一種固定化碳酸酐酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種固定化碳酸酐酶及其制備方法，該固定化碳酸酐酶包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。本發(fā)明采用共價(jià)鍵將磁性納米顆粒載體和生物酶結(jié)合，獲得的固定化碳酸酐酶，具有納米級(jí)粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于微米級(jí)以上的固定化酶；具有超順磁性，使得固定化酶的重復(fù)使用性、操作穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶；使得固定化碳酸酐酶物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)能大幅提高生產(chǎn)效率，同時(shí)降低生物酶的使用成本。
【專利說(shuō)明】一種固定化碳酸酐酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固相化酶【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種固定化碳酸酐酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]酶的固定化是指通過(guò)化學(xué)、物理、生物方法，利用載體將酶限制或束縛在特定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的一種酶工程技術(shù)。酶的固定化技術(shù)有利于酶回收及連續(xù)化運(yùn)作從而降低生產(chǎn)成本，因此成為近年來(lái)酶工程領(lǐng)域最為活躍的研究重點(diǎn)之一。
[0003]磁性納米顆粒是一種利于分離和再利用的固定化載體，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。目前磁性納米顆粒載體主要通過(guò)殼聚糖和瓊脂糖包裹磁性納米核達(dá)到改性修飾的目的。然而這種方法制備的磁性納米顆粒固定化載體，由于采用包埋作用將酶分子包埋于載體內(nèi)部，導(dǎo)致酶的催化活性結(jié)構(gòu)受到載體的阻礙，對(duì)酶活力會(huì)造成影響，和游離酶相比，活力大幅度降低。
[0004]碳酸酐酶，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種金屬蛋白，能夠高效催化二氧化碳水化和去水化反應(yīng)。固定化的碳酸酐酶在環(huán)境保護(hù)、生物質(zhì)能源、食品儲(chǔ)存工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。目前碳酸酐酶的固定化，主要采用離子交換作用力、物理吸附力或包埋法等方法與微米級(jí)以上固相多孔性顆粒結(jié)合。其中，微米級(jí)以上固相多孔性顆粒尺寸過(guò)大，固定化酶分散性弱，影響外部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低；離子交換作用力，結(jié)合的碳酸酐酶過(guò)少；物理吸附力，作用力過(guò)弱，結(jié)合不牢固，導(dǎo)致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不穩(wěn)定；包埋法，碳酸酐酶的活性位點(diǎn)受到載體的阻礙，影響內(nèi)部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供了一種固定化碳酸酐酶，采用共價(jià)鍵將如碳酸酐酶的生物酶與磁性納米顆粒結(jié)合，形成固定化生物酶，具有酶催化效率高、生物酶不易脫落、操作穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述固定化碳酸酐酶的制備方法。
[0006]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種固定化碳酸酐酶，包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合；其中，磁性納米顆粒平均粒徑為5?30nm，富醛基殼的平均厚度為5?20nm。
[0007]所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物。
[0008]所述富醛基復(fù)合材料包括兩層，從內(nèi)到外依次為硅烷交聯(lián)劑層和多醛基化合物層。
[0009]所述碳酸酐酶為α型或β型碳酸酐酶。
[0010]所述固定化碳酸酐酶,每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。
[0011]一種所述固定化碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟:
1)制備磁性納米顆粒； 2)取磁性納米顆粒和硅烷交聯(lián)劑均勻分散于有機(jī)溶劑中，低溫低速攪拌，獲得包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒；
3)取包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒，均勻分散于多醛基化合物的弱堿性緩沖液中，去除緩沖液，獲得醛基功能化的磁性納米顆粒；
4)取醛基功能化的磁性納米顆粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，攪拌混合進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，即制得固定化碳酸酐酶。
[0012]步驟2)中，所述的硅烷交聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有機(jī)溶劑為無(wú)水乙醇，將磁性納米顆粒與硅烷交聯(lián)劑超聲分散后，再將分散液加入到有機(jī)溶劑中，攪拌分散，從而使分散液與有機(jī)溶劑充分混勻，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
[0013]步驟3)中，所述的多醛基化合物為戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
[0014]步驟4)中，所述醛基功能化的磁性納米顆粒與碳酸酐酶過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液濃度為f5mg/mL，碳酸酐酶與富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:2?10。
[0015]步驟4)中，所述共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)條件為25?30°C，搖床混合2?5h，搖床轉(zhuǎn)速為120?200r/min。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
I)本發(fā)明采用共價(jià)鍵將磁性納米顆粒載體和生物酶結(jié)合，獲得的固定化碳酸酐酶，具有納米級(jí)粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于微米級(jí)以上的固定化酶。
[0017]2)本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，具有超順磁性，使得固定化酶的重復(fù)使用性、操作穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶。
[0018]3)本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，采用醛基功能化修飾的磁性納米顆粒與碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，使得固定化碳酸酐酶物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)能大幅提高生產(chǎn)效率，同時(shí)降低生物酶的使用成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是固定化碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是固定化碳酸酐酶存放于N-甲基二乙醇胺中的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果圖。
[0020]圖3是固定化碳酸酐酶與傳統(tǒng)固定化碳酸酐酶的性能對(duì)比結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，一下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0022]一種固定化碳酸酐酶，結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶。其中，磁性納米顆粒，平均粒徑為5?30nm，可為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物，例如:Fe304、Fe203、Ti02，優(yōu)選磁性和穩(wěn)定性良好且成本較低的Fe3O4 ;富醛基復(fù)合材料，是指含有豐富醛基的復(fù)合材料，包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，其平均厚度為5?20nm，富醛基復(fù)合材料包括兩層，從里到外依次為硅烷交聯(lián)劑和多醛基化合物，硅烷交聯(lián)劑，如氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，多醛基化合物，如戊二醛、丁二醛或丙二醛；富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，其表面醛基與待固定化的酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。
[0023]實(shí)施例1
一種固定化碳酸酐酶制備方法，包括以下步驟:
I)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe3O4納米顆粒，控制平均粒徑為10納米。
[0024]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL氨丙基三乙氧基硅烷加入到50mL無(wú)水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌40h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒。
