熱穩(wěn)定性碳酸酐酶及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明的組合物和方法涉及熱穩(wěn)定性碳酸酐酶、編碼所述碳酸酐酶的多核苷酸、以及其制備和／或使用方法。含有所述碳酸酐酶的制劑適用于提取二氧化碳。
【專利說明】熱穩(wěn)定性碳酸酐酶及其使用方法
[0001]交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月10日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT / CN2011 / 073886、2011年5月10日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT / CN2011 / 073876、2011年5月10日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT / CN2011 / 073873、2011年5月10日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT /CN2011 / 073871、2011 年 12 月 21 日提交的中國 PCT 申請?zhí)?PCT / CN2011 / 084371,2011年12月21日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT / CN2011 / 084366、2011年12月21日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT / CN2011 / 084363、2011年12月21日提交的中國PCT申請?zhí)朠CT /CN2011 / 084384、2011年12月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1 / 578408、2011年12月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1 / 578429、2011年12月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /578416以及2011年12月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1 / 578421的優(yōu)先權(quán)，特此明確地將這些臨時申請的提交日期以及各臨時申請全文以引用的方式并入?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003]世界上大部分的電力是由諸如煤、天然氣和燃料油之類的化石燃料的燃燒產(chǎn)生的。二氧化碳(CO2)是燃燒的副產(chǎn)物并且是主要的溫室氣體。因此，CO2排放物被認(rèn)為是全球變暖現(xiàn)象的主要促成因素，全球變暖現(xiàn)象可能導(dǎo)致劇烈的氣候變化(例如，狂暴的天氣模式、降水變化、海平面上升以及溫度升高)。另外，因為CO2是一種酸性氣體，所以它在水的存在下形成腐蝕性產(chǎn)物碳酸。
[0004]已經(jīng)提出若干種提取CO2的方法，包括利用藻類轉(zhuǎn)化、封存在海洋中、儲存在廢棄的油井和天然氣井中、溶解在深層地下水位中以及轉(zhuǎn)化為碳酸鹽。然而，這些方法中許多具有顯著的缺點(diǎn)，并且往往在經(jīng)濟(jì)上或生態(tài)上不可行。
[0005]碳酸酐酶(EC4.2.1.1 ；以及CAS N0.9001-03-0)可催化二氧化碳與碳酸氫鹽之
間的相互轉(zhuǎn)化[CO2 + H2O O HCO3- + H+]。大部分碳酸酐酶的活性位點(diǎn)含有鋅離子，因
此，這些酶也歸類為金屬酶。碳酸酐酶可充當(dāng)生物催化劑來加速CO2的捕獲。天然存在的碳酸酐酶通常在低溫下起作用并且不太適于從熱燃燒氣體中提取co2。因此，需要可以在不適合條件下(例如，高溫、堿性pH和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下)有效地水合CO2的碳酸酐酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本公開提供涉及來自吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)、維也納原小單孢菌(Promicromonospora vindobonensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)、始方定鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、粘瓊月旨芽抱桿菌(Bacillus agaradhaerens)、弧菌屬物種AND4 (Vibrio sp.AND4)、弧菌屬物種Ex25 (Vibrio sp.Ex25)的重組碳酸酐酶的組合物和方法、編碼這些碳酸酐酶的多核苷酸，以及其制備和/或使用方法。含有這些重組碳酸酐酶的制劑適用于提取二氧化碳。
[0007]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自吉氏芽孢桿菌的重組碳酸酐酶l(Bgi CA1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自維也納原小單孢菌的重組碳酸酐酶l(Pvi CA1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及克隆自土曲霉的重組碳酸酐酶l(Ate CA1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自始旋鏈霉菌的重組碳酸酐酶l(Spr CA1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自粘瓊脂芽孢桿菌的重組碳酸酐酶l(Bag CA1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自弧菌屬物種AND4的重組碳酸酐酶I (Vsp CAl)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自弧菌屬物種Ex25的重組碳酸酐酶I (VspE CAl)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法涉及來自弧菌屬Ex25的重組碳酸酐酶II (VspE CA2)。含有一種或多種所述重組碳酸酐酶的制劑適用于從含二氧化碳的介質(zhì)(例如燃燒廢氣和煙道氣流)中提取二氧化碳。
[0008]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136 具有至少 55% (例如，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。
[0009]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含氨基酸序列的重組多肽，其中該氨基酸序列具有碳酸酐酶活性，其中該氨基酸序列在較高離子強(qiáng)度下具有較高的熱穩(wěn)定性和/或解鏈溫度，并且其中該氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:43,SEQID NO:53,SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或SEQ ID NO:136 具有至少 70%同一I"生。
[0010]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含氨基酸序列的重組多肽，其中當(dāng)在約8至約10.5的pH下溫育30分鐘或更長時間時該氨基酸序列具有大于25%的該碳酸酐酶活性的碳酸酐酶活性，并且其中該氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:28, SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136具有至少70%同一性。
[0011]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少55% (例如，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在25°C至40°C的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于70% (例如，大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至10.5的pH下)時，該多肽保持至少90% (例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至10.5的pH下)時，該多肽保持至少90%(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至9.5的pH下)時，該多肽保持至少50%(例如，至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在10.5的pH下)時，該多肽保持至少25 % (例如，至少25 %、至少35 %、至少45 %、至少55 %、至少65 %、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少50% (例如，至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度 。
[0012]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少55% (例 55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )
同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在8.5至9.5的pH下溫育5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在25°C至40°C的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于70% (例如，大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至9.5的pH下)時，該多肽保持至少80% (例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至9.5的pH下)時，該多肽保持至少80 % (例如，至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至
9.5的pH下)時，該多肽保持至少40% (例如，至少40%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在10.5的pH下)時，該多肽保持至少25% (例如，至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少50 % (例如，至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。
[0013]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:43具有至少55% (例 55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )
