專利名稱：聚丙烯酸球刷的活性聚合制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚丙烯酸球刷的活性聚合制備方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種通過活性聚合合成路線制備聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
活性自由基聚合是上個世紀(jì)末在傳統(tǒng)自由基聚合基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的一種聚合技術(shù)。目前獲得較好發(fā)展的代表性方法有氮氧穩(wěn)定自由基聚合法(NMP)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)和斷裂-加成鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合法(RAFT)。通過活性自由基聚合法得到的聚合物具有可控的分子量和分子量分布，以及活性的端基，因此使得活性自由基聚合法成為合成具有新型結(jié)構(gòu)材料以及實現(xiàn)材料的結(jié)構(gòu)控制的有力手段。球刷是將聚合物鏈的一端連接到球形固相載體表面所形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。其中，聚丙烯酸球刷由于具有簡單規(guī)整的結(jié)構(gòu)、豐富的羧基功能基團(tuán)、良好的分散穩(wěn)定性以及環(huán)境響應(yīng)特性而得到了廣泛的研究與應(yīng)用。早期主要使用常規(guī)自由基聚合法合成聚丙烯酸球刷。近幾年隨著活性自由基聚合技術(shù)的發(fā)展，活性自由基聚合法逐漸成為合成聚丙烯酸球刷的主要方法。借助活性聚合技術(shù)可以實現(xiàn)對聚丙烯酸毛刷長度的裁制與調(diào)控，從而獲得結(jié)構(gòu)更為規(guī)整可控的球刷。對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Rutnakornpituk等在《高分子》第52期987-995頁發(fā)表的“用于葉酸偶聯(lián)的聚丙烯酸接枝的磁性納米顆粒”(Poly (acrylic acid)-graftedmagnetic nanoparticle for conjugation with folic acid, Polymer,52, (2011),987-995)中報道了利用ATRP法制備了聚丙烯酸球刷并實現(xiàn)了對葉酸的偶聯(lián)。由于ATRP法并不適用于包括丙烯酸在內(nèi)的帶有羧基單體的聚合，因此該文獻(xiàn)采用先聚合丙烯酸叔丁酯，然后在強(qiáng)酸性環(huán)境中脫除叔丁基的方法來獲得聚丙烯酸球刷。這種方法雖然能夠獲得聚丙烯酸球刷，但顯然增加了合成步驟，且由于需要在強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行脫保護(hù)，因此存在容易弓I起球刷結(jié)構(gòu)破壞、顆粒團(tuán)聚等問題。RAFT聚合法作為另一種代表性的活性自由基聚合方法，能夠直接聚合丙烯酸，因而更加適合用于制備聚丙烯酸球刷。進(jìn)一步的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Hong等在《材料化學(xué)雜志》第19期5155-5160頁發(fā)表的“含有介孔球核與pH響應(yīng)性殼層的智能納米載體的制備及其在藥物可控攜載和釋放中的應(yīng)用”(Fabrication of smart nanocontainers with amesoporous core and a pH—responsive shell for controlled uptake and release,J. Mater. Chem.，2009，19，5155-5160)中報道了用RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷。這一工作首先是在介孔氧化硅的外層進(jìn)行環(huán)氧修飾，并通過開環(huán)與偶聯(lián)反應(yīng)固定RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑，然后借助RAFT聚合成功地在介孔氧化硅外表面形成聚丙烯酸球刷結(jié)構(gòu)。但在這一工作中，RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的固定化共涉及三步表面化學(xué)反應(yīng)，其合成路線仍較為繁瑣。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種采用簡便、高效而通用的活性聚合合成路線來合成聚丙烯酸球刷。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種借助RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷的簡便、高效而通用的新合成路線。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種聚丙烯酸球刷的活性聚合制備方法以及將該聚丙烯酸球刷材料實現(xiàn)在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用及其方法。具體地，本發(fā)明首先將RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑通過一步反應(yīng)固定到球形固相載體表面；然后，通過RAFT聚合方法在接枝有RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結(jié)構(gòu)，最終得到聚丙烯酸球刷。本發(fā)明是通過以下具體技術(shù)方案實現(xiàn)的一方面，本發(fā)明合成了一種新型結(jié)構(gòu)的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑。本發(fā)明的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑為硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑，由于該RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑帶有硅烷結(jié)構(gòu)，即RAFT試劑的離去基團(tuán)帶有硅烷功能基團(tuán)，因此該硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑可以通過一步反應(yīng)簡便地固定到球形固相載體表面。本發(fā)明的硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑用下述通式(I)表示
