專利名稱：作為ep的制作方法
背景技術(shù)：
青光眼是一種眼睛變性疾病，因眼內(nèi)壓太高而不能正常發(fā)揮眼睛功能。結(jié)果，可能發(fā)生視神經(jīng)乳頭損害并導(dǎo)致不可逆的視覺功能喪失。如果不治療，青光眼將可能最終導(dǎo)致失明?，F(xiàn)在大多數(shù)眼科醫(yī)師認(rèn)為高眼壓癥，即無視神經(jīng)乳頭損害的眼內(nèi)壓增高病癥或特征性青光眼視野缺陷病癥，僅表現(xiàn)在青光眼發(fā)作初期。
以前用于治療青光眼的許多藥物經(jīng)證實(shí)并不令人滿意?，F(xiàn)在治療青光眼的方法包括使用治療藥物如匹魯卡品、碳酸酐酶抑制劑、β-阻斷劑、前列腺素等。然而，這些治療藥物常常引起不需要的局部效應(yīng)。顯然，目前有幾種用于治療青光眼和眼內(nèi)壓增高的治療藥物，但是這些治療藥物的功效方面和副作用方面并不理想。因此，仍需要有副作用小或無副作用的新且有效的治療。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及前列腺素E2受體EP4亞型的激動劑和它們的用途或制劑，它們用于治療青光眼和涉及患者眼睛眼內(nèi)壓增高的其它病癥。具體來講，本發(fā)明涉及1，6-二取代哌啶-2-酮、3，4-二取代1，3-噁嗪烷-2-酮、3，4-二取代1，3-噻嗪烷-2-酮和4，5-二取代嗎啉-3-酮衍生物系列化合物，以及它們治療眼病和提供對哺乳動物物種特別是人眼睛的神經(jīng)保護(hù)作用的用途。更具體地講，本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式I的新EP4激動劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物
式I其中U表示H、C1-3烷基或當(dāng)W為＝O時不存在；W表示0H或＝O，條件是當(dāng)W為＝O時U不存在；z表示(CH2)n或CH＝CH；R1表示(CH2)p羥基、((CH2)pCO2R10或(CH2)n雜環(huán)基，所述雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代且任選包含酸性羥基；R2獨(dú)立表示C1-10烷基、(CH2)mC6-10芳基、(CH2)mC5-10雜環(huán)基、(CH2)mC3-10雜環(huán)烷基、(CH2)mC3-8環(huán)烷基，所述烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代；R3和R4獨(dú)立表示氫、鹵素或C1-6烷基；R6表示氫或C1-4烷基；R10表示氫、C1-10烷基、C3-10環(huán)烷基、(CH2)pC6-10芳基、(CH2)pC5-10雜環(huán)基；Ra表示C1-6烷氧基、C1-6烷基、CF3、硝基、氨基、氰基、C1-6烷基氨基、鹵素，或Ra還表示芳基和雜環(huán)基、SCl-6烷基、SC6-10芳基、SC5-10雜環(huán)基、OC6-10芳基、OC5-10雜環(huán)基、CO2R6、CH2OC1-6烷基、CH2SCl-6烷基、CH2O芳基、CH2S芳基； 表示雙鍵或單鍵；p表示0-3；n表示0-4；且m表示0-8。
通過整體驗(yàn)證本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的該方面和其它方面。
發(fā)明詳述本文詳細(xì)描述的本發(fā)明使用下文所定義的術(shù)語，除非另外說明。
本文使用的術(shù)語“治療有效量”指本發(fā)明的式IEP4亞型受體激動劑或其他活性物質(zhì)根據(jù)所需治療方案給予的量，這個量給予后可引起所需的治療效果或反應(yīng)，或提供所需益處。涉及治療反常骨吸收的優(yōu)選治療有效量為刺激骨骼生成的量。同樣地，涉及治療高眼壓癥或青光眼的優(yōu)選治療有效量為有效降低眼內(nèi)壓和/或治療高眼壓癥和/或青光眼的量。
本文中使用的“藥學(xué)上可接收的”一般指從毒性角度或安全角度考慮適用于給予哺乳動物包括人。
術(shù)語“前藥”指藥物前體化合物，在給藥和吸收后，其在體內(nèi)通過一些代謝途徑釋放要求保護(hù)的藥物。本發(fā)明化合物前藥的非限定性實(shí)例可為吡咯烷酮基團(tuán)的酸，其中酸官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)使其在給予患者后容易水解。示例性前藥包括非麻醉劑、鎮(zhèn)痛藥/非甾體、抗炎藥物的乙酸衍生物，具有典型連接至環(huán)系統(tǒng)的游離CH2COOH基團(tuán)(其可以任選為藥學(xué)上可接收的鹽形式，如-CH2COO-Na+)，優(yōu)選連接至芳環(huán)系統(tǒng)或雜芳環(huán)系統(tǒng)。
術(shù)語“烷基”指包含1-10個碳原子由單價烷烴(碳?xì)浠衔?衍生的基團(tuán)，除非另外定義。它可為直鏈、支鏈或環(huán)狀。優(yōu)選的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。當(dāng)描述用烷基取代烷基時，其與“支鏈烷基”互換使用。
環(huán)烷基為一種含有3-15個碳原子且碳原子間無交替雙鍵或共振(resonating)雙鍵的烷基。它可包含1-4個稠合環(huán)。環(huán)烷基的實(shí)例為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。
烷氧基指C1-C6烷基-O-，且烷基如本文所述任選取代。烷氧基的實(shí)例為甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基及其異構(gòu)基團(tuán)。
鹵素(鹵基)指氯、氟、碘或溴。
芳基指芳環(huán)如苯基、取代苯基等，以及稠環(huán)如萘基、菲基等。因此，芳基含至少一個有至少6個原子的環(huán)，可存在最多可達(dá)5個這樣的環(huán)，其中含最多可達(dá)22個原子，且在鄰近碳原子間或合適的雜原子間有交替(共振)雙鍵。優(yōu)選的芳基為苯基、萘基和菲基。同樣，芳基可按定義取代。優(yōu)選的取代芳基包括苯基和萘基。
術(shù)語“雜環(huán)烷基”指有3-10個碳原子的環(huán)烷基(非芳族)且環(huán)中的一個碳原子被選自O(shè)、S或N的雜原子替換，而且其中最多可達(dá)三個其它碳原子可被雜原子替換。
術(shù)語“環(huán)烷基”指有3-10個碳原子的環(huán)狀烷基(非芳族)。
術(shù)語“雜原子”指獨(dú)立選擇的O、S或N。
術(shù)語“雜芳基”指包含至少一個雜原子O、S或N、有5或6個環(huán)原子的單環(huán)芳烴基，或有8-10個原子的雙環(huán)芳基，其中碳原子或氮原子為連接點(diǎn)，而且其中一個或兩個其他碳原子任選被選自O(shè)或S的雜原子替換，其中1-3個其他碳原子任選被氮雜原子替換，所述雜芳基任選按本文所述取代。該類型基團(tuán)的實(shí)例為吡咯、吡啶、噁唑、噻唑、四唑和噁嗪。對于本發(fā)明目的，四唑包括所有的互變異構(gòu)形式。其他氮原子可與第一個氮和氧或硫一起存在，構(gòu)成例如噻二唑。
本文使用的術(shù)語雜環(huán)基或雜環(huán)指飽和或不飽和的5-7元穩(wěn)定單環(huán)雜環(huán)或8-11元穩(wěn)定雙環(huán)雜環(huán)，且其由碳原子和1-4個選自N、O和S的雜原子組成，并包括其中任何上述定義的雜環(huán)與苯環(huán)稠和的任何雙環(huán)基團(tuán)。雜環(huán)可在任何雜原子或碳原子處連接，導(dǎo)致穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成。稠合雜環(huán)環(huán)系統(tǒng)可包括碳環(huán)且只需包括一個雜環(huán)。術(shù)語雜環(huán)或雜環(huán)的包括雜芳基部分。這些雜環(huán)部分的實(shí)例包括但不限于氮雜基、苯并咪唑基、苯并異噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氫吡喃基、鄰二氮萘基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并噻喃基、二氫苯并噻喃基砜、1，3-二氧戊環(huán)基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、二氫吲哚基、吲哚基、異苯并二氫吡喃基、異二氫吲哚基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噻唑基、異噻唑烷基、嗎啉基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代氮雜基、噁唑基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、四唑基、硫代嗎啉基、硫代嗎啉基亞砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基、噻吩基和三唑基。