同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在8.0至11 (例如，8.0至10.5、8.5至10.5、8.5至11、8.5至10、8.0至10、9.0至11等)的pH下溫育5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在25°C至40°C的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于70% (例如，大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至10.5的pH下)時，該多肽保持至少90% (例如，至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至10.5的pH下)時，該多肽保持至少80% (例如，至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在8.5至10(例如，8.5至9.5、8.5至10、9至10等)的pH下)時，該多肽保持至少40% (例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在10.5的pH下)時，該多肽保持至少25% (例如，至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少50%(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。在相關(guān)的實(shí)施例中，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有增加的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氫鹽下)，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽下)具有較高的解鏈溫度。
[0014]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:53具有至少55% (例55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在8至10 (例如，8至9.5、8.5至9.5、8.5至10、8至10等)的pH下溫育5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在25°C至40°C的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于50% (例如，大于50%、大于60%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在8至11 (例如，8至10.5、8.5至10.5、8.5至11、8.5至10等)的pH下)時，該多肽保持至少70 % (例如，至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時(在一些實(shí)施例中是在 8.5 至 10.5 (例如，8.5 至 10、8.5 至 10.5、8.5 至 9.5、8 至 10、8 至 9.5 等)的 pH 下)時，該多肽保持至少50 % (例如，至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少
95%、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約2小時(在一些實(shí)施例中是在8至11 (例如，8至10.5、
8.5至10.5、8.5至11、8.5至10、9至10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少30% (例如，至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約2小時(在一些實(shí)施例中是在8、8.5、9.0、9.5、10、10.5或11的pH下)時，該多肽保持至少15% (例如，至少15%、至少20%、至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少50% (例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。
[0015]在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID N0:64具有至少55% (例55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約8.0至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8.5至約10、約9至約10.5等)的pH下溫育5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在約20°C至約55°C (例如，約25°C至約50°C、約30°C至約45°C、約35°C至40°C等)的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于70% (例如，大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約3、約5、約10、約24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在8.0至11 (例如，8.5至10.5、8.5至
9.5、9.5至10.5、8.5至10、9至10、9至10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少90%(例如，至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約3、約5、約10、約24小時(在一些實(shí)施例中是在8.0至11 (例如，8.5至10.5、8.5至
9.5、9.5至10.5、8.5至10、9至10、9至10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少90%(例如，至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在約8至約10 (例如，約8.5至約9.5等)的pH下)時，該多肽保持至少50% (例如，至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時(在一些實(shí)施例中是在約9.5至11 (例如，約10至約10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少25%(例如，至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在約20°C至約55°C (例如，約25°C至約50°C、約20°C至約50°C、約30°C至約50°C等)的溫度下溫育長達(dá)10小時(例如，I至3小時、I至5小時、I至7小時、I至9小時等)時，該多肽保持至少50% (例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在IM至2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。
[0016] 在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:80具有至少55% (例55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約8至約11(例如，約8至約10.5、約8.5至約9.5、約8.2至約10.6、約8.5至約10.5、約8.4至約10.2、約8.6至約10、或9.5至約10.5等)的pH下溫育3個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在20°C至55°C (例如，25°C至50°C、30°C至45°C、35°C至40°C等)的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于50% (例如，大于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育至少約1小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8至約10.8、約8.2至約10.6、約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8.6至約10.2、約8.8至約10等)的pH下)時，該多肽保持至少60% (例如，至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育長于約1小時、約3小時、約5小時、約10小時、約24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約10 (例如，約8至約10.8、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8.2至約10.6、約8.5至約10.5、約8.6至約10.2、約8.8至約10等)的pH下)時，該多肽保持至少50% (例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約I小時、約3小時、約5小時、約10小時或至少24小時(在一些實(shí)施例中是在約8.5的pH下)時，該多肽保持至少50% (例如，至少50 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約1小時、約2小時或約3小時(在一些實(shí)施例中是在約
9.5至約10.5的pH下)時，該多肽保持至少20% (例如，至少20%、至少25%、至少35%、至少45%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在約20°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少30% (例如，至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下溫育10分鐘至40分鐘時，該多肽保持至少約30% (例如，至少30%、至少35%、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %或至少70 % )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。在相關(guān)的實(shí)施例中，該多肽在較高離子強(qiáng)度下具有增加的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度下(例如，在0.8M碳酸氫鹽下、在0.6M碳酸氫鹽下、在0.4M碳酸氫鹽下、在0.2M碳酸氫鹽下或在0.1M碳酸氫鹽下等)，該多肽在較高離子強(qiáng)度下(例如，在IM碳酸氫鹽下)可適宜地具有升高的解鏈溫度。
