X320Q ；X323C, X323E, X323N, X323R ；X324Q ；X325M, X325P,X325Q, X325V ；X327L, X327R ;和 X329P。
4.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括選自以下的殘基差異的組合:
(a)X192A/X192S和 X215H ；
(b)X124W、X126A、X136L/X136F 和 X192A/X192N/X192S ；
(c)X124W、X126A、X136L、X152L/X152W/X152I 和 X192A ；
(d)X54L、X124W、X126A、X136L、X192A、X215H 和 X223S ；
(e)X54L、X64C、X124W、X126A、X136L、X192A 和 X215H ；
(f)X124W、X126A、X136L、X140K、X150S、X1551、X192A、X196L、X215H 和 X227I ；
(g)X54L、X124W、X126A、X136L、X1551、X156T、X157L、X192A、X215H 和 X223S ；
(h)X54P、X64C、X124W、X126A、X136L、X1551、X156T、X157L、X192A 和 X215H ；
(i)X124W、X126A、X136L、X143V、X150S、X156T、X159G、X192A、X215H、X223S 和 X227I ；(j) X54P、X56E、X64C、X124W、X126A、X136L、X139E、X140K、X143V、X150S、X156T、X192A和X215H ;以及
(k)X124W、X126A、X136L、X140K、X143V、X1551、X156T、X157L、X192A、X199V、X215H、X223S、X227I 和 X231T。
5.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括選自以下的殘基差異的組合:
(a)X136L和 X192A ；
(b)X124L和 X192A ；
(c)X124W、X126A、X136L、X192A 和 X284A ；
(d)X122W、X124F、X126A、X192A 和 X284V ；
(e)X124W、X126A、X136L、X143V、X150S、X156T、X159G、X192A、X215H、X223S 和 V227I ；以及
(f)X54P、X64C、X124W、X126A、X139E、X143V、X1551、X157L、X159G、X192A、X199V、X215H和 X227I。
6.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括選自以下的序列:SEQID NO:16、18、20、26、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、136、138、140、142、144、162、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304 以及 SEQ IDNO: 306-854中的偶數(shù)序列標識符。
7.一種工程化多肽，所述工程化多肽包括具有與SEQ ID NO:4至少80%的序列同一性和與SEQ ID NO:4相比選自以下的一個或多個殘基差異的氨基酸序列:X2M ；X4F, X4L ；X5C,X5F, X5M, X5P, X5Y ；X6F, X6R, X6S, X6T ；X8H ；X9I, X9F, X9L ；X10L ；X12H ；X13A, X13F ；X17L ；X18I ；X21L ;X22A，X22H ；X25A ；X27L, X27H, X27P ；X28N ;X29N，X29T ;X30F，X30G ;X31H，X31R ；X34V ；X37S ；X42G ；X43S ；X46R ；X47R ；X48R, X48S, X48W ；X49I, X49P ；X50S ；X52H ；X54A,X54L, X54M, X54P, X54R ；X55M ；X56D, X56E, X56W ；X61G ；X61ff ；X62A, X62L, X62N, X62S ；X64C ；X66A, X66S ；X68I ；X69A, X69G, X69T ；X72A ；X80Q ；X81K ；X84T ；X85L, X85R ；X88ff ；X89L ；X97P, X97T ；X99L ；X101G, X101L, XlOlR ；X102H, X102R ；X102T, X102W ；X103G, X103N, X103V ；X106L, X106S, X106T, X106V ；X107V ；X108T ；X115R ；X117V ；X120F ；X122F, X122M, X122W,X122Y ；X124F, X124K, X124L, X124M, X124N, X124R, X124S, X124W ；X126A, X126C, X126G,X126I, X126T ；X127T ；X128A ；X131F ；X132H ；X134G, X134L, X134S, X134V, X134Y, X134W ；X136F, X136K, X136L, X136M, X136Y ；X139E ；X140A, X140K ；X140M, X140T, X140V ；X141A ；X142M ；X143V ；X144D, X144I ；X150L, X150S ；X152A, X152C, X152F, X152G, X152I, X152L,X152R, X152S, X152W ；X155C, X155I, X155L, X155T ；X156A, X156F, X156S, X156T ；X157L ；X159G ；X160L ；X161M, X161N ；X165L, X165N, X165V ；X168E, X168R ；X176C ；X179K ；X185A ；X190M ；X191A, X191G, X191S ；X192A, X192G, X192H, X192K, X192N, X192Q, X192R, X192S ；X196L, X196V ；X199L, X199V ；X203M ；X208K ；X209F, X209M, X209Q, X209V ；X210G ；X215H,X215L ；X217L ；X223A, X223S, X223T, X223V ；X227I ；X231T ；X233D ；X234L ；X241R ；X256R ；X260Q ；X263V ；X265Y, X265W ；X266N ；X267V ；X269L, X269T ；X270R, X270T ；X273D, X273H,X273M, X273R, X273V ；X274F, X274L, X274R, X274T ；X282I, X282L, X282T, X282V ；X284A,X284P, X284S, X284T, X284V ；X295N, X295S ；X296D, X296L, X296R, X296S, X296W ；X300G,X300L ；X305Q, X305T ；X308A ；X309L, X309T, X309W ；X311Q, X311T ；X312C, X312M ；X316L,X316R ；X319R, X319T, X319Y ；X320G, X320Q ；X323C, X323E, X323N, X323R ；X324Q ；X325M,X325P, X325Q, X325V ；X327L, X327R ;和 X329P。
8.如權利要求7所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDN0:4相比還包括選自以下的一個或多個殘基差異:X42G ；X54P ；X54R ；X69A ；X69G ；X69T ；X122M ；X124F ；X124L ；X124N ；X124R ；X126A ；X126T ；X136Y, X136F ；X150S ；X152C ；X152G ；X152I ；X152L ；X152S ；X156A ；X156S ；X156T ；X157L ;和 X165N。
9.如權利要求7所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括選自以下的殘基差異的組合:
(a)X124ff和 X327L ；
(b)X209M和 X300G ；
(c)X122F、X223V和 X284A ；
(d)XI92A、X215H和 X311T ；
(e)X62N、X124F、X126A和 X136L ；
(f)X124W、X126A、X136L、X192A 和 X284A ；以及
(g)X124W、X126A、X136L、X152R/X152L/X152I 和 X192A。
10.如權利要求1或7所述的工程化多肽，所述工程化多肽能夠在適當?shù)姆磻獥l件下，將化合物2轉(zhuǎn)化為化合物1，
11.如權利要求1或7所述的工程化多肽，所述工程化多肽能夠在適當?shù)姆磻獥l件下以至少1.5倍的SEQ ID NO:4的活性將化合物2轉(zhuǎn)化為化合物Id和化合物la，
12.如權利要求11所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列與SEQID NO:4相比還包括選自以下的至少一個或多個殘基差異:X54A ；X54L ；X56D ；X56E ；X61G ；X61ff ；X62A ；X62L ；X62N ；X62S ；X64C ；X68I ；X122F, X122W ；X122Y ；X124K ；X124M ；X124S ；X124ff ；X126C ；X126I ；X136K ；X136L ；X136M ；X139E ；X140K ；X143V ；X150L ；X155I ；X155L ；X159G ；X160L ；X176C ；X192A ；X192G ；X192H ；X192K ；X192N ；X192Q ；X192R ；X192S ；X199L ；X199V ；X209F ；X209M ；X209Q；X209V ；X223S ；X223T ；X223V ；X227I ；X282L, X282V ；X284A ；X284P ；X284S ；X284T ;和X284V。
13.如權利要求1或4所述的工程化多肽，所述工程化多肽能夠以相比于化合物Ib和化合物Ic大于8:1的非對映體比將化合物2轉(zhuǎn)化為化合物Id和化合物la，