對于本發(fā)明目的，含酸性羥基的雜環(huán)基為有酸性羥基原子的那些雜環(huán)基且pKa范圍在3-7。含酸性羥基雜環(huán)基的非限定性實(shí)例為 或 G為-C(Rc)3、 -N(Re)2、O或S，且各Rc獨(dú)立為H、氟、氰基或C1-4烷基；各Rd獨(dú)立為H、C1-4烷基或藥學(xué)上可接受的陽離子；各Re獨(dú)立為H、-C(＝O)-Rf或-SO2Re，其中Rf為C1-4直鏈烷基或苯基本文使用的術(shù)語“激動劑”指與天然激動劑PGE2相比，與EP4受體相互作用可產(chǎn)生最大作用、超大作用、次最大作用的式IEP4亞型化合物。見Goodman and Gilman，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9版，1996，第2章。
當(dāng)R1為(CH2)pCO2R10或(CH2)n雜環(huán)基、所述雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一個實(shí)施方案。
當(dāng)R1為(CH2)mC5-10雜環(huán)基、所述雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案。當(dāng)R2為(CH2)mC6-10芳基、所述芳基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案。
當(dāng)R1為(CH2)pCO2R10或(CH2)p-四唑基、所述四唑基未取代或被Ra基團(tuán)取代且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一個亞實(shí)施方案。當(dāng)R2為未取代苯基或被1-3個Ra基團(tuán)取代的苯基且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的還另一個實(shí)施方案。
當(dāng)R1為(CH2)p-四唑基，R2為苯基，所述四唑基未取代或被Ra基團(tuán)取代，苯基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代，且所有其他變量如最初所述時，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明再另一個實(shí)施方案。
當(dāng)U為H且W為OH時，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的還另一個實(shí)施方案。
當(dāng)U為C1-3烷基且W為OH時，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的還另一個實(shí)施方案。
本發(fā)明化合物為以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物1)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸；2)7-{(2R)-2-[(IE，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯；3)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸異丙酯；4)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸；5)7-{[(2R)-2-(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸；6)7-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯；7)6-[(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮；8)(6S)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌嗪-2-酮；9)(6R)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌啶-2-酮；10)7-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羥基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及一種組合物，該組合物含有式IEP4激動劑和任選的藥學(xué)上可接受載體。
本發(fā)明還另一個實(shí)施方案涉及一種降低增高的眼內(nèi)壓或治療青光眼的方法，該方法通過給予含有式IEP4激動劑和任選的藥學(xué)上可接受載體的組合物來實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選局部給藥或前眼房(intracamaral)給藥。本發(fā)明也包括式I化合物在制備用于治療增高的眼內(nèi)壓或青光眼或其組合的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及制備含有式I化合物的藥用組合物的方法。
本發(fā)明還涉及制備含有式I化合物和藥學(xué)上可接受載體的藥用組合物的方法。
所要求保護(hù)的化合物強(qiáng)烈結(jié)合并作用于PGE2受體，特別是作用于EP4亞型受體，因此用于預(yù)防和/或治療青光眼和高眼壓癥。
干眼癥是一種常見的折磨成百萬人的眼表面疾病。盡管，顯然干眼癥可由許多不相關(guān)致病因素引起，但是常見的最終結(jié)果是淚液膜的損壞，這導(dǎo)致眼睛暴露的外表面脫水。(Lemp，Report of the Nation EyeInstitute/Industry Workshop on Clinical Trials in Dry Eyes(國家眼學(xué)會/工業(yè)學(xué)部關(guān)于干眼癥臨床試驗(yàn)的報(bào)告)，The CLAO Journel，21(4)221-231(1995))。在人結(jié)膜(conjuctival)上皮細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)功能性EP4受體(見專利US6,344,477，該專利通過引用而整體結(jié)合至本文中)，而且認(rèn)識到人角膜上皮細(xì)胞(Progess in Retinal and Eye Research，1681-98(1997))和結(jié)膜細(xì)胞(Dartt等Localization of nerves adjacent to goblet cells in ratconjucntiva(大鼠結(jié)膜中鄰近杯狀細(xì)胞神經(jīng)的定位).Current EyeResearch，14993-1000(1995))能夠分泌粘蛋白。因此，式I化合物可用于治療干眼癥。
黃斑水腫為眼睛后極非常重要的中心視力區(qū)內(nèi)的視網(wǎng)膜腫脹。認(rèn)為降低IOP的EP4激動劑可用于治療黃斑疾病如黃斑水腫或黃斑變性。因此，本發(fā)明的另一方面為一種治療黃斑水腫或黃斑變性的方法。
青光眼的特征在于視神經(jīng)的進(jìn)行性萎縮，并通常與增高的眼內(nèi)壓(IOP)相關(guān)。然而，使用賦予神經(jīng)保護(hù)作用的藥物而不必影響IOP也可治療青光眼。見Arch.Ophthalmol.Vol.112，Jan 1994，pp.37-44；Investigative Ophthamol.& Visual Science，32，5，1991年4月，pp.1593-99。認(rèn)為降低IOP的EP4激動劑可用于提供神經(jīng)保護(hù)作用。也認(rèn)為這些激動劑通過降低IOP可有效增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭的血液速度及增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的氧，這兩種功效結(jié)合起來時有利于視神經(jīng)健康。因此，本發(fā)明還涉及一種通過使用式IEP4激動劑來增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭的血液速度、或增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的氧張力、或提供神經(jīng)保護(hù)作用或其組合的方法。