[0017] 在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:130具有至少55% (例55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10.5等)的pH下溫育I個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個小時(在一些實(shí)施例中在約20°C至約55°C (例如，約25°C至約50°C、約25°C至約40°C、約40°C至約55°C等)的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于50% (例如，大于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約30分鐘或更長時間、I小時或更長時間、2小時或更長時間、3小時或更長時間、5小時或更長時間、10小時或更長時間、15小時或更長時間、或甚至24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約9.5至約10.5、約8.5至約9.5)的pH下)時，該多肽保持至少60 % (例如，至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時、約5小時、約10小時、約15小時或約24小時(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少70% (例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少30% (例如，至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、I小時、2小時或3小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8.5至約11的pH(例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10.5、或約8、約8.5、約9.0、約9.5、約10、約10.5或約11的各個pH)下)時，該多肽保持至少15% (例如，至少15%、至少20%、至少25%、至少35%、至少45%、至少55 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少
96%、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時或更長時間時，該多肽保持至少30% (例如，至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，這些高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。在相關(guān)的實(shí)施例中，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有改善或較高的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度(例如，0.8M碳酸氫鹽、0.6M碳酸氫鹽、0.4M碳酸氫鹽、0.2M碳酸氫鹽、0.1M碳酸氫鹽等)下的解鏈溫度，該多肽在較高離子強(qiáng)度(例如，IM碳酸氫鹽)下具有較高的解鏈溫度。
[0018] 在一個方面，提供重組多肽，包含與氨基酸序列SEQ ID NO:136具有至少55% (例55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )同一性的氨基酸序列，其中該多肽具有碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組多肽包含在堿性的高離子強(qiáng)度溶液中。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10等)的pH下溫育30分鐘或更長時間、I小時、2小時、3小時、5小時、10小時或更長時間(在一些實(shí)施例中在20°C至55°C (例如，25°C至40°C、40°C至55°C、20°C至50°C等)的溫度下進(jìn)行)時，該多肽保持大于25% (例如，大于25%、大于30%、大于35%、大于40%、大于45%、大于50%、大于55%、大于60%、大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約25°C的溫度下溫育至少約30分鐘、至少約I小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10等)的pH下)時，該多肽保持至少40% (例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約40°C的溫度下溫育至少30分鐘、至少I小時、至少2小時、至少5小時、至少10小時或至少24小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10等)的pH下)時，該多肽保持至少60% (例如，至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在約8至約11 (例如，約8.5至約9.5、約8.5至約10.5、約8至約10、約9.5至約10.5等)的pH下)時，該多肽保持至少25% (例如，至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時或更長時間(在一些實(shí)施例中是在10.5的pH下)時，該多肽保持至少25 % (例如，至少25 %、至少35 %、至少45 %、至少55 %、至少65 %、至少70 %、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時，該多肽保持至少40% (例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )的該碳酸酐酶活性。在一些實(shí)施例中，該高離子強(qiáng)度條件包含IM碳酸氫鹽。在一些實(shí)施例中，該多肽在1-2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。在相關(guān)的實(shí)施例中，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有增加或較高的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度(例如，0.8M碳酸氫鹽、0.6M碳酸氫鹽、0.4M碳酸氫鹽、0.2M碳酸氫鹽或0.1M碳酸氫鹽等)下，該多肽在較高離子強(qiáng)度(例如，IM碳酸氫鹽)下具有較高的解鏈溫度。[0019]在一些實(shí)施例中，多肽包含一種氨基酸序列，該氨基酸序列與氨基酸序列SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQID NO:130或SEQ ID NO:136具有至少70% (例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少 99%或 100% )同一性，與氨基酸序列 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136具有至少80% (例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )同一性，與氨基酸序列 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:64,SEQID NO:80,SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136 具有至少 90% (例如，至少 90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )同一性，或與氨基酸序列 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:
53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136 具有至少 95% (例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% )同一性。還提供包含重組多肽和含二氧化碳的介質(zhì)的組合物。在一些實(shí)施例中，重組多肽被固定化。在一些實(shí)施例中，重組多肽被固定在聚合物、膜、基質(zhì)、膠束材料、圓片(wafer、)、固體支撐物或微粒上。
[0020]在某些方面，提供分離的核酸，其編碼任何前述段落的重組多肽。在一些實(shí)施例中，多肽還包含信號肽序列。在一些實(shí)施例中，該信號肽和碳酸酐酶多肽源于不同的微生物。在某些實(shí)施例中，該信號肽序列選自SEQ ID NO:10-15、69-73、81-83和131-132。還提供包含與調(diào)節(jié)序列有效組合的分離的核酸的表達(dá)載體。另外，提供包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，提供組合物，其包含宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基。
[0021]在某些方面，提供制備碳酸酐酶的方法，包括:在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述段落的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生碳酸酐酶。還提供包含根據(jù)本文提供的方法在培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生的碳酸酐酶的組合物。
[0022]在另一個方面，提供從含二氧化碳的介質(zhì)中提取二氧化碳的方法，包括:使該含二氧化碳的介質(zhì)與前述段落之一的多肽接觸以得到二氧化碳減少的介質(zhì)。在一些實(shí)施例中，含二氧化碳的介質(zhì)是選自氣體、液體和多相混合物。在一些實(shí)施例中，含二氧化碳的介質(zhì)是選自煙道氣、原天然氣、合成氣、氫氣和沼氣的氣體。在一些實(shí)施例中，含二氧化碳的介質(zhì)是燃燒或發(fā)酵的副產(chǎn)物。
[0023]在某些方面，提供調(diào)節(jié)含有CO2和碳酸氫鹽中的一者或二者的介質(zhì)的pH的方法，包括:使該介質(zhì)與前述段落之一的多肽接觸以得到具有改變的PH的介質(zhì)。
[0024]本文還提供碳酸酐酶或其合適的變體，其已經(jīng)被工程化以在確定的堿性pH下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下實(shí)現(xiàn)改善的熱穩(wěn)定性、改善的活性/穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，碳酸酐酶是來源于吉氏芽孢桿菌碳酸酐酶的重組碳酸酐酶 。
[0025]在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130 或 SEQ IDNO:136具有至少55%同一性的氨基酸序列，或為由這樣的多核苷酸序列編碼的重組碳酸酐酶，該多核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:4U SEQ ID NO:5USEQID NO:62, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:127 或 SEQ ID NO:133 具有至少 50% (例如，55%、60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%)同一性或能夠在中等、高或最大嚴(yán)格性下與SEQ ID NO:USEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:41SEQ ID NO:5USEQ ID NO:62、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:127 或 SEQ ID NO:133 的互補(bǔ)序列雜交。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶在如本文所述的合適宿主生物體中表達(dá)和/或產(chǎn)生。