[0025]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe3O4納米顆粒:取包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%戊二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒與戊二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0026]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒200mg，分散于1mL 2mg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液中(50mmol/L pH 7.0?8.5)，pH為8.0，30°C，搖床混合4h，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0027]將制備的固定化碳酸酐酶通過(guò)pH電極法測(cè)定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對(duì)于游離酶每克蛋白的單位酶活力為65% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為80mg。
[0028]實(shí)施例2
一種固定化碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟:
I)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe3O4納米顆粒，控制平均粒徑為20納米。
[0029]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL 3_氨丙基三甲氧基硅烷加入到50mL無(wú)水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌24h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒。
[0030]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe3O4納米顆粒:取包覆有氨丙基三甲氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%丙二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使所述包覆有氨丙基三甲氧基硅烷的磁性納米顆粒與丙二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0031]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒20mg,分散于10mL lmg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH 7.(Γ8.5)中，pH為8.0，30°C，搖床混合2h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0032]將制備的固定化碳酸酐酶通過(guò)pH電極法測(cè)定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對(duì)于游離酶每克蛋白的單位酶活力為33% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為90mg。
[0033]實(shí)施例3
一種固定化碳酸酐酶制備方法，包括以下步驟:
1)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe304納米顆粒，控制平均粒徑為30納米。
[0034]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL氨丙基三乙氧基硅烷加入到50mL無(wú)水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌40h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒。
[0035]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe304納米顆粒:取包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%丙二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒與戊二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0036]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒250mg,分散于10mL 5mg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH 7.0?8.5)中，pH為8.0，28°C，搖床混合5h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0037]將制備的固定化碳酸酐酶通過(guò)pH電極法測(cè)定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對(duì)于游離酶每克蛋白的單位酶活力為51% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為76mg。
[0038]實(shí)施例4
將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的固定化碳酸酐酶分別靜置于3mol/L的N-甲基二乙醇胺溶液中，放置(T24h，進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖2。工業(yè)化應(yīng)用中，固定化碳酸酐酶的催化環(huán)境是在3mol/L的N-甲基二乙醇胺溶液中，所以固定化碳酸酐酶對(duì)于N-甲基二乙醇胺的耐受性是一個(gè)很重要的衡量因素，從圖2結(jié)果可知，所制備的固定化碳酸酐酶對(duì)于N-甲基二乙醇胺有很好的耐受性。
[0039]實(shí)施例5
將實(shí)施例1中制備的固定化碳酸酐酶通過(guò)pH電極法，進(jìn)行批次使用穩(wěn)定性測(cè)試，與參照文獻(xiàn)(Immobilizat1n of carbonic anhydrase on mesoporous aluminosilicate forcarbonat1n react1n, Snehal Wanjari, Microporous and Mesoporous Materials 160(2012) 151-158)報(bào)道的制備的介孔硅鋁酸鹽顆粒固定化碳酸酐酶的批次使用測(cè)試相比較，結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)實(shí)施例1所制備的固定化碳酸酐酶批次使用性能穩(wěn)定，在多次循環(huán)使用后，其相對(duì)酶活力仍保持較高水平。在工業(yè)化應(yīng)用中，可大幅度降低固定化酶的使用成本，具有良好的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化碳酸酐酶，其特征在于:包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合；其中，磁性納米顆粒平均粒徑為5?30nm，富醛基殼的平均厚度為5?20nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述富醛基復(fù)合材料包括兩層，從內(nèi)到外依次為硅烷交聯(lián)劑層和多醛基化合物層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述碳酸酐酶為α型或β型碳酸酐酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述固定化碳酸酐酶，每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。
6.一種權(quán)利要求f 5任意一項(xiàng)所述固定化碳酸酐酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: O制備磁性納米顆粒； 2)取磁性納米顆粒和硅烷交聯(lián)劑均勻分散于有機(jī)溶劑中，低溫低速攪拌，獲得包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒； 3)取包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒，均勻分散于多醛基化合物的弱堿性緩沖液中，去除緩沖液，獲得醛基功能化的磁性納米顆粒； 4)取醛基功能化的磁性納米顆粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，攪拌混合進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，即制得固定化碳酸酐酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟2)中，所述的硅烷交聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有機(jī)溶劑為無(wú)水乙醇，將磁性納米顆粒與硅烷交聯(lián)劑超聲分散后，再將分散液加入到有機(jī)溶劑中，攪拌分散，從而使分散液與有機(jī)溶劑充分混勻，米用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟3)中，所述的多醛基化合物為戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟4)中，所述醛基功能化的磁性納米顆粒與碳酸酐酶過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液濃度為f5mg/mL，碳酸酐酶與富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:2?10。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化碳酸酐酶制備方法，其特征在于:步驟4)中，所述共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)條件為25?30°C，搖床混合2?5h，搖床轉(zhuǎn)速為12(T200r/min。
【文檔編號(hào)】C12N11/08GK104404024SQ201410616704
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】?？? 余允東, 張敏, 陳亭亭, 龍輝, 汪浩, 周曉青, 張燕, 陳風(fēng)義 申請(qǐng)人:上海立足生物科技有限公司