本發(fā)明制備的化合物容易地與已知并合適的藥學(xué)上可接受賦形劑組合，以便制備可給予哺乳動物(包括人)的組合物，從而達(dá)到有效降低IOP。因此，本發(fā)明也涉及治療高眼壓癥、青光眼、黃斑水腫、黃斑變性的組合物和方法，通過單獨(dú)給予有需要的患者一種式I化合物或?qū)⑹絀化合物與以下活性成分中的一種或多種聯(lián)合給予，來增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭的血液速度、增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的氧張力、提供神經(jīng)保護(hù)作用或其組合β-腎上腺素能阻斷劑如噻嗎洛爾、倍他洛爾、左旋倍他洛爾、卡替洛爾、左布諾洛爾；擬副交感神經(jīng)藥如匹魯卡品；擬交感神經(jīng)藥如腎上腺素、阿可樂定、溴莫尼定、可樂定、對氨基可樂定；碳酸酐酶抑制劑如多佐胺、乙酰唑胺、甲醋唑胺或布林唑胺；COSOPT；Maxi-K通道阻斷劑如Penitrem A、paspalicine、卡律蝎毒素(charybdotoxin)、iberiotoxin、Paxicillan、Aflitram、Verroculogen以及在WO03/105868(USSN60/389,205)、WO03/105724(60/389,222)、WO03/105847(60/458,981)、2002年11月8日提交的60/424790(代理人卷號21260PV)、2002年11月8日提交的60/424808(代理人卷號21281PV)、2001年1月17日提交的09/765716、2001年1月17日提交的09/764738和PCT公布WO02/077168和WO02/02060863中所公開的Maxi-K通道阻斷劑，所有這些專利申請通過引用而整體結(jié)合到本文中，特別是Maxi-K通道阻斷劑如1-(1-異丁基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2，2-二甲基丙基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(環(huán)己基甲基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(1-己基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2-乙基己基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(3-異丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)丁-2-酮；1-(3-異丁酰基-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3-環(huán)戊基羰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-甲酸；和1-[3-(3-羥基丙?；?-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基]-3，3-二甲基丁-2-酮；前列腺素如拉坦前列素、曲伏前列素、烏諾前列酮、異丙基烏諾前列酮(rescula)、S1033(美國專利第5,889,052、5,296,504、5,422,368和5,151,444號中提及的化合物)；降血壓性脂質(zhì)如比馬前列素(lumigan)和美國專利第5,352,708號中提及的化合物；美國專利第4,690,931號中公開的神經(jīng)保護(hù)劑，特別是WO94/13275中提及的依利羅地和R-依利羅地，包括美金剛；和/或PCT/US00/31247中提及的5-HT2受體激動劑，特別是延胡索酸1-(2-氨基丙基)-3-甲基-1H-吲唑(imdazol)-6-醇和2-(3-氯-6-甲氧基-吲唑-1-基)-1-甲基-乙胺。
本發(fā)明也包括式I化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療高眼壓癥、青光眼、黃斑水腫、黃斑變性，增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭的血液速度，增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的氧張力，提供神經(jīng)保護(hù)作用或其組合。
用于本發(fā)明的EP4激動劑可以治療有效量經(jīng)靜脈內(nèi)(intravaneously)、皮下、局部、經(jīng)皮、腸胃外或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法來給予。眼用藥物組合物優(yōu)選適用于以溶液劑、混懸劑、軟膏劑、乳膏劑或固體插入物形式對眼睛局部給藥。該化合物的眼用制劑可含0.001-5％、特別是0.001-0.1％的藥物。例如，較高劑量最高可達(dá)約10％，或者可采用較低劑量，條件是該低劑量可有效降低眼內(nèi)壓、治療青光眼、增加血液流速或氧張力。對于單劑量，可施用于人眼的化合物為0.001-5.0mg，優(yōu)選0.005-2.0mg，特別為0.005-1.0mg。
含有化合物的藥物制劑可方便地與無毒的藥用有機(jī)載體混合，或與無毒的藥用無機(jī)載體混合。典型地，藥學(xué)上可接受的載體為例如水、水和水互溶性溶劑如低級烷醇或芳烷醇的混合物、植物油、花生油、聚亞烷基二醇、基于膠狀物的石油、乙基纖維素、油酸乙酯、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、肉豆蔻酸異丙酯和其他常規(guī)采用的可接受載體。藥物制劑也可含無毒的輔助物質(zhì)如乳化劑、防腐劑、濕潤劑、基礎(chǔ)劑等，例如聚乙二醇200、300、400和600，聚氧乙烯二醇1,000、1,500、4,000、6,000和10,000；抗菌成分如季銨化合物、已知有低溫(cold)殺菌特性且使用無害的苯汞鹽、硫汞撒、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、芐醇、苯乙醇；緩沖成分如硼酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖酸鹽緩沖劑；以及其他常規(guī)成分如單月桂酸脫水山梨醇酯、三乙醇胺、油酸鹽(酯)、聚氧化乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、二辛基磺基琥珀酸鈉、單硫代甘油、硫代山梨糖醇、乙二胺四乙酸等。另外，對于本發(fā)明目的，可作為載體介質(zhì)使用的合適眼用媒介物包括常規(guī)磷酸鹽緩沖劑溶媒系統(tǒng)、等滲的硼酸溶媒、等滲的氯化鈉溶媒、等滲的硼酸鈉溶媒等。藥物制劑也可為微粒制劑形式。藥物制劑也可為固體插入劑形式。例如可采用固體水溶性聚合物作為藥物的載體。用于形成插入劑的聚合物可以為任何無毒的水溶性聚合物，例如纖維素衍生物如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、(羥基低級烷基纖維素)、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素；丙烯酸鹽如聚丙烯酸鹽、乙基丙烯酸鹽、聚乙酰胺(polyactylamide)；天然產(chǎn)物如明膠、藻酸鹽、果膠、黃芪膠、梧桐膠、角叉采膠、瓊脂、阿拉伯膠；淀粉衍生物如淀粉醋酸酯、羥基甲基淀粉醚、羥基丙基淀粉；及其他合成衍生物如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚環(huán)氧乙烷、中性卡波泊爾和黃原膠、吉蘭糖膠和所述聚合物的混合物。
給予本發(fā)明制劑的合適對象包括靈長類、人和其他動物，特別是人和馴養(yǎng)動物如貓、兔和狗。
藥物制劑可含無毒的輔助物質(zhì)如使用無害的抗菌成分，例如硫汞撒、氯化芐烷銨、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、benzyldodecinium溴化物、芐醇或苯乙醇；緩沖成分如氯化鈉、硼酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉或葡萄糖酸鹽緩沖液；及其他常規(guī)成分如單月桂酸脫水山梨醇酯、三乙醇胺、聚氧化乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、乙二胺四乙酸等。
可按需要盡可能經(jīng)常給予眼用溶液劑或混懸劑以保持眼睛的IOP為可接受水平。預(yù)計(jì)對哺乳動物眼睛給藥每天可1次最多可達(dá)3次。
為眼睛局部給藥，本發(fā)明的新制劑可采用溶液劑、凝膠劑、乳膏劑、混懸劑或固體插入劑的形式，配制后使在聯(lián)合治療的情況中，單位劑量包含治療有效量的活性成分或其一些組合。