[0026]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約30°C至約85°C之間(例如，約30 V至約80 V之間、約40 V至約70 V之間、約45 °C至約65 °C之間、約40 V至約60°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約10.0之間(例如，約8.0至約9.8之間、約8.2至約9.6之間、約8.4至約
9.4之間、約8.6至約9.5之間等)的pH下，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高濃度的HC03_存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有升高的解鏈溫度。多肽可因此被稱為在較高離子強(qiáng)度條件下具有改善或增加的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.8M、0.6M、0.4M、0.2M或0.1M碳酸氫鹽下)，多肽的解鏈溫度在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽下)較高。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少55%同一性的氨基酸序列。[0027]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約20°C至約75°C之間(例如，約25 °C至約60 V之間、約30 V至約50 °C之間、約25 °C至約55 °C之間、約35 °C至約65°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11.0之間(例如,約8.0至約9.8之間、約8.2至約9.6之間、約8.4至約9.4之間、約8.6至約9.5之間、約8.5至約10.8之間、約9.0至約10.5之間等)的pH下，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高濃度的HCOf存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在某些相關(guān)的實(shí)施例中，隨著離子強(qiáng)度增加觀測到熱穩(wěn)定性改善和/或增加。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氫鹽下)，在較高離子強(qiáng)度下(例如，在IM碳酸氫鹽下)多肽的解鏈溫度較高。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SE Q ID NO:28具有至少55%同一性的氨基酸序列。
[0028]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約30°C至約85°C之間(例如，約30 V至約80 V之間、約40 V至約70 V之間、約45 °C至約65 °C之間、約40 V至約60°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11.0之間(例如，約8.0至約10.5之間、約8.5至約11之間、約8.5至約10.5之間、約8.5至約10之間、約8.0至約9.5之間、約8.2至約10之間、約8.6至約10.8之間等)的pH下，保持至少約25 % (例如，至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1Μ、0.2Μ、0.5Μ、0.7Μ、0.9Μ、1.0MU.2Μ、1.5Μ、2.0M 或更高濃度的 HCCV 存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約
25%、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，本文提供的多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有改善的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.8,0.6,0.4,0.2或0.1M碳酸氫鹽下)，該多肽在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽下)可適宜地具有較高的解鏈溫度。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID N0:43具有至少55%同一'丨生的氨基酸序列。
[0029]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約30°C至約85°C之間(例如，約30 V至約80 V之間、約40 V至約70 V之間、約45 °C至約65 °C之間、約40 V至約60°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11.0之間(例如，約8.0至約11之間、約8至約10.5之間、約8.5至約10之間、約8.5至約9.8之間、約8.2至約9.6之間、約8.4至約9.4之間、約8.6至約9.5之間等)的pH下,保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約
0.1Μ、0.2Μ、0.5Μ、0.7Μ、0.9Μ、1.0MU.2Μ、1.5Μ、2.0M 或更高濃度的 HCCV 存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約
25%、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%或更高)的活性。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:53具有至少55%同一性的 氨基酸序列。
[0030]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約20°C至約85°C之間(例如，約25 °C至約80 V之間、約30 V至約70 °C之間、約35 °C至約65 °C之間、約40 V至約60°C之間等)的溫度下溫育時,保持至少約30% (例如，至少約40%、至少約50%、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11之間(例如,約8.0至約10.5之間、約8.5至約9.5之間、約8.2至約
10.2之間、約8.4至約10之間、約8.6至約9.8之間、約8.5至約10.5之間、約9.5至約
10.5之間等)的pH下，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約
0.1Μ、0.2Μ、0.5Μ、0.7Μ、0.9Μ、1.0MU.2Μ、1.5Μ、2.0M 或更高濃度的 HCCV 存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約
25%、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，碳酸酐酶在較高離子強(qiáng)度條件下具有較高或增加的熱穩(wěn)定性和/或解鏈溫度。例如，相比于在較低濃度的碳酸氫鹽下(例如，在
0.8,0.6,0.4,0.2或0.1M碳酸氫鹽下)的解鏈溫度，碳酸酐酶多肽在較高濃度的碳酸氫鹽下(例如，在IM碳酸氫鹽下)適宜地具有較高的解鏈溫度。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:64具有至少55%同一性的氨基酸序列。
[0031]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約20°C至約55°C之間(例如，約20V至約50V之間、約25°C至約50°C之間、約25°C至約40°C之間、約40V至約55°C之間等)的溫度下溫育時,保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性PH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11 (例如，約8.0至約10.8、約8.2至約10.6、約8.5至約10.5、約8.2至約10、約8.4至約9.8、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5等)的pH下持續(xù)至少約0.5、約1.0、約2.0、約3.0、約4.0或約
5.0小時或更長時間的一段時間，保持至少約20% (例如，至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高濃度的HC03_存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約20% (例如，至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，碳酸酐酶多肽在較高離子強(qiáng)度下具有增加的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.SM碳酸氫鹽下、在0.6M碳酸氫鹽下、在0.4M碳酸氫鹽下、在0.2M碳酸氫鹽下或在0.1M碳酸氫鹽下等)，碳酸酐酶多肽在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽下)可適宜地具有較高的解鏈溫度。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQID NO:80具有至少55%同一性的氨基酸序列。
[0032]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約20°C至約55°C之間(例如，約20V至約50°C之間、約25°C至約55°C之間、約25°C至約40°C之間、約30V至約50°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%、至少約95%或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在確定的堿性pH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11之間(例如，約8.5至約10.5之間、約8.5至約9.5之間、約9.5至約10.5之間、約8至約10之間等)的pH下，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高濃度的HC03_存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少30分鐘、至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，碳酸酐酶多肽在較高離子強(qiáng)度條件下適宜地具有增加或改善的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度下(例如，在0.8M碳酸氫鹽下、在0.6M碳酸氫鹽下、在0.4M碳酸氫鹽下、在0.2M碳酸氫鹽下、或在0.1M碳酸氫鹽下等)，該多肽在較高離子強(qiáng)度下(例如，在IM碳酸氫鹽下)可適宜地具有較高的解鏈溫度。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:130具有至少55%同一性的氨基酸序列 。