\S
O Z廠V、人^R
/ O ' 1
(I)其中=RSC2-C12的直鏈烷基(_CnH2n+1，n = 2-12)、或芐基(-C7H7);例如乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、異戍基、新戍基、正己基、2_甲基羊基、正癸基、或正十_■燒基等。另一方面，本發(fā)明提供了一種聚丙烯酸球刷及其合成路線。本發(fā)明所述的聚丙烯酸球刷，包括作為聚丙烯酸球刷的球核結(jié)構(gòu)的球形固相載體，該聚丙烯酸球刷為在固相載體的表面接枝聚丙烯酸的毛刷結(jié)構(gòu)。其中，所述球形固相載體的表面帶有羥基功能基團(tuán)，且能與硅烷化試劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。在本發(fā)明中，球形固相載體為本領(lǐng)域常用的微球，優(yōu)選采用《膠體與界面科學(xué)雜志》1968年第26期62-69頁報道的方法制備得到的單分散氧化娃微球。在本發(fā)明中，合成聚丙烯酸球刷的路線使用如上所述的硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑，該合成路線包括以下步驟步驟一，制備硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑；步驟二，通過一步法在微球表面接枝步驟一制備得到的硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑；步驟三，通過RAFT聚合方法在接枝有RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結(jié)構(gòu)，最終得到聚丙烯酸球刷。在本發(fā)明的具體實施方式
中，步驟一中制備硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的具體過程如下首先，將R-SH與堿溶于有機(jī)溶劑中，于10_60°C下反應(yīng)10_60分鐘；然后將二硫化碳逐滴加入該體系中，加完于10-60°C下繼續(xù)反應(yīng)10-60分鐘，溶液變?yōu)榈S色或黃色；再向體系中加入對氯4-苯基三甲氧基硅烷，于10-60°C下繼續(xù)反應(yīng)2-24小時，溶液變?yōu)辄S色或深黃色，有大量固體析出；濃縮有機(jī)相，加入非極性有機(jī)溶劑，過濾，將得到的黃色或深黃色液體濃縮后通過柱層析純化，得到硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑。其中，所述堿與R-SH的摩爾比優(yōu)選為I : 1-4 ;R_SH與二硫化碳的摩爾比優(yōu)選為I : 1_4 ;R-SH與對氣4-苯基二甲氧基娃燒的摩爾比優(yōu)選為I : 1-4。在本發(fā)明中，所述堿優(yōu)選為氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸鉀或氫氧化鉀等無機(jī)堿。有機(jī)溶劑優(yōu)選為四氫呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮等；非極性有機(jī)溶劑優(yōu)選為二氯甲烷、丙酮或甲苯等。在本發(fā)明的較佳實施方式中，步驟一中，濃縮液進(jìn)行柱層析時淋洗劑為乙酸乙酯(EA)-石油醚(PA)、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚體系；淋洗劑的配比優(yōu)選為I 1-100。在本發(fā)明的較佳實施方式中，步驟二中通過一步法在微球表面接枝步驟一制備得到的硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的具體過程如下將微球與硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑分散在乙醇中，通過油浴加熱的方式使體系回流反應(yīng)24小時，產(chǎn)物經(jīng)乙醇洗滌后穩(wěn)定分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑修飾的微球。在本發(fā)明的另一較佳實施方式中，步驟三中制備聚丙烯酸球刷的具體過程如下
將制備得到的表面由硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑修飾的微球重新分散在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丙烯酸、自由的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑、偶氮二異丁腈，通過油浴加熱的方式使體系在70°C下發(fā)生聚合反應(yīng)3小時，產(chǎn)物經(jīng)乙醇洗滌后穩(wěn)定分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷。在本發(fā)明中，所述自由的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑是指與上述硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑結(jié)構(gòu)類似，但不含硅烷功能基團(tuán)的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑。其結(jié)構(gòu)可以是例如C6H5CH2SCS2C2H5'C6H5CH2SCS2C3H7,C6H5CH2SCS2C4H9,C6H5CH2SCS2C12H25 或 C6H5CH2SCS2CH2C6H5,但并不限于上述結(jié)構(gòu)中的一種。另一方面，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)如上所述合成路線所制備得到的聚丙烯酸球刷的應(yīng)用，尤其提供了該聚丙烯酸球刷材料在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用。本發(fā)明的聚丙烯酸球刷材料在實現(xiàn)蛋白高密度固定化中的應(yīng)用方法，包括以下步驟步驟一，對聚丙烯酸球刷進(jìn)行活化；步驟二，將蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；步驟三，對步驟二形成的球刷與蛋白的復(fù)合物進(jìn)行洗滌、封閉與保存。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，聚丙烯酸球刷材料在實現(xiàn)蛋白高密度固定化中的具體應(yīng)用方法如下步驟一，將聚丙烯酸球刷重新分散到緩沖液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)，該體系在室溫下混合15分鐘，得到活化后的聚丙烯酸球刷，用該緩沖液洗滌三次；步驟二，將活化后的聚丙烯酸球刷與蛋白在緩沖液中混合，在37°C下恒溫反應(yīng)2小時，得到球刷與蛋白的復(fù)合物；步驟三，首先，用含有對氨基基團(tuán)具有淬滅作用的封閉液洗滌復(fù)合物三次；然后將復(fù)合物分散在封閉液中并在4°C下混合過夜；最后，用保存液洗滌復(fù)合物三次，最終將復(fù)合物分散在該保存液中。在本發(fā)明的較佳實施方式中，步驟一中，反應(yīng)物的用量優(yōu)選為聚丙烯酸球刷I 2mg/mL, EDC 25mg/mL, NHS 25mg/mL ;步驟二中，可根據(jù)球刷羧基的含量加入不同濃度的蛋白以獲得球刷的飽和蛋白結(jié)合量，在達(dá)到蛋白飽和結(jié)合量之前，加入的蛋白均能以共價鍵結(jié)合的方式固定到球刷表面。優(yōu)選地以每100個羧基結(jié)合2個蛋白為基準(zhǔn)投料量，以該基準(zhǔn)反應(yīng)比附近來估算飽和結(jié)合量。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述緩沖液是指但不限于10mM的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖液，該緩沖液的pH為7. 2 7. 6，含有或不含有O. 05wt. %的吐溫 -20。所述封閉液是指但不限于含有O. lwt. % BSA(牛血清白蛋白)、0· 2wt. % BSA或
O.5wt. %甘氨酸的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖液，該封閉液的pH為7. 2 7. 6。所述保存液是指但不限于含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液，該保存液的pH為7. 2 7. 6。本發(fā)明采用新型的合成方法合成了聚丙烯酸球刷。與傳統(tǒng)合成路線相比，該合成路線大大縮短了合成的步驟與時間，提高了反應(yīng)效率，并且使得所得到的聚丙烯酸球刷具有較高的接枝密度和羧基含量，為蛋白固定化提供了更多的位點(diǎn)。當(dāng)將采用本發(fā)明方法制備得到的聚丙烯酸球刷用于蛋白的固定化應(yīng)用時，可實現(xiàn)大幅度提高蛋白固定化能力。經(jīng)檢測采用本發(fā)明合成的聚丙烯酸球刷對鏈霉親和素蛋白(SA)的結(jié)合量高達(dá)1950 μ g/mg球刷，與已有文獻(xiàn)報道的非球刷結(jié)構(gòu)的聚丙烯酸改性氧化硅微球?qū)A的固定化能力相比，其對SA蛋白的固定化能力提高了 45倍。以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。


圖I是本發(fā)明的實施例2的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑修飾的氧化硅微球的紫外-可見分光光度光譜圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。在實施例中，所采用的試劑除另有說明外均為市售商品。其中，微球為采用《膠體與界面科學(xué)雜志》1968年第26期62-69頁報道的方法制備得到的單分散氧化硅微球。實施例I合成硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑
權(quán)利要求
1.一種聚丙烯酸球刷的活性聚合制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一、合成硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑；步驟二、將所述硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑通過一步反應(yīng)接枝固定到球形固相載體表面； 步驟三、通過RAFT聚合方法在所述接枝有RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的載體表面形成聚丙烯酸 毛刷結(jié)構(gòu)，最終得到聚丙烯酸球刷；其中，所述球形固相載體為表面帶有羥基基團(tuán)的微球；所述硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的分子結(jié)構(gòu)如下