關(guān)于治療眼病，式I激動劑的EC50值通常為約0.001nM至約100μM，盡管活性超過這個范圍的激動劑也有用，但需依賴于劑量和給藥途徑。在本發(fā)明的亞類中，激動劑的EC50值為約0.01μM至約10μM。在本發(fā)明的再一個亞類中，激動劑的EC50值為約0.1μM至約10μM。EC50是一種測試激動劑活性的普通方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，EC50定義為產(chǎn)生一半即50％最大效應(yīng)所需激動劑的濃度或劑量?？蓞⒁奊oodman and Gilman，The Pharmacologic Basis of Therapeuttics，第9版，1996，第2章，E.M Ross，Pharmacodynamics，Mechanisms ofDrug Action and the Relationship Between Drug Concentration and Effect和1999年10月12日提交的PCT US99/23757，這些文獻(xiàn)通過引用而整體結(jié)合到本文中。
本文實(shí)施例舉例說明但并不限定所要求保護(hù)的發(fā)明。所要求保護(hù)的每種化合物均為EP4激動劑，用于治療許多生理性眼病和骨病。
本發(fā)明化合物可按美國專利第6,043,275號、EP0855389、WO03/047417(USSN60/337228)、WO03/047513(USSN60/338,117)、USSN60/406,530(Merck卷號No.MC060)和WO01/46140進(jìn)行一些修改，所有這些文獻(xiàn)通過引用而整體結(jié)合到本文中。以下通過舉例說明給出的非限定性流程和實(shí)施例用于證明本發(fā)明。
制備實(shí)施例1 于60℃，向(+/-)-2-哌啶酸(395g，3.06摩爾)的MeOH(1.8L)漿液中加入L-酒石酸(459g，3.06摩爾)。將漿液升溫至回流并老化1h(小時)。將漿液冷卻至23℃，過濾，用MeOH(200mL)洗滌需要的(R)-2-哌啶酸/L-酒石酸濾餅。將該濾餅風(fēng)干，分離出白色固體。經(jīng)測定2-哌啶酸酒石酸鹽的光學(xué)純度典型為85-89％ee。
將鹽(383g)的H2O/丙酮(2∶1)(380mL/190mL)漿液升溫至回流(60-65℃)直至所有固體溶解。2h內(nèi)，回流下加入丙酮(1330mL)。將漿液在1h內(nèi)冷卻至15-20℃，然后過濾，用丙酮/H2O(4∶1)(380mL)洗滌，然后于真空下風(fēng)干。分離得到313g 2-哌啶酸酒石酸鹽(＞99％ee)。
于0.5h內(nèi)，向(R)-2-哌啶酸酒石酸鹽(312g)的MeOH(3.0L)漿液中加入28％NH4OH(83mL，1.1eq)。將該白色漿液于環(huán)境溫度下老化0.5h，然后過濾該酒石酸銨沉淀。濾餅用MeOH(300mL)沖洗。將濾液和沖洗液合并并濃縮至白色固體(1)。
制備實(shí)施例2 向2-哌啶酸(109.7g)和BOC2O(222.4g)的四氫呋喃(THF)/H2O(1∶1)(550/550mL)漿液中加入50％NaOH(45mL)。將該漿液升溫至回流并于回流下老化5h。將該溶液冷卻至23℃，然后用庚烷(550mL)洗滌除去未反應(yīng)的BOC2O。然后用5N HCl(170mL)酸化水層至pH為4-5。所得漿液用550mL叔丁基甲基醚(MTBE)萃取。有機(jī)層用Na2SO4干燥，然后濃縮至白色固體(2)。
制備實(shí)施例3 向N-BOC-2-哌啶酸(166.5g，726毫摩爾)的500mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入MeI(123.7g，871毫摩爾)和K2CO3(100.4g，726摩爾)。在環(huán)境溫度下4小時老化期間，于0.5h后反應(yīng)混合物緩慢放熱至40℃。加入MTBE(830mL)，然后用H2O(2×830mL)和20％鹽水(300mL)洗滌。將有機(jī)層用Na2SO4干燥并濃縮至油狀物(3)。
制備實(shí)施例4 向丁氧羰基(Boc)-甲酯(152.6g，627mmol)的MeCN(305mL)溶液中加入RuCl3(2.6g，12.5毫摩爾)。在2h內(nèi)加入NaBrO3(142.0g，941毫摩爾)的H2O(760mL)溶液。于環(huán)境溫度下老化該溶液12h。加入EtOAc(760mL)并除去水層。將黑色有機(jī)層用10％Na2SO3(305mL)洗滌至有機(jī)層變澄清而水層變灰色渾濁。有機(jī)層用飽和鹽水(150mL)洗滌，然后用Na2SO4干燥，得到油狀物(4)。
制備實(shí)施例5 于15min內(nèi)，向BOC-內(nèi)酰胺(135.4g，526mmol)的135mL異丙醇(IPA)溶液中加入5N HCl的263mL/1316mmol異丙醇(IPA)溶液。氣體劇烈放出持續(xù)15min，然后于環(huán)境溫度下老化該溶液2.5h。加入EtOAc(800mL)并用15％Na2CO3(350mL)洗滌。用EtOAc(400mL)萃取水層。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥并濃縮至油狀物(5)。測定對映體純度＞99％ee。
制備實(shí)施例6 于30分鐘內(nèi)，向內(nèi)酰胺酯(8.10g，51.7mmol)的無水乙醇(500mL)溶液中以0.5g增量加入硼氫化鈉(2.5g，1.2eq)。于室溫?cái)嚢柙撊芤?.5小時。然后用冰醋酸(2.8當(dāng)量)處理該混合物，經(jīng)硅藻土塞過濾除去沉淀物。在真空中濃縮濾液并將所得油在真空下放置固化。將該粗產(chǎn)物溶于CH2Cl2(50mL)中，用KHCO3(1.5當(dāng)量)處理，老化1h，經(jīng)硅藻土塞過濾，將所得濾液在真空中濃縮得到題述化合物6，該化合物可直接用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。
制備實(shí)施例7 于0℃、氮?dú)夥障?，向?nèi)酰胺醇(10g，77.5mmol，1.0當(dāng)量)的無水CH2Cl2(50mL)溶液中加入咪唑(6.9g，100.8mmol，1.3當(dāng)量，(調(diào)節(jié)咪唑的量以中和所有來自前面步驟的AcOH)和14g/93.0mmol/1.2當(dāng)量叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)。將所得混合物升溫至室溫(RT)并老化4小時。一旦判定反應(yīng)完成，加入CH2Cl2(100mL)，然后加入1N HCl溶液(30mL)。分離有機(jī)層，將水層用CH2Cl2(2×50mL)反萃取。合并有機(jī)層，用20％NaHCO3溶液(40mL)、鹽水洗滌，用MgSO4干燥，過濾并真空濃縮得到需要的白色固體化合物。含硅副產(chǎn)物可于-78℃用冷庚烷(3mL/g)洗滌該固體除去，得到題述化合物7。
制備實(shí)施例8 向15℃內(nèi)酰胺7(2.0g，8.22mmol)的THF(KF＜200ppm)溶液中加入1.90g/9.04毫摩爾二[三甲基甲硅烷基]氨基化鉀(KHMDS)固體的20mL四氫呋喃(THF)溶液中，并于室溫(rt)老化10min。將新制備的甲磺酸酯(0.93g，8.22mmol，KF＜800ppm)以純油加入該溶液中，將反應(yīng)物加熱至50℃并老化2.5-3.5h。將反應(yīng)物冷卻至室溫并用MTBE(20mL)和水(20mL)稀釋。除去水層，有機(jī)層用飽和鹽水(10mL)洗滌。用Na2SO4干燥后除去溶劑，得到黃色的粗油8。
制備實(shí)施例9 于0℃、氮?dú)夥障?，?5min內(nèi)，向叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)-保護(hù)的內(nèi)酰胺(10g，24.2mmol，1當(dāng)量)的無水MTBE(40mL)溶液中加入70％HF·吡啶溶液(4.84g，169mmol，7當(dāng)量)。將所得混合物升溫至室溫并老化12小時，通過HPLC和1HNMR分析判定反應(yīng)完成。然后用MTBE(100mL)稀釋該混合物，并用冷H2O(30mL)洗滌。用飽和Na2CO3(25mL)、鹽水處理有機(jī)層，用MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。所得粗油(9)直接用于下一步驟。如果需要，該醇可以經(jīng)硅膠快速柱層析(40∶1 CH2Cl2∶MeOH)純化。
制備實(shí)施例10 在15分鐘內(nèi)，向醇9(9.46g，31.6mmol)、DMSO(237.3mmol，16.9mL，7.5當(dāng)量)和Hunig堿(16.5mL，94.9mmol，3當(dāng)量)的二氯甲烷(95mL)冷溶液(0℃)中加入固體SO3·吡啶(15g，94.9mmol，3當(dāng)量)。將所得溶液在0℃老化1.5h，同時觀測起始原料的完全消耗。然后將該反應(yīng)混合物用EtOAc(150mL)稀釋并用4N冷鹽酸(35mL)洗滌。將有機(jī)層分離并依次用飽和NaHCO3溶液和鹽水處理。將該溶液用MgSO4干燥，過濾并真空濃縮，得到相應(yīng)的醛(7.8g，83％測定收率)，該醛可直接用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。