[0033]在一些實(shí)施例中，改善的熱穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約20°C至約85°C之間(例如，約20V至約80V之間、約20V至約70V之間、約30°C至約65°C之間、約40V至約60°C之間)的溫度下溫育時,保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%、至少約95%或更高百分比)的酶活性。在一些實(shí)施例中，在某一堿性pH下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:在約8.0至約11之間(例如，約8.0至約10之間、約8.5至約10.5之間、約8.5至約9.5之間、約9.5至約10.5之間等)的pH下，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高)的活性。在一些實(shí)施例中，在高濃度的碳酸氫鹽存在下改善的活性/穩(wěn)定性通過如下體現(xiàn)或證明:當(dāng)在約0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、
1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高濃度的HC03_存在下溫育該酶持續(xù)較長的一段時間(例如，持續(xù)至少I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、12小時、24小時、若干天、一個星期、若干個星期、一個月或更長時間)時，保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或更高)的活性。在相關(guān)的實(shí)施例中，碳酸酐酶多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有增加或較高的熱穩(wěn)定性。例如,相比于在較低離子強(qiáng)度(例如,0.8M碳酸氫鹽、0.6M碳酸氫鹽、0.4M碳酸氫鹽、0.2M碳酸氫鹽、0.1M碳酸氫鹽等)下，碳酸酐酶多肽在較高離子強(qiáng)度(例如，IM碳酸氫鹽)下具有較高的解鏈溫度。在某些實(shí)施例中，重組碳酸酐酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:136具有至少55%同一'丨生的氨基酸序列。
[0034]使用碳酸酐酶將CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽的二氧化碳捕獲或封存(sequestration)工藝通常涉及使用在某些胺溶劑或碳酸鹽水溶液中固定化或可溶的碳酸酐酶。因此，本公開的碳酸酐酶多肽，除了高溫(例如，處于或高于401:、501:、601:、701:或80°0下的良好穩(wěn)定性和/或在高離子強(qiáng)度(例如，處于或約0.5、1.0、1.5,2.0,2.5或甚至3.0M碳酸氫鹽)下的高活性/穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性之外，在一些方面中還適宜地具有當(dāng)暴露于胺溶劑(例如，處于或高于在工業(yè)用途中為固定CO2通常用于固定化或增溶碳酸酐酶的胺溶劑的濃度)時的高穩(wěn)定性。
[0035]此外，煙道氣(其為燃煤發(fā)電廠產(chǎn)生的燃燒廢氣)通?？砂?不限于)氧氣、氮?dú)?、二氧化碳、水蒸氣以及少量的一氧化碳、氮氧化物、硫氧化物?或重金屬(例如汞)。因此，本公開的碳酸酐酶多肽，除了高溫下的良好穩(wěn)定性、和/或高離子強(qiáng)度下的高活性/穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性、和/或當(dāng)暴露于胺溶劑時的高穩(wěn)定性之外，在某些方面中還適宜地具有當(dāng)暴露于硫氧化物、氮氧化物和/或重金屬(例如汞)時的穩(wěn)定性。
[0036]此外，天然氣組成可根據(jù)提取這些組合物的來源而變化。例如，它們可主要含有甲燒和不同量的乙燒、丙烷、丁燒、聞級烷烴、氣氣、二氧化碳和氧硫化物。當(dāng)暴露于氧硫化物時，多種先前已知的碳酸酐酶可能失去穩(wěn)定性。然而，本公開的碳酸酐酶多肽，在一些方面中，除了高溫下的良好穩(wěn)定性、和/或高離子強(qiáng)度下的高活性/穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性、和/或當(dāng)暴露于胺溶劑時的高穩(wěn)定性、和/或當(dāng)暴露于硫氧化物、氮氧化物和/或重金屬時的穩(wěn)定性之外，還可能適宜地具有當(dāng)暴露于氫硫化物時的良好穩(wěn)定性。
[0037]本文還提供固定化碳酸酐酶或其固定化變體，以及制備和/或使用此類固定化酶的方法。在一些實(shí)施例中，碳酸酐酶是使用本文提供的多種技術(shù)來固定化的。在某些實(shí)施例中，碳酸酐酶是重組酶。在一些實(shí)施例中，碳酸酐酶在給定條件下(例如，在約8.0至約10.0之間的pH下、在約30 V至85°C之間的溫度下、或在由至少約0.1M (例如，至少約0.2M、至少約0.5M、至少約1M、至少約1.5M、至少約2.0M或更高濃度的)HC03_所賦予的離子強(qiáng)度下)的穩(wěn)定性和/或活性高于天然(親本)碳酸酐酶在相同條件下的穩(wěn)定性和/或活性。
[0038]碳酸酐酶組合物和方法的這些和其他方面根據(jù)以下描述將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1提供了 pHPLT02_BgiCAl的質(zhì)粒圖譜。
[0040]圖2A-C提供了 Bgi CAl分別在(A) 8.5、(B) 9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)定性特征圖。
[0041]圖3提供了 Bgi CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0042]圖4提供Bgi CAl的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)與其他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO:16-25)的比對。表1G-1列出了該比對的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。
[0043]圖5提供了 Bgi CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0044]圖6 提供了 pJG183 (A4-celA_PviCAl)的質(zhì)粒圖譜。
[0045]圖7A-C提供了 Pvi CAl分別在(A) 8.5、⑶9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)定性特征圖。
[0046]圖8提供了 Pvi CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0047]圖9提供了 Pvi CAl的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)與其他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO:16、20、21、32-38)的比對。表2G-1列出了該比對的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。
[0048]圖10提供了 Pvi CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0049]圖11提供了 pTTT-AteCAl的質(zhì)粒圖譜。
[0050]圖12A-C提供了 Ate CAl分別在(A) 8.5、(B) 9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)定性特征圖。
[0051]圖13提供了 Ate CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0052]圖14提供了 Ate CAl的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)與其他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO:45-48)的比對。表3G-1列出了該比對的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。
[0053]圖15提供了 Ate CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。[0054]圖16 提供了 pJG187(A4-CelA_SprCAl)的質(zhì)粒圖譜。
[0055]圖17A-C提供了 Spr CAl分別在(A) 8.5、⑶9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)
定性特征圖。
[0056]圖18提供了 Spr CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0057]圖19提供了 Spr CAl的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)與其他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO:54-61)的比對。表4G-1列出了該比對的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。
[0058]圖20提供了 Spr CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0059]圖21提供了 pHPLT02_BagCAl的質(zhì)粒圖譜。
[0060]圖22A-C提供了 Bag CAl分別在(A) 8.5、(B) 9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)定性特征圖。
[0061]圖23提供了 Bag CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0062]圖24提供了 Bag CAl的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:64)與其他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO:16、19、21、21、22、24、25、35、74-76)的比對。表 5G-1 列出了該比對的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。
[0063]圖25提供了 Bag CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0064]圖26提供了 pHPLT02-Vsp CAl的質(zhì)粒圖譜。
[0065]圖27A-C提供了 Vsp CAl分別在(A) 8.5、⑶9.5和(C) 10.5的pH值下的溫度穩(wěn)
定性特征圖。
[0066]圖28提供了 Vsp CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0067]圖29提供了 Vsp CAl及其同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0068]圖30 提供了 pHPLT02_VspE CAl 的質(zhì)粒圖譜。
[0069]圖31提供了 VspE CAl在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
[0070]圖32 提供了 pHPLT02_VspE CA2 的質(zhì)粒圖譜。
[0071]圖33提供了 VspE CA2在IM碳酸氫鈉(NaHCO3)存在下的穩(wěn)定性特征圖。