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，步驟一的具體過程如下將R-SH與無機(jī)堿溶于有機(jī)溶劑中，于10-60°C下反應(yīng)10-60分鐘；然后將二硫化碳逐 滴加入該體系中，加完于10-60°C下繼續(xù)反應(yīng)10-60分鐘；再向體系中加入對氯4-苯基三 甲氧基硅烷，于10-60°C下繼續(xù)反應(yīng)2-24小時；濃縮有機(jī)相，加入非極性有機(jī)溶劑，過濾，將 得到的液體濃縮后通過柱層析純化，得到硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑；其中，所述無機(jī)堿與R-SH的摩爾比為1 : 1-4 ;R-SH與二硫化碳的摩爾比為1 : 1-4; R-SH與對氯4-苯基三甲氧基硅烷的摩爾比為1 : 1-4。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，所述無機(jī)堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸鉀或氫 氧化鉀；所述有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮；所述非極性有機(jī)溶劑為 二氯甲烷、丙酮或甲苯。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其中，所述濃縮液進(jìn)行柱層析時淋洗劑為乙酸乙 酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚體系，淋洗劑的配比為1 : 1-100。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，步驟二的具體過程如下將所述球形固相載體與硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑分散在乙醇中，加熱回流24小時，產(chǎn)物 經(jīng)乙醇洗滌后分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑修飾的球形固相載體。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，步驟三的具體過程如下將表面由硅烷化RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑修飾的球形固相載體分散在N，N- 二甲基甲酰胺中， 加入丙烯酸、自由的RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑、偶氮二異丁腈，在70°C反應(yīng)3小時，產(chǎn)物經(jīng)乙醇洗漆 后分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷；其中，所述自由的 RAFT 鏈轉(zhuǎn)移試劑為 C6H5CH2SCS2C2H5、C6H5CH2SCS2C3H7、C6H5CH2SCS2C4H9、c6h5ch2scs2c12h25 或 c6h5ch2scs2ch2c6h5。
7.如權(quán)利要求1-6任一項所述的方法制備得到的聚丙烯酸球刷。
8.如權(quán)利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用方法，其特征 在于，包括如下步驟步驟一，對聚丙烯酸球刷進(jìn)行活化；步驟二，將蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；步驟三，對步驟二形成的球刷與蛋白的復(fù)合物進(jìn)行洗滌、封閉與保存。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用方法，其特征在于，具體應(yīng)用過程如下步驟一，對聚丙烯酸球刷分散在緩沖液中，加入EDC和NHS，室溫下混合后得到活化后的聚丙烯酸球刷，用所述緩沖液洗滌三次；步驟二，將所述活化后的聚丙烯酸球刷與蛋白在所述緩沖液中混合，并在37°C下反應(yīng)2小時，得到球刷與蛋白的復(fù)合物；步驟三，用封閉液洗滌所述復(fù)合物；將復(fù)合物分散在所述封閉液中并在4°C下混合過夜；然后用保存液洗滌復(fù)合物，最終將復(fù)合物分散在所述保存液中；其中，所述緩沖液為IOmM的含有或不含有O. 05wt. %的吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖液，所述緩沖液的pH為7. 2 7. 6 ;所述封閉液為含有O. lwt. % BSA、0. 2wt. % BSA或O. 5wt. %甘氨酸的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖液；所述保存液為含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐溫-20的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚丙烯酸球刷的活性聚合制備方法及其應(yīng)用，尤其公開了一種通過活性聚合法制備聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用。本發(fā)明首先合成一種新的硅烷化RAFT聚合鏈轉(zhuǎn)移試劑，將該RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑通過一步反應(yīng)固定到球形固相載體表面后，再通過RAFT聚合法在接枝有該RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑的載體表面形成聚丙烯酸毛刷結(jié)構(gòu)，得到聚丙烯酸球刷。本發(fā)明的聚丙烯酸球刷材料經(jīng)過活化后，進(jìn)行蛋白固定得到球刷與蛋白的復(fù)合物，從而實現(xiàn)了在蛋白高密度固定化中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法大大縮短了聚丙烯酸球刷的合成步驟與時間，提高了反應(yīng)效率；并使得聚丙烯酸球刷具有較高的接枝密度和羧基含量，為蛋白固定化提供了更多的位點(diǎn)。
文檔編號C07K17/08GK102936321SQ201210438840
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者徐宏, 古宏晨, 瞿振元, 胡鳳麟 申請人:上海交通大學(xué)