制備實(shí)施例11制備膦酸鈉14步驟1 于15℃、氮?dú)夥障?，向苯甲?；姿峒柞?PhCOCO2Me，25g，0.15mol，1當(dāng)量)的純?nèi)芤褐幸跃S持內(nèi)部溫度低于45℃的速度加入純?nèi)野被?DAST，34.4g，0.21mol，1.4當(dāng)量)。加完后，將所得褐色溶液冷卻至室溫并再老化3小時，此時通過高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)檢測起始原料全部反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物慢慢傾入冰/H2O(注意發(fā)熱！)混合物中，該產(chǎn)物用MTBE(3×)萃取。然后將合并的有機(jī)層用20％的冷Na2CO3水溶液緩慢中和至pH為7(注意氣體放出)，用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。將該粗產(chǎn)物經(jīng)真空蒸餾(bp＝103-105℃，24-25托)純化得到需要的產(chǎn)物(13)，為淺黃色油狀物。
步驟2 在-78℃、氮?dú)夥障?，?5min內(nèi)向甲基膦酸二甲酯(28g，0.23mol，1.05當(dāng)量)的無水THF(400mL，KF＝30ppm)溶液中緩緩加入2M二(三甲基甲硅烷基)氨基化鈉的THF溶液(115mL，0.23mol，1.05當(dāng)量)。將所得溶液老化30min，然后于15min內(nèi)用純二氟甲酯(PhCF2CO2Me，40g，0.22mol，1.0當(dāng)量)處理。將反應(yīng)混合物于-78℃老化1h，緩慢升溫至室溫并濃縮至其原體積的約四分之一，于0.5h內(nèi)加入MTBE(400mL)。將所得懸浮液于室溫進(jìn)一步老化0.5h并過濾。濕濾餅用MTBE(100mL)洗滌并在氮?dú)饬飨抡婵崭稍?。分離得到白色固體產(chǎn)物(14)。
制備實(shí)施例12制備化合物16步驟1 向水(250mL)、IPA(1250mL)和濃硫酸(600mL，11.1mol)的10℃溶液中一次性加入固體過硫酸鉀(600g，2.22mol)。將環(huán)庚酮(131.5mL)用IPA稀釋至總體積250mL，并將該溶液于15min內(nèi)經(jīng)加料漏斗加入過硫酸鹽漿液中，整個加入過程保持溫度＜15℃。將反應(yīng)物于15℃老化16-20h。一旦所有環(huán)庚酮反應(yīng)完，將反應(yīng)物過濾以除去鹽，保持濾液低溫。將濾液用MTBE(1250mL)、飽和鹽水(1L)和水(500mL)稀釋，并保持溫度＜30℃。轉(zhuǎn)移至分液漏斗后，使各相澄清1h并除去水層。將有機(jī)層用飽和Na2CO3(2×1L)洗滌，或洗滌直至除去水層保持堿性。將該溶液用己烷(1.25L)稀釋并經(jīng)Na2SO4干燥1h。于真空下除去溶劑，將油真空蒸餾得到純酯(16)。(bp125℃@4mm Hg)步驟2 向酯(10g，0.05mol)和三乙胺(11.1mL，0.08mol)的-10℃無水THF(100mL)溶液中加入甲磺酰氯(MsCl-4.75mL，0.06mol)(按1∶1用THF稀釋)，整個加入過程保持溫度＜10℃。將反應(yīng)物于0-5℃老化30min。完成后，將反應(yīng)物用己烷(100mL)稀釋并用水(50mL)猝滅。除去水層并將有機(jī)層經(jīng)Na2SO4干燥30min。在真空下除去溶劑得到黃色油狀物(16)。甲磺酸應(yīng)在內(nèi)酰胺烷基化前新鮮制備以將雜質(zhì)降到最少。
實(shí)施例17-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯 于0℃、氮?dú)夥障?，向膦酸鈉14(13.7g，45.7mmol，1.4當(dāng)量)的THF(130mL)溶液中加入znCl2(3.33g，24.5mmol，0.75當(dāng)量)。將所得混合物于室溫?cái)嚢?5min，然后用醛10(9.7g，32.66mmol，1當(dāng)量)的THF(10mL)溶液處理。將所得懸浮液加熱至50℃保持50h，此時觀測到94-97％轉(zhuǎn)化。然后將混合物濃縮至體積約為其原體積的三分之一，用EtOAc(130mL)稀釋，用H2O(30mL)和鹽水洗滌。將有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮得到黃色油狀物(11)，該油狀物可經(jīng)快速硅膠層析(19∶1→9∶1甲苯丙酮)純化。
實(shí)施例27-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸酯(12) 在室溫、氮?dú)夥障?，向烯?450mg，1mmol，1.0當(dāng)量)的0.5M/～4.5mL/g無水PhCH3或二氯甲烷(DCM)溶液中加入Et3N(0.14mL，1mmol，1.0當(dāng)量)和HCO2H(0.05mL，1.2mmol，1.2當(dāng)量)。將所得溶液攪拌10mm，同時用固體(R，R)-(-)-Ru-TsDPEN-傘花烴絡(luò)合物1(19mg，0.03mmol，0.03當(dāng)量)處理。然后將反應(yīng)混合物于室溫老化2h，此時觀測起始原料全部消耗。加入叔丁基甲基醚-MTBE(5mL)，然后加入1NHCl(2mL)。將有機(jī)層分離，用飽和Na2CO3、鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮得到粘油狀最終化合物。(40-60∶1非對映體比例，83-85％測定收率)。
在0.04摩爾當(dāng)量的1M KOtBu的THF(四氫呋喃)溶液存在下，通過在DCM(二氯甲烷)中混合0.02摩爾當(dāng)量[RuCl2(對-傘花烴)2]和0.04摩爾當(dāng)量(R，R)-N-甲苯磺?；?1，2-二苯乙烯-1，2-二胺也可在原位產(chǎn)生催化劑。于室溫老化10min后，依次加入Et3N、HCO2H和烯酮的DCM溶液。
于80℃，通過將1摩爾當(dāng)量[RuCl2(對-傘花烴)2]、2摩爾當(dāng)量(R，R)-N-甲苯磺?；?1，2-二苯乙烯-1，2-二胺和4.2摩爾當(dāng)量Et3N在iPrOH中混合1h(小時)，可制備催化劑。除去溶劑后，固體用冷水洗滌并從MeOH重結(jié)晶得到橙色固體狀催化劑。(65-75％收率)。
實(shí)施例37-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸流程1 步驟17-[(2R)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-6-氧代哌啶-1-基]庚酸異丙酯 向7(1.0g，4.1mmol，根據(jù)文獻(xiàn)方法Synthesis 1998，1141-1144經(jīng)7步順式合成)的12mL DMF(二甲基甲酰胺)溶液中加入60％氫化鈉(172mg，4.3mmol)，將所得溶液于50℃攪拌30min，然后加入異丙基-7-碘庚酸酯17(1.9g，1.6mL，8.2mmol)和四丁基碘化銨(50mg)。于50℃攪拌該溶液過夜后，冷卻至室溫，慢慢傾入飽和氯化銨水溶液中并用乙醚萃取。將有機(jī)相合并，依次用H2O、鹽水洗滌并經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮。經(jīng)快速層析用75-100％乙酸乙酯/己烷純化該化合物，得到無色油狀物9。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ4.95(m，1H)，3.75(m，3H)，3.50(m，1H)，2.97(m，1H)，2.25(2t，4H)，2.00(m，1H)，1.93(m，1H)，1.82(m，1H)，1.70-1.56(m，4H)，1.52(m，1H)，1.40-1.28(m，4H)，1.22(2s，6H)，0.93(s，9H)，0.11(s，6H).
步驟27-[(2R)-2-(羥甲基)-6-氧代哌啶-1-基]庚酸異丙酯 于室溫下，向8(0.80g，2.3mmol)的10mL溶液中加入TBAF-四丁基氟化銨(0.25mL的1M THF溶液)并攪拌18小時。然后用飽和NaHCO3猝滅該溶液，并用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)層，依次用水和鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮，得到無色油狀物9。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ4.95(m，6H)，3.97(t，1H，OH)，3.76(m，1H)，3.66(m，2H)，3.48(m，1H)，2.98(m，1H)，2.24(m，41)，2.08(m，1H)，1.90(m，1H)，1.79(m，1H)，1.70-1.56(m，4H)，1.50(m，1H)，1.40-1.27(m，4H)，1.22(2s，6H).