【具體實(shí)施方式】
[0072]1.引言
[0073]本公開提供涉及來自吉氏芽孢桿菌、維也納原小單孢菌、土曲霉、始旋鏈霉菌、粘瓊脂芽孢桿菌、弧菌屬物種AND4、弧菌屬物種Ex25的重組碳酸酐酶的組合物和方法、編碼所述碳酸酐酶的多核苷酸，以及其制備和/或使用方法。
[0074]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自吉氏芽孢桿菌菌株DSM8722的重組碳酸酐酶(Bgi CAl)的組合物和方法。所述組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Bgi CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。Bgi CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0075]重組Bgi CAl碳酸酐酶已顯示在約8.5至約10.5的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言，重組Bgi CAl當(dāng)在40°C下在約8.5至約10.5的pH下溫育至少約24小時時保持約90%的碳酸酐酶活性，并且當(dāng)在50°C下在約8.5至約9.5的pH下溫育約5小時時保持約40%的碳酸酐酶活性。此外,重組Bgi CAl在碳酸氫鹽溶液中至少約3小時仍保持超過70%的活性。另外，重組Bgi CAl在碳酸氫鹽溶液中在高離子強(qiáng)度條件下具有處于或高于約76°C的解鏈溫度。這些特征使得本文所述的Bgi CAl適用于CO2提取。
[0076]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自維也納原小單孢菌菌株?Μ65009的重組碳酸酐酶(Pvi CAl)的組合物和方法。所述組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Pvi CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。Pvi CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0077]重組Pvi CAl碳酸酐酶已顯示在約8.5至約10.5的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言，重組Pvi CAl當(dāng)在40°C下在約8.5至約9.5的pH下溫育至少24小時時保持大于60%的碳酸酐酶活性。此外，重組Pvi CAl在50°C下在碳酸氫鹽溶液中至少3小時仍保持其全部的碳酸酐酶活性。另外，重組Pvi CAl在高離子強(qiáng)度條件下具有處于或高于約75°C的解鏈溫度。
[0078]在一些實(shí)施例中，描述了涉及克隆自土曲霉NIH2624的重組碳酸酐酶(Ate CAl)的組合物和方法。所述組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Ate CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。Ate CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0079]重組Ate CAl碳酸酐酶已顯示在約8.5至約10.5的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言,重組Ate CAl當(dāng)在40°C下溫 育至少24小時時保持約60%或更大(例如，約65%或更大、約70%或更大、約75%或更大、約80%或更大、約85%或更大)的碳酸酐酶活性。重組Ate CAl當(dāng)在50°C下在約8.5至約9.5的pH下溫育約I小時時還可以保持約50%或更大(例如,約55%或更大、約60%或更大)的碳酸酐酶活性。此外，重組Ate CAl在碳酸氫鹽存在下超過3小時仍保持約70 %或更大(例如，約75 %或更大、約80 %或更大、約85 %或更大)的活性。另外，重組Ate CAl在碳酸氫鹽溶液中在高離子強(qiáng)度條件下具有超過約74°C的解鏈點(diǎn)。此外，重組Ate CAl可具有在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽下)相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氫鹽下)較高的熱穩(wěn)定性和/或解鏈溫度。這些特征使得本文描述的Ate CAl適用于CO2提取。
[0080]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自始旋鏈霉菌株ATCC25486的重組碳酸酐酶(SprCAl)的組合物和方法。所述組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Spr CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。在一些實(shí)施例中，本公開的Spr CAl多肽在較高離子強(qiáng)度條件下具有改善的熱穩(wěn)定性。Spr CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0081]重組Spr CAl碳酸酐酶已顯示在約8.5至約10.5的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言，重組Spr CAl當(dāng)在0°C至40°C之間在8.5至9.5之間的pH下溫育至少24小時時保持超過60%的碳酸酐酶活性。此外，重組Spr CAl在50°C下在碳酸氫鹽溶液中至少約2小時仍保持超過60%的活性。這些特性使得Spr CAl適用于二氧化碳提取。
[0082]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自粘瓊脂芽孢桿菌的重組碳酸酐酶(Bag CAl)的組合物和方法。這些組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Bag CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。還觀測到令人驚訝的是重組碳酸酐酶在增加的離子強(qiáng)度下具有增加的熱穩(wěn)定性。Bag CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。[0083]重組Bag CAl碳酸酐酶已顯示在約8.0至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8.5至約10.8、約8.6至約10.6、約8.4至約10.4、約8.2至約10.2、約8.0至約10、或約7.8至約9.8等)的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言，重組BagCAl當(dāng)在約25°C下并且在約8.0至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5)的pH下溫育至少約3小時、5小時、10小時、24小時或更長時間時保持約90%的碳酸酐酶活性。碳酸酐酶活性在較高PH下下降較明顯。然而，在較低pH(例如，約8至約
9.5、約8.5至約9.5等)下，Bag CAl在進(jìn)行酶促CO2提取的超生理溫度下持續(xù)長的一段時間仍適宜地保持穩(wěn)定。此外，已經(jīng)觀測到重組Bag CAl在碳酸氫鹽溶液中至少約3小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時或更長時間仍保持超過50%的活性。另外，重組Bag CAl在高離子強(qiáng)度條件下(例如，在碳酸氫鹽溶液中)具有處于或高于約50°C (例如，至少約55°C、至少約60°C、至少約70°C等)的解鏈溫度。此外，相比于在較低離子強(qiáng)度條件下(例如，在0.9M碳酸氫鹽濃度下、在0.SM碳酸氫鹽濃度下、在0.6M碳酸氫鹽濃度下、在0.5M碳酸氫鹽濃度下、在0.4M碳酸氫鹽濃度下、在0.3M碳酸氫鹽濃度下、在0.2M碳酸氫鹽濃度下或在0.1M碳酸氫鹽濃度下等)的熱穩(wěn)定性、碳酸酐酶活性和解鏈溫度這些參數(shù)(單獨(dú)或這些參數(shù)的組合)，本公開的Bag CAl多肽在較高離子強(qiáng)度條件下(例如，在IM碳酸氫鹽濃度下)可適宜地具有改善的熱穩(wěn)定性、碳酸酐酶活性和/或較高的解鏈溫度。這些特征使得本文描述的Bag CAl適用于CO2提取。
[0084]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自弧菌屬物種AND4的重組碳酸酐酶(Vsp CAl)的組合物和方法。這些組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的Vsp CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。還觀測到本公開的Vsp CAl多肽在較高離子強(qiáng)度條件下展現(xiàn)出增加的熱穩(wěn)定性，例如它們在較高離子強(qiáng)度條件下可適宜地具有較高的解鏈溫度，這是令人驚訝的。Vsp CAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0085]重組Vsp CAl碳酸酐酶已顯不在約8.0至約11 (例如,約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8.5至約10等)的pH下的熱穩(wěn)定性。在該堿性pH的較低端，例如，在約8至約9.5 (例如，約8.5至約9.5等)的pH下，重組Vsp CAl保持其大部分碳酸酐酶活性持續(xù)較長的一段時間，例如，持續(xù)至少I小時、至少2小時、至少3小時、至少5小時、至少10小時、至少24小時或甚至更長時間。例如，當(dāng)在25°C下在約8.5至約9.5的pH下溫育至少約I小時、3小時、5小時、10小時、或24小時或更長時間時，重組Vsp CAl適宜地保持至少約35% (例如，至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或更高百分比)的碳酸酐酶活性。在堿性pH的較高端，例如，在約10.5或更高的pH下，重組酶更迅速地失去其碳酸酐酶活性。例如，當(dāng)在約10.5的pH下溫育至少I小時、2小時或3小時時，重組Vsp CAl可適宜地保持至少約20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55%或至少約60%的其碳酸酐酶活性。此外，重組Vsp CAl在20°C下在碳酸氫鹽溶液中至少約I小時、至少約2小時或至少約3小時仍保持超過35% (例如，超過35%、超過40%、超過45%、超過50%、超過55%、超過60%、超過65%或甚至超過70% )的活性。另外，重組Vsp CAl在高離子強(qiáng)度條件下(例如，在碳酸氫鹽溶液中)具有處于或高于約65°C (例如，處于或高于約65°C、處于或高于約66°C、處于或高于約67%、或處于或高于約68°C等)的解鏈溫度。在相關(guān)的實(shí)施例中，重組Vsp CAl在較高離子強(qiáng)度條件下可適宜地具有較高或增加的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度下(例如，在0.8M碳酸氫鹽下、在0.6M碳酸氫鹽下、在0.4M碳酸氫鹽下、在0.2M碳酸氫鹽下、或在0.1M碳酸氫鹽下等)的解鏈溫度，重組Vsp CAl在較高離子強(qiáng)度下(例如，在IM碳酸氫鹽下)適宜地具有較高的解鏈溫度。這些特性使得本文描述的Vsp CAl適用于CO2提取。