14.如權利要求13所述的工程化多肽，所述氨基酸序列與SEQIDN0:4相比還包括選自以下的一個或多個殘基差異:X62N, X62A, X62S ；X62L ；X124ff, X124F ；X124K ；X124L ；Χ124Μ ；Χ124Ν ；X124R ；X124S ；X136F ；X136K ；X136L ；X136M ；X136Y ；X152A ；X152C ；X152F ；X152G ；X152I ；X152L ；X152R ；X152S ；X152ff ；X192A ；X192G ；X192H ；X192K ；X192N ；X192Q ；X192R ；X192S ；X215H ；X215L ；X284V ；X284A ；X284P ；X284S 和 X284T。
15.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼如權利要求1至14中任一項所述的工程化多肽。
16.如權利要求15所述的多核苷酸，所述多核苷酸包括選自SEQID NO:5-853中的奇數(shù)序列標識符的核苷酸序列。
17.—種表達載體,所述表達載體包括如權利要求15或16所述的多核苷酸。
18.如權利要求17所述的表達載體，所述表達載體包括控制序列。
19.一種宿主細胞，所述宿主細胞包括如權利要求15或16所述的多核苷酸或如權利要求17或18所述的表達載體。
20.一種制備如權利要求1至14中任一項所述的轉(zhuǎn)氨酶多肽的方法，所述方法包括在適合所述多肽的表達的條件下培養(yǎng)如權利要求19所述的宿主細胞。
21.如權利要求20所述的方法，所述方法還包括分離所述多肽。
22.—種用于制備式I的化合物的方法，
23.如權利要求22所述的方法，其中L選自:C1、Br、-ORf、-OC(O) Rf、_SRfjP -OPO3,其中每個Rf獨立于其他Rf，選自(C1-C6)烷基或芳基。
24.如權利要求22所述的方法，其中L為-ORf、其中Rf選自任選地取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。
25.如權利要求22所述的方法，其中A選自任選地取代的苯基、吡啶基、吲哚基和萘基。
26.如權利要求22所述的方法，其中R1為任選地取代的(C1-C6)烷基。
27.如權利要求22所述的方法，其中Ra和Rb選自H和-NRdRe。
28.如權利要求22所述的方法，其中A具有選自以下的一個或多個取代基:-0Rg、-C00H、-SOy-SR1VNRiRj、-N02、-CN、鹵素、烷基和芳基，其中nf和Rj選自H和(C「C6)烷基。
29.如權利要求22所述的方法，其中所述保護基團選自叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、三氯乙基氯甲酸酯基(Troc)、對甲氧基芐基羰基(Moz)、3，4-二甲氧基芐基(DMPM)、對甲氧基芐基(Pmb)、甲苯磺?；?Ts)和芐氧羰基(Cbz)。
30.如權利要求22至29中任一項所述的方法，其中η為2或3。
31.如權利要求22所述的方法，其中所述式II的底物化合物包括式2ρ的化合物
32.一種用于以相比于化合物Ibl和化合物Icl大于8:1的非對映體比，制備化合物Idl和化合物Ial的方法
33.如權利要求22至32中任一項所述的方法，其中所述底物化合物是以約0.5至約200g/L、l至約200g/L、5至約150g/L、約10至約100g/L或約50至約100g/L的載量。
34.如權利要求33所述的方法，其中所述底物化合物是以約0.5、1、5、10、20、30、40、50、100、150 或 200g/L 的載量。
35.如權利要求22至32中任一項所述的方法，其中所述適當?shù)姆磻獥l件包括約1%至約 80% (v/v)、約 1%至約 70% (v/v)、約 2%至約 60% (v/v)、約 5%至約 40% (v/v)U0%至約 40% (v/v)、10%至約 30% (v/v)或約 10%至約 20% (v/v)的 DMSO 濃度。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述氨基供體為異丙胺。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述異丙胺是以約0.1至約3.0M、0.2至約2.5M、約0.5至約2M或約I至約2M的濃度。
38.如權利要求22至37中任一項所述的方法，其中所述適當?shù)姆磻獥l件包括(a)約10至100g/L的底物化合物的底物載量；(b)約I至40g/L的轉(zhuǎn)氨酶多肽濃度；(c)約0.1至10M的IPM濃度；(d)約0.1至ImM的PLP輔因子濃度；(e)約8.5至11的pH ；以及(f)約30至60°C的溫度。
39.如權利要求22至38中任一項所述的方法，其中所述適當?shù)姆磻獥l件包括:約50g/L底物化合物、約20g/L或更少的轉(zhuǎn)氨酶多肽、約50% (v/v) 二甲基亞砜(DMSO)J^ IM異丙胺(IPM)、約ImM磷酸吡哆醛(PLP)、約0.2M硼酸鹽、約pH10.5以及約55°C。
40.一種用于制備式III的化合物的方法
41.如權利要求40所述的方法，其中所述式III的化合物包括化合物3p，
42.如權利要求40所述的方法，其中所述式III的化合物包括化合物3dl和化合物3al

【文檔編號】C07K14/435GK103998461SQ201280054745
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權日:2011年9月8日
【發(fā)明者】法比安·L·卡比羅爾, 陳海濱, 阿努潘·茍呵爾, 寶琳娜·薩利姆, 德里克·史密斯, 雅各布·杰恩, 波吉特·科斯耶克, 鄧永琳, 海倫·謝, 范森 申請人:科德克希思公司