步驟37-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯 向用氮?dú)獯祾叩臒恐屑尤隒H2C12(40mL)，然后加入二甲亞砜(0.115g，0.10mL，1.48mmol)。將該溶液冷卻至-78℃，在劇烈攪拌下滴加入草酰氯(0.17g，0.12mL，1.3mmol)。30min后經(jīng)插管加入9(0.35g，1.2mmol)的5mL CH2Cl2溶液。于-78℃再繼續(xù)攪拌30min。滴加入三乙胺(0.31g，0.43mL，3.1mmol)，攪拌15min后，不用浴真空濃縮。使用乙醚/乙酸乙酯(100mL)(1∶1)溶液濾除三乙胺鹽，將溶液真空濃縮。然后將粗醛10用5mL THF稀釋，并于0℃加至已經(jīng)預(yù)混1小時的(2-氧代-3-苯基-丙基)-膦酸二甲酯(0.34g，1.4mmol)和60％氫化鈉(52mg，1.3mmol)的15mL THF溶液中。加入氯化鋅(x mL的1M THF溶液)，于50℃攪拌反應(yīng)混合物過夜。將該溶液用飽和氯化銨水溶液猝滅并用乙酸乙酯萃取。然后合并有機(jī)相，依次用H2O、鹽水洗滌并用Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮。經(jīng)快速層析用50-80％乙酸乙酯/己烷純化該化合物，得到無色油狀物11。
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.65-7.55(m，5H)，7.11(dd，1H)，6.67(d，1H)，4.95(m，1H)，4.40(m，1H)，3.78(m，1H)，2.60(m，1H)，2.25(m，4H)，2.02(m，1H)，1.90(m，1H)，1.68(m，2H)，1.53-1.36(m，4H)，1.35-1.17(m，10H).
步驟47-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯 A在甲苯中合成丁基-(S)-CBS向(S)-CBS配體(11.53g，45.5mmol)的甲苯(110mL)溶液中加入丁基硼酸(5.1g，47.8mmol)，將該混合物加熱至回流過夜，使用Dean stark。最終溶液為0.48M并直接使用。
B.還原在氮?dú)夥障?，向冷卻至-78℃的兒茶酚硼烷(3.35mL，31.4mmol)的甲苯(400mL)溶液中加入68mL(32.6mmol)(S)-2-丁基-CBS噁唑硼烷(oxazaborolidine)溶液，于該溫度下攪拌該混合物1小時。在氮?dú)夥障掠?h內(nèi)滴加入酮11(7g，15.6mmol)的甲苯(420mL)溶液，于該溫度下攪拌該混合物直至所有起始原料消失(通常在30min內(nèi))。然后向該混合物中加入200mL 1N HCl，在劇烈攪拌下將該混合物升溫至室溫。用乙酸乙酯萃取該混合物(在萃取過程中乳化，將懸浮液經(jīng)硅藻土過濾除去乳化)。將該粗產(chǎn)物經(jīng)快速層析純化。用EA/己烷(70-100％)洗脫得到需要的醇，該醇為兩種非對映異構(gòu)體12∶1比例的混合物。用手性Pak AD柱，50％iPrOH/己烷作洗脫劑(在入214nm檢測)，將該混合物經(jīng)制備HPLC(高效色相色譜)容易分離。先出來的是不需要的異構(gòu)體，隨后出來的是需要的異構(gòu)體12。
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ7.6-7.5(m，2H)，7.5-7.4(m，3H)，5.80(dd，1H)，5.6(dd，1H)，5.0-4.9(m，2H)，4.7-4.6(m，1H)，4.1-4.0(m，1H)，3.8-3.7(m，1H)，2.6-2.5(m，1H)，2.3-2.2(m，4H)，1.9-1.8(m，1H)，1.75-1.55(m，5H)，1.55-1.4(m，2H)，1.4-1.22(m，4H)，1.22(d，6H).
步驟57-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸 于0℃，向12(39mg，0.089mmol)的2.75mL THF∶MeOH∶水(2.5∶2.5∶1)溶液中加入氫氧化鋰(145μl的2M水溶液)，將所得溶液升溫至室溫并攪拌過夜。向該溶液中加入1M鹽酸(1mL)，并用乙酸乙酯萃取該溶液。然后合并有機(jī)相，用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。經(jīng)快速層析用49-45％/1-5％/1滴CH2Cl2/甲醇/乙酸純化該化合物，得到無色油狀物18。
1HNMR(500MHz，丙酮-d6)δ7.6-7.5(m，5H)，5.8(dd，1H)，5.6(dd，1H)，5.6(bs，1H)，4.6(m，1H)，4.1(m，1H)，3.7(m，1H)，2.6(m，1H)，2.4～2.2(m，4H)，1.9-1.2(m，12H).
下面的實(shí)施例4-13化合物可依照實(shí)施例1-3方法制備，并作適當(dāng)修改。
實(shí)施例47-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羥基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸MS(+ESI)M/Z 490.1(M+1)+。

實(shí)施例57-{[(2R)-2-(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸1H NMR(400MHZ，CD3OD)δ7.3-7.1(M，5H)，3.8-3.7(M，2H)，3.4(M，1H)，2.9-2.7(M，3H)，2.3(M，4H)，1.9-1.3(M，16H)；MS(-ESI)M/Z 374.2(M-1)-.
實(shí)施例65-{3-[(2R)-2-((1E)-(3S)3-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸甲酯1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.6(d，1H)，7.2-7.1(m，5H)，6.7(d，1H)，5.5(m，2H)，4.3(m，1H)，3.8-3.7(m，2H)，3.8(s，3H)，2.8-2.6(m，6H)，2.3-2.2(m，2H)，1.9-1.2(m，6H).
實(shí)施例75-{3-[(2R)-2-((1E)-(3S)3-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸1H NMR(400MHZ，CD3OD)δ7.6(D，1H)，7.2-7.1(M，5H)，6.9(D，1H)，5.5(M，2H)，4.3(M，1H)，3.9(M，1H)，3.7(M，1H)，2.9-2.6(M，5H)，2.2(M，2H)，1.9-1.5(M，6H)；MS(-ESI)M/Z
實(shí)施例85-{3-[(2R)-2-((3S)3-羥基-4-苯基-丁基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸1H NMR(400MHZ，CD3OD).δ7.6(D，1H)，7.3-7.1(M，5H)，6.9(D，1H)，3.8(M，2H)，3.4(M，1H)，3.0-2.9(M，1H)，2.8-2.5(M，4H)，2.3(M，2H)，2.0-1.3(M，10H)；MS(-ESI)M/Z 414.1(M-1)-.
實(shí)施例95-{3-[(2R)-2-((1E)-(3D)3-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸異丙酯1H NMR(400MHz，CDCl3)87.6(d，1H)7.3-7.1(m，5H)，6.8(d，1H)，5.5(m，2H)，5.1(m，1H)，4.4(m，1H)，3.9-3.8(m，2H)，3.3(br s，1H)，2.8(m，4H)，2.7(m，1H)，2.3(m，2H)，1.9-1.6(m，6H)，1.3(dd，6H)；MS(+ESI)M/Z 456.4(M+1)+.

實(shí)施例105-{3-[(2R)-2-((3S)3-羥基-4-苯基-丁基)-6-氧代-哌啶-1-基]-丙基}-噻吩-2-甲酸異丙酯1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.6(d，1H)，7.3-7.1(m，5H)，6.8(d，1H)，5.2(m，1H)，3.9-3.8(M，2H)，3.3(m，1H)，2.9-2.8(m，4H)，2.7-2.6(m，1H)，2.4-2.3(m，3H)，2.0-1.2(m，10H)，1.3(d，6H)；MS(+ESI)M/Z 458.2(M+1)+.
實(shí)施例116-[(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.3-7.1(m，5H)，3.8-3.7(m，2H)，3.3(m，1H)，2.9-2.7(m，5H)，2.3(m，2H)，1.9-1.3(m，16H)；MS(+ESI)M/Z 400.3(M+1)+.