[0086]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自弧菌屬物種Ex25的重組碳酸酐酶(VspE CAl)的組合物和方法。這些組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的VspE CAl在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。此外，VspE CAl多肽在較高離子強(qiáng)度條件下適宜地具有較高或改善的熱穩(wěn)定性。VspECAl的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0087]重組VspE CAl碳酸酐酶已顯示在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10等)的pH下的熱穩(wěn)定性。具體而言，當(dāng)在約25°C或約50°C下、在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8.5至約9.5、約9.5至約10.5、約8至約10等)的pH下溫育至少約30分鐘、約I小時、約2小時、約5小時、約10小時、約15小時、或約24小時或更長時間時，重組VspE CAl保持至少約55% (例如，至少約55%、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約97%或100%)的該碳酸酐酶活性。此外，重組VspE CAl在約20°C、約25°C或約40°C下在碳酸氫鹽溶液中至少約30分鐘、約I小時、約2小時、或約3小時或更長時間仍保持超過30%的活性。另外，重組VspE CAl在碳酸氫鹽溶液中在高離子強(qiáng)度條件下具有處于或高于約45°C (例如，處于或高于約450C、約46°C、約47°C、約48°C、約49°C、或約50°C或更高)的解鏈溫度。在一些實(shí)施例中，重組VspE CAl在較高離子強(qiáng)度條件下具有增加或較高的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度(例如，0.8M碳酸氫鹽、0.6M碳酸氫鹽、0.4M碳酸氫鹽、0.2M碳酸氫鹽、或0.1M碳酸氫鹽等)下，重組VspE CAl在較高離子強(qiáng)度(例如，IM碳酸氫鹽)下適宜地具有較高的解鏈溫度。這些特征使得本文所述的VspECAl適用于CO2提取。
[0088]在一些實(shí)施例中，描述了涉及來自弧菌屬物種Ex25的重組碳酸酐酶II(VspECA2)的組合物和方法。這些組合物和方法部分是基于所克隆和表達(dá)的VspE CA2在高離子強(qiáng)度條件下和/或在高濃度的碳酸氫鹽存在下是熱穩(wěn)定性的和/或保持碳酸酐酶活性的觀測結(jié)果。此外，VspE CA2在較高離子強(qiáng)度條件下也具有較高的熱穩(wěn)定性。VspE CA2的這些特征使得其適用于從例如燃燒廢氣和煙道氣流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工藝。
[0089]重組VspE CA2碳酸酐酶已顯示在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8至約
10、約8.4至約9.5、約9.5至約10.5等)的pH值下的熱穩(wěn)定性。具體而言，當(dāng)在25°C下在約8至約11 (例如，約8.5至約10.5、約8至約10、約8.4至約9.5、約9.5至約10.5等)的pH下溫育至少30分鐘、至少I小時、至少2小時、至少3小時、至少5小時、至少10小時、至少24小時時，重組VspE CA2保持至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或更高百分比)的碳酸酐酶活性。此外，重組VspE CA2在20°C下在碳酸氫鹽溶液中至少約30分鐘、約I小時、約2小時或約3小時仍保持超過40% (例如，超過40%、超過45%、超過50%、超過55%、超過60%、超過65%、超過70%、超過75%、超過80%或更高百分比)的活性。另外，重組VspE CA2在碳酸氫鹽溶液中在高離子強(qiáng)度條件下具有處于或高于約45°C (例如，處于或高于47°C、處于或約50°C、處于或高于65°C、處于或高于70°C、處于或高于75°C、或更高溫度)的解鏈溫度。重要的是，重組VspE CA2在較高離子強(qiáng)度條件下具有增加或較高的熱穩(wěn)定性。例如，相比于在較低離子強(qiáng)度(例如，0.8M碳酸氫鹽、0.6M碳酸氫鹽、0.4M碳酸氫鹽、0.2M碳酸氫鹽、0.1M碳酸氫鹽等)下，重組VspE CA2在較高離子強(qiáng)度(例如，IM碳酸氫鹽)下可適宜地具有較高的解鏈溫度。這些特性使得本文描述的VspE CA2適用于CO2提取。
[0090]IL 定義
[0091]在詳細(xì)描述本發(fā)明的組合物和方法之前，為清晰起見定義如下術(shù)語。未定義的術(shù)語和縮寫應(yīng)符合它們在本領(lǐng)域中所用的普通含義。
[0092]如本文所用，“碳酸酐酶”或“CA”描述具有EC4.2.1.1活性的多肽，其能夠催化二氧化碳與碳酸氫鹽之間的相互轉(zhuǎn)化[即
【權(quán)利要求】
1.一種包含氨基酸序列的重組多肽，其中所述氨基酸序列具有碳酸酐酶活性，其中所述氨基酸序列在較高離子強(qiáng)度下具有較高的熱穩(wěn)定性和/或解鏈溫度，并且其中所述氨基酸序列與氨基酸序列 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQID'NO:64, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO:136 具有至少 70% 同一性。
2.一種包含氨基酸序列的重組多肽，其中當(dāng)在約8至約10.5的pH下溫育30分鐘或更長時間時所述氨基酸序列具有大于25%的所述碳酸酐酶活性的碳酸酐酶活性，并且其中所述氨基酸序列與氨基酸序列 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:130 或 SEQ ID NO: 136 具有至少 70% 同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:3具有至少70%同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育5個或更多個小時時所述多肽保持大于70%的所述碳酸酐酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少90%的所述碳酸酐酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少90%的所述碳酸酐酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7 中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEOIDNO:28具有至少70%同一性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至9.5的pH下溫育5個或更多個小時時所述多肽保持大于70%的所述碳酸酐酶活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少80%的所述碳酸酐酶活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少90%的所述碳酸酐酶活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少40%的所述碳酸酐酶活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:43具有至少70%同一性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育5個或更多個小時時所述多肽保持大于70%的所述碳酸酐酶活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少90%的所述碳酸酐酶活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少80%的所述碳酸酐酶活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求17-20中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少40%的所述碳酸酐酶活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求17-21中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少20%的所述碳酸酐酶活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求17-22中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
24.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:53具有至少70%同一性。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至9.5的pH下溫育5個或更多個小時時所述多肽保持大于60%的所述碳酸酐酶活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少80%的所述碳酸酐酶活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-26中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少60%的所述碳酸酐酶活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約2小時時所述多肽保持至少40%的所述碳酸酐酶活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約2小時時所述多肽保持至少20%的所述碳酸酐酶活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求24-29中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:64具有至少70%同一性。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育3個或更多個小時、5個或更多個小時、10個或更多個小時、或24個或更多個小時時所述多肽保持大于70%的所述碳酸酐酶活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育至少約10小時或至少約24小時時所述多肽保持至少90%的所述碳酸酐酶活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少60%的所述碳酸酐酶活性。
35.根據(jù)權(quán)利要求31-34中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少40%的所述碳酸酐酶活性。
36.根據(jù)權(quán)利要求31-35中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
37.根據(jù)權(quán)利要求31-36中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