實(shí)施例12(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸異丙酯MS(+ESI)M/Z 450.3(M+1)+。
實(shí)施例13(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸MS(-ESI)m/z 406.1(M-1)-。
I.EP4激動劑對兔和猴眼內(nèi)壓(IOP)的作用動物該研究中使用Drug- 雄性Dutch Belted兔和雌性食蟹猴(cynomolgus monkeys)。這項(xiàng)研究中動物的護(hù)理和處理依據(jù)國立衛(wèi)生研究院(NIH)的指導(dǎo)方針，以及視覺與眼科研究協(xié)會(ARVO)關(guān)于研究使用動物的決議。所有試驗(yàn)方法經(jīng)Merck and Company實(shí)驗(yàn)動物管理及使用委員會批準(zhǔn)。
藥物制劑和給藥藥物濃度根據(jù)活性成分(堿)來表示。將本發(fā)明化合物溶于生理鹽水中配成0.01％、0.001％、0.0001％溶液用于兔研究，配成0.05％、0.005％溶液用于猴研究。典型地，單側(cè)或雙側(cè)局部給予藥物或溶媒等分試樣(25μl)。在單側(cè)使用中，對側(cè)的眼睛使用等體積的鹽水。在測量眼壓前先將丙美卡因(0.5％)施用于角膜以便將不適降到最低。用氣動壓力計(jì)(Alcon Applanation Pneumatonograph)或等價物記錄眼內(nèi)壓(IOP)。
分析結(jié)果以從給予藥物或溶媒前測量的基礎(chǔ)水平開始的IOP變化表示，表示為平均值加上或減去標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Student t-檢驗(yàn)對非配對數(shù)據(jù)和配對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，非配對數(shù)據(jù)為藥物處理的動物反應(yīng)和溶媒處理的動物反應(yīng)之間的數(shù)據(jù)，配對數(shù)據(jù)為在可比較時間間隔內(nèi)同側(cè)眼睛和對側(cè)眼睛之間的數(shù)據(jù)。使用Dunnett“t”檢驗(yàn)根據(jù)“t-0”值也可確定數(shù)據(jù)的顯著性差異。星號表示p＜0.05的顯著水平。
A.兔眼內(nèi)壓的測量將體重2.5-4.0kg的雄性Dutch Belted兔維持在12小時光亮/黑暗周期和兔食物中。所有試驗(yàn)在相同時間進(jìn)行以便將與晝夜節(jié)律相關(guān)的可變性降到最小。處理前測量IOP，然后將本發(fā)明化合物或溶媒滴注(一滴25μl)到一只眼睛或雙眼中，滴注后，于30、60、120、180、240、300和360分鐘測量IOP。在一些情況中，對只用溶媒兩側(cè)處理的相同數(shù)量動物作為平行對照進(jìn)行評價，并與藥物處理的動物進(jìn)行比較。
B.猴眼內(nèi)壓的測量使用Lee等(1985)的方法，用氬激光系統(tǒng)(Coherent NOVUS 2000，Palo Alto，USA)通過小梁狀網(wǎng)狀組織的激光凝固法將體重2-3kg的雌性食蟹猴誘發(fā)右眼單側(cè)的高眼壓癥。眼內(nèi)壓(IOP)長時間增高可導(dǎo)致視神經(jīng)乳頭發(fā)生改變，類似于青光眼患者中所發(fā)現(xiàn)的那些改變。
為了測量IOP，在試驗(yàn)期間將猴放在約束椅(restraint chairs)保持坐姿。每次IOP測量前約5分鐘肌內(nèi)注射鹽酸氯胺酮(3-5mg/kg)將動物輕度麻醉，記錄IOP前滴注一滴0.5％的丙美卡因。使用氣動壓力計(jì)(Alcon Applanation壓力計(jì))或Digilab眼壓計(jì)(Bio-Rad OphthalmicDivision，Cambridge，MA，USA)測量IOP。
在處理前和處理后通常30、60、124、180、300和360分鐘測量IOP?；A(chǔ)值也通常在處理前兩天或三天的這些時間點(diǎn)測得。處理由滴注一滴25μl的本發(fā)明化合物(0.05％和0.005％)或溶媒(鹽水)組成。在同一動物進(jìn)行測試前采用至少一周的間歇期(washout)。常壓(高壓對側(cè))眼睛用完全類似于高眼壓眼睛的方式處理。測量雙眼的IOP，并與同一時間點(diǎn)的相應(yīng)基礎(chǔ)值比較。結(jié)果以平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)偏差、單位為mm Hg表示。用于眼睛使用的本發(fā)明化合物活性范圍為0.01-100,000nM。
II.放射性配體結(jié)合試驗(yàn)用于測試這些化合物的試驗(yàn)基本上按Abramovitz M、Adam M、Boie Y、Carriere M、Denis D、Godbout C、Lamontagne S、Rochette C、Sawyer N、Tremblay NM、Belley M、Gallant M、Dufresne C Gareau Y、Ruel R、Juteau H、Labelle M、Ouimet N、Metters KM描述的方法進(jìn)行。利用重組前列腺素類受體測定前列腺素和相關(guān)類似物的親和力和選擇性。Biochim Biophys Acta 2000 Jan 17；1483(2)285-293和如下論述人胚(HEK)293(EBNA)細(xì)胞系中前列腺素類受體的穩(wěn)定表達(dá)將對應(yīng)全長編碼序列的前列腺素類受體(PG)cDNA亞克隆至哺乳動物表達(dá)溶媒pCEP4(Invitrogen)的適當(dāng)位置。根據(jù)制造商的說明，pCEP4PG質(zhì)粒DNA用Qiagen質(zhì)粒制備試劑盒(QIAGEN)制備，用LipofectAMINE@(GIBCO-BRL)轉(zhuǎn)染至HEK293(EBNA)細(xì)胞。在Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中選擇表達(dá)cDNA以及潮霉素抗性基因的HEK293(EBNA)細(xì)胞，DMEM補(bǔ)加10％熱滅活胎牛血清、1mM丙酮酸鈉、100U/ml青霉素-G、100μg/ml硫酸鏈霉素、250μg/ml活性GENETICINTM(G418)(所有均來自Life Technologies，Inc./BRL)和200μg/ml潮霉素(Calbiochem)。生長2-3周后用克隆環(huán)方法選擇性分離單獨(dú)集落，隨后擴(kuò)展至克隆細(xì)胞系。受體cDNA的表達(dá)通過受體結(jié)合試驗(yàn)評價。
于37℃、空氣中6％CO2的潮濕氣氛中，在補(bǔ)加DMEM完全培養(yǎng)基中使HEK293(EBNA)細(xì)胞生長，然后收獲并通過差示離心法(1000×g 10分鐘，然后160,000×g 30分鐘，都設(shè)定在4℃)制備膜，接著在蛋白酶抑制劑(2mM苯甲磺酰氟、10μM E-64、100μM亮抑酶肽和0.05mg/ml抑胃酶肽)的存在下，在冰上通過氮?dú)馕g以800psi溶胞30分鐘。在大約5-10mg/ml蛋白質(zhì)時，通過Dounce勻化作用(Dounce A；10個脈沖(strokes))將160,000×g粒狀物再懸浮在含1mM EDTA的10mM HEPES/KOH(pH7.4)中，將其冷凍在液氮中并于-80℃儲存。
前列腺素類受體結(jié)合試驗(yàn)前列腺素類受體結(jié)合試驗(yàn)在0.2ml 10mM MES/KOH(pH6.0)(EP亞型、FP和TP)或10mM HEPES/KOH(pH7.4)(DP和IP)中的最終溫育體積中進(jìn)行，含1mM EDTA、10mM MgCl2(EP亞型)或10mMMnCl2(DP、FP、IP和TP)和放射性配體[用于EP亞型的0.5-1.0nM[3H]PGE2(181Ci/mmol)、用于DP的0.7nM[3H]PGD2(115Ci/mmol)、用于FP的0.95nM[3H]PGF2α(170Ci/mmol)、用于IP的5nM[3H]伊洛前列素(16Ci/mmol)和用于TP的1.8nM[3H]SQ 29548(46Ci/mmol)]。EP3試驗(yàn)也含100μM GTPγS。通過加入來自160,000×g份的膜蛋白(大約30μg用于EP1、20μg用于EP2、2μg用于EP3、10μg用于EP4、60μg用于FP、30μg用于DP、10μg用于IP和10μg用于TP)引發(fā)反應(yīng)。向所有溫育物中保持在1％(v/v)不變的二甲基亞砜(Me2SO)中加入配體。在1μM相應(yīng)非放射性前列腺素類化合物的存在下測定非特異性結(jié)合。于30℃(EP亞型、DP、FP和TP)或室溫(IP)進(jìn)行溫育60分鐘(EP亞型、FP和TP)或30分鐘(DP和TP)，通過96-孔Unifilter GF/C(Canberra Packard)快速過濾來中止，Unifilter用不含EDTA(4℃)的試驗(yàn)溫育緩沖液預(yù)濕，用Tomtec Mach III 96-孔半自動細(xì)胞收集器收集。濾器用3-4ml相同的緩沖液洗滌，于55℃干燥90分鐘，結(jié)合于單獨(dú)濾器的剩余放射性通過加入50μl Ultima Gold F(Canberra Packard)使用1450 MicroBeta(Wallac)經(jīng)閃爍計(jì)數(shù)來測定。特異性結(jié)合通過從全部結(jié)合中減去非特異性結(jié)合來計(jì)算。特異性結(jié)合占全部結(jié)合的90-95％，與所使用的放射性配體和蛋白的濃度成線性。全部結(jié)合占加至溫育培養(yǎng)基的放射性配體的5-10％。
用于骨病用途的本發(fā)明化合物活性范圍為0.01-100,000nM。