38.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:80具有至少70%同一性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育I個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、15個或更多個、或24個或更多個小時時所述多肽保持大于70%的所述碳酸酐酶活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約10小時時所述多肽保持至少60%的所述碳酸酐酶活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求38-40中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約24小時時所述多肽保持至少35%的所述碳酸酐酶活性。
42.根據(jù)權(quán)利要求38-41中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約I小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求38-42中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約3小時時所述多肽保持至少20%的所述碳酸酐酶活性。
44.根據(jù)權(quán)利要求38-43中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在約20°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
45.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:130具有至少70%同一性?！?br> 46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育30分鐘、I小時、2小時、3小時、5小時、10小時、24小時、或更多個小時時所述多肽保持大于25 %的所述碳酸酐酶活性。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育至少約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時、約5小時、約10小時、約15小時、或約24小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
48.根據(jù)權(quán)利要求45-47中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約10小時、約15小時、或約24小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
49.根據(jù)權(quán)利要求45-48中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、或約3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
50.根據(jù)權(quán)利要求45-49中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約I小時、約2小時、或約3小時時所述多肽保持至少35%的所述碳酸酐酶活性。
51.根據(jù)權(quán)利要求45-.0中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在20°C至50°C的溫度下在高離子強(qiáng)度條件下溫育至少30分鐘、至少I小時、至少2小時、或至少3小時、或更長時間時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
52.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組多肽，其中所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQIDNO:136具有至少70%同一性。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的重組多肽，其中當(dāng)在8.5至10.5的pH下溫育至少30分鐘、至少I小時、至少2小時、至少3小時、或至少5小時所述多肽保持大于25%的所述碳酸酐酶活性。
54.根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的重組多肽，其中當(dāng)在約25°C的溫度下溫育約I小時、約2小時、約3小時、約5小時、約10小時、或約24小時時所述多肽保持至少50%的所述碳酸酐酶活性。
55.根據(jù)權(quán)利要求52-54中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約40°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時、約5小時、約10小時、或約24小時時所述多肽保持至少40%的所述碳酸酐酶活性。
56.根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、或約3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
57.根據(jù)權(quán)利要求52-56中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在約50°C的溫度下溫育約30分鐘、約I小時、約2小時、或約3小時時所述多肽保持至少35%的所述碳酸酐酶活性。
58.根據(jù)權(quán)利要求52-57中任一項所述的重組多肽，其中當(dāng)在高離子強(qiáng)度條件下在20°C至50°C的溫度下溫育I至3小時時所述多肽保持至少25%的所述碳酸酐酶活性。
59.根據(jù)權(quán)利要求9、16、23、30、37、44、51或58所述的重組多肽，其中所述高離子強(qiáng)度條件包括IM碳酸氫鹽。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-59中任一項所述的重組多肽，其中所述多肽在IM至2M碳酸氫鹽存在下具有升高的解鏈溫度。
61.根據(jù)權(quán)利要求2-60中任一項所述的重組多肽，其中所述多肽在較高離子強(qiáng)度下具有較高的熱穩(wěn)定性和/或解鏈溫度。
62.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組多肽，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:136具有至少75%同一性的氨基酸序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組多肽，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:136具有至少80%同一性的氨基酸序列。
64.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組多肽，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:136具有至少90%同一性的氨基酸序列。
65.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的重組多肽，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQID NO:3、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:80、SEQID NO:130或SEQ ID NO:136具有至少95%同一性的氨基酸序列。
66.一種組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的重組多肽以及含二氧化碳的介質(zhì)。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物，其中所述重組多肽被固定化。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述重組多肽被固定在聚合物、膜、基質(zhì)、膠束材料、圓片、固體支撐物或微粒上。
69.一種分離的核酸，編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的重組多肽。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的分離的核酸，其中所述多肽還包含信號肽序列。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的分離的核酸，其中所述信號肽序列選自SEQID NO =10-15,69-73,81-83 以及 131-132。
72.—種表達(dá)載體，包含與調(diào)節(jié)序列有效組合的根據(jù)權(quán)利要求69-71中任一項所述的分離的核酸。
73.—種宿主細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求72所述的表達(dá)載體。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
75.—種組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求73或74所述的宿主細(xì)胞以及培養(yǎng)基。
76.—種產(chǎn)生碳酸酐酶的方法,包括:在合適條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求73或74所述的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述碳酸酐酶。
77.—種組合物，包含依據(jù)根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法在所述培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生的所述碳酸酐酶。
78.一種從含二氧化碳的介質(zhì)提取二氧化碳的方法，包括:使所述含二氧化碳的介質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求1-64中任一項所述的多肽接觸以得到二氧化碳減少的介質(zhì)。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介質(zhì)選自氣體、液體和多相混合物。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介質(zhì)是選自煙道氣、原天然氣、合成氣、氫氣和沼氣的氣體。
81.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介質(zhì)是燃燒或發(fā)酵的副產(chǎn)物。
82.—種調(diào)節(jié)含有0)2和碳酸氫鹽中的一者或二者的介質(zhì)的pH的方法，包括:使所述介質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求1-65中任一項所述的多肽接觸以得到具有改變的pH的介質(zhì)。
【文檔編號】C07K17/02GK103547672SQ201280022432
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】葛晶, 華玲, A·J·保羅斯 申請人:丹尼斯科美國公司