權(quán)利要求
1.一種具有結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物 式I其中U表示H、C1-3烷基或當(dāng)W為＝O時不存在；W表示OH或＝O，條件是當(dāng)W為＝O時U不存在；Z表示(CH2)n或CH＝CH；R1表示(CH2)p羥基、(CH2)pCO2R10或(CH2)n雜環(huán)基，所述雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代且任選含有酸性羥基；R2獨(dú)立表示C1-10烷基、(CH2)mC6-10芳基、(CH2)mC5-10雜環(huán)基、(CH2)mC3-10雜環(huán)烷基、(CH2)mC3-8環(huán)烷基，所述烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜環(huán)基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代；R3和R4獨(dú)立表示氫、鹵素或C1-6烷基；R6表示氫或C1-4烷基；R10表示氫、C1-10烷基、C3-10環(huán)烷基、(CH2)pC6-10芳基、(CH2)pC5-10雜環(huán)基；Ra表示C1-6烷氧基、C1-6烷基、CF3、硝基、氨基、氰基、C1-6烷基氨基、鹵素，或Ra還表示芳基和雜環(huán)基、SC1-6烷基、SC6-10芳基、SC5-10雜環(huán)基、OC6-10芳基、OC5-10雜環(huán)基、CO2R6、CH2OC1-6烷基、CH2SC1-6烷基、CH2O芳基、CH2S芳基； 表示雙鍵或單鍵；p表示0-3；n表示0-4；且m表示0-8。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為(CH2)pCO2R10，R3和R4為鹵素，且R2為(CH2)mC6-10芳基，所述芳基未取代或被1-3個Ra基團(tuán)取代。
3.一種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物，所述化合物為1)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸；2)7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯；3)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4--二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸異丙酯；4)(5Z)-7-{(2R)-2-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯-1-基]-6-氧代哌啶-1-基}庚-5-烯酸；5)7-{[(2R)-2-(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-6-氧代-哌啶-1-基}庚酸；6)7-{(2R)-2-[(1E)-4，4-二氟-3-氧代-4-苯基丁-1-烯基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸異丙酯；7)6-[(3R)-3-羥基-4-苯基-丁基]-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-哌啶-2-酮；8)(6S)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌嗪-2-酮；9)(6R)-6-[(1E，3R)-4，4-二氟-3-羥基-4-苯基丁-1-烯基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)己基]哌啶-2-酮；10)7-{(2R)-2-[(3R)-4-(3-溴苯基)-4，4-二氟-3-羥基丁基]-6-氧代哌啶-1-基}庚酸。
4.一種治療高眼壓癥或青光眼的方法，所述方法包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
5.一種藥用組合物，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1、2或3的式I化合物，所述組合物作為溶液劑或混懸劑以局部用制劑給藥。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中有一種或多種活性成分加入所述局部用制劑中，所述活性成分屬于β-腎上腺素能阻斷劑、擬副交感神經(jīng)藥、擬交感神經(jīng)藥、碳酸酐酶抑制劑、Maxi-K通道阻斷劑和前列腺素、降血壓性脂質(zhì)、神經(jīng)保護(hù)劑和5-HT2受體激動劑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述β-腎上腺素能阻斷劑為噻嗎洛爾、倍他洛爾、左旋倍他洛爾、卡替洛爾或左旋布諾洛爾；所述擬副交感神經(jīng)藥為匹魯卡品；所述擬交感神經(jīng)藥為腎上腺素、溴莫尼定、阿可樂定、可樂定或?qū)Π被蓸范?，所述碳酸酐酶抑制劑為多佐胺、乙酰唑胺、甲醋唑胺或布林唑胺；COSOPT，所述Maxi-K為PenitremA、paspalicine、卡律蝎毒素、iberiotoxin、Paxicillan、Aflitram、Verroculogen、1-(1-異丁基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2，2-二甲基丙基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(環(huán)己基甲基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(1-己基-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基)-2-甲基丙-1-酮；1-[1-(2-乙基己基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-基]-2-甲基丙-1-酮；1-(3-異丁?；?6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)丁-2-酮；1-(3-異丁?；?6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3-環(huán)戊基羰基)-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮；1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-6-甲氧基-1H-吲唑-3-甲酸；和1-[3-(3-羥基丙?；?-6-甲氧基-1H-吲唑-1-基]-3，3-二甲基丁-2-酮，所述前列腺素為拉坦前列素、曲伏前列素、烏諾前列酮、異丙基烏諾前列酮或S1033，所述降血壓性脂質(zhì)為比馬前列素，所述神經(jīng)保護(hù)劑為依利羅地、R-依利羅地或美金剛；和所述5-HT2受體激動劑為延胡索酸1-(2-氨基丙基)-3-甲基-1H-吲唑-6-醇或2-(3-氯-6-甲氧基-吲唑-1-基)-1-甲基-乙胺。
8.一種治療黃斑水腫或黃斑變性、治療干眼癥、增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭血液速度、增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)氧張力或提供神經(jīng)保護(hù)的方法，所述方法包括給予需要這種治療的患者藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1的化合物。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述式I化合物作為局部用制劑施用，且向該制劑中加入活性成分，所述活性成分屬于β-腎上腺素能阻斷劑、擬副交感神經(jīng)藥、擬交感神經(jīng)藥、碳酸酐酶抑制劑、COSOPT、Maxi-K通道阻斷劑和前列腺素、降血壓性脂質(zhì)、神經(jīng)保護(hù)劑和5-HT2受體激動劑。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述局部用制劑任選含有黃原膠或吉蘭糖膠。
11.權(quán)利要求1、2或3定義的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物在制備用于治療高眼壓癥或青光眼的藥物中的用途。
12.用于藥物治療的權(quán)利要求1、2或3定義的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物。
13.權(quán)利要求1、2或3定義的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、前藥或混合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療黃斑水腫或黃斑變性、干眼癥，增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭血液速度，增加視網(wǎng)膜和視神經(jīng)氧張力或提供神經(jīng)保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及前列腺素E2受體EP
文檔編號C07D279/06GK1764659SQ200480008186
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者X·比洛特, J·科盧西, Y·韓, M·-C·威爾遜, R·N·楊 申請人:麥克弗羅斯特加拿大有限公司