一種精制長鏈二元酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種精制長鏈二元酸的方法，包括如下步驟：（1）將終止發(fā)酵液離心，回收上層未反應(yīng)的烷烴并分離水相發(fā)酵液和菌體；（2）向步驟1得到的菌體中加入濃度為4mg/L-400mg/L的堿液，堿液的加入量與菌體的體積比為1：1-3：1，混勻后進(jìn)行均質(zhì)過程破碎菌體，均質(zhì)結(jié)束后用膜過濾固液分離；（3）將步驟1得到的水相發(fā)酵液與步驟2經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為8.0-10.5；加入脫色劑脫色0.5-1.5h，過濾除去脫色劑；（4）用無機(jī)酸調(diào)節(jié)步驟（3）得到的混合液pH至1-4并加熱至80-95℃，恒溫一段時(shí)間后冷卻至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到長鏈二元酸產(chǎn)品。該方法操作過程簡單，制得的長鏈二元酸的純度及收率高。
【專利說明】一種精制長鏈二元酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分離【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種從正構(gòu)烷烴發(fā)酵液中精制長鏈二元酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長鏈二元酸是利用微生物發(fā)酵長鏈正構(gòu)烷烴而得到的代謝產(chǎn)物。微生物發(fā)酵長鏈正構(gòu)烷烴的發(fā)酵液是一復(fù)雜的多相體系，其中含有水、未反應(yīng)的烷烴和各種培養(yǎng)基組分，微生物細(xì)胞，自溶的細(xì)胞碎片及蛋白、色素、各種代謝產(chǎn)物，長鏈二元酸，還有油、水、細(xì)胞的乳化體。這種復(fù)雜的多相體系增加了提取二元酸的難度，影響到產(chǎn)品的純度和收率。
[0003]目前提取長鏈二元酸的方法一般分為溶劑法和水相法。雖然溶劑法可以解決上述問題，但由于溶劑法存在投資大，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，產(chǎn)品中殘留有溶劑和烷烴以及生產(chǎn)安全性和環(huán)境污染等問題，該方法的使用受到了很大限制。傳統(tǒng)的水相法雖然克服了溶劑法的缺陷，但是其產(chǎn)品純度和收率不能達(dá)到較高指標(biāo)。
[0004]CN1255483A公開了一種水相法分離二元酸的方法:將終止發(fā)酵液加熱除去未反應(yīng)的烷烴，再加硅藻過濾除菌；濾液經(jīng)調(diào)PH值得到酸餅和濾液；濾液又加活性炭脫色，然后過濾；又用脫色后的濾液溶解之前得到的酸餅，酸化；最后得到結(jié)晶，經(jīng)烘干得到二元酸產(chǎn)品。此方法操作步驟繁 瑣，操作成本高，而且二元酸產(chǎn)品收率太低，純度亦不高，烷烴回收率低。
[0005]CN1064951C公開了一種處理含有二元酸的發(fā)酵液方法:將終止發(fā)酵液直接加熱破乳，分離回收未反應(yīng)烷烴，再將發(fā)酵液酸化結(jié)晶，過濾二元酸和菌體，堿化溶解二元酸、菌體的濾餅，將PH值調(diào)至8-12，加入鹽析劑，加熱溶解，冷卻過濾二元酸鹽，再將二元酸鹽重新溶解水中，加熱40°C _60°C，降溫過濾，酸化結(jié)晶，過濾晶體并洗滌，干燥。該方法回收未反應(yīng)的烷烴后直接將發(fā)酵液酸化結(jié)晶，二元酸結(jié)晶顆粒小與菌體同時(shí)過濾，增加了過濾困難；另外該過程中需要加入鹽析劑，使操作更加繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種水相法精制長鏈二元酸的方法，該方法操作過程簡單，制得的長鏈二元酸的純度及收率高。
[0007]一種精制長鏈二元酸的方法，包括如下步驟:
(1)將終止發(fā)酵液離心，回收上層未反應(yīng)的烷烴并分離水相發(fā)酵液和菌體；
(2)向步驟I得到的菌體中加入濃度為4mg/L-400mg/L的堿液，堿液的加入量與菌體的體積比為1:1-3:1，混勻后進(jìn)行均質(zhì)過程破碎菌體，均質(zhì)結(jié)束后用膜過濾固液分離；
(3)將步驟I得到的水相發(fā)酵液與步驟2經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為8.0-10.5 ;加入脫色劑脫色0.5-1.5h，過濾除去脫色劑；
(4)用無機(jī)酸調(diào)節(jié)步驟(3)得到的混合液pH至1-4并加熱至80-95°C，恒溫一段時(shí)間后冷卻至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到長鏈二元酸產(chǎn)品。[0008]本發(fā)明方法步驟(1)中發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為5000-8000rpm/min,離心時(shí)間為 2-10min。離心后可靜置0.5h_2h再進(jìn)行回收烷烴及分離水相發(fā)酵液和菌體操作；也可以直接進(jìn)行回收烷烴及分離水相發(fā)酵液和菌體操作，優(yōu)選靜置后進(jìn)行回收烷烴及分離水相發(fā)酵液和菌體操作。
[0009]本發(fā)明方法步驟(2)中所述的堿液可以是NaOH、KOH水溶液。所述的均質(zhì)過程如下:菌體與堿液混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/6-1/2(以體積計(jì))，放入均質(zhì)器中，轉(zhuǎn)速 5000-8000rpm，均質(zhì)時(shí)間5_60s。所述的膜過濾可采用納濾膜或微濾膜等，可用的膜孔徑范圍為 10-3 u m-10 u m。
[0010]本發(fā)明方法步驟(3)中所述的脫色劑可以是活性炭或活性白土等，脫色劑加入量與混合液的比為0.5%-3% (m:v，質(zhì)量體積百分比)，脫色時(shí)間為0.5h-l.5h，脫色同時(shí)進(jìn)行攪拌，攪拌速度為140-350rpm/min。
[0011]本發(fā)明方法步驟(4)中所述的無機(jī)酸可以是硫酸、鹽酸或硼酸等，調(diào)節(jié)pH至2-3。 所述的恒溫時(shí)間為0.1-2h。恒溫結(jié)束后自然冷卻至室溫或者以5-10°C /h勻速降至室溫， 優(yōu)選后者。
[0012]本發(fā)明一種精制長鏈二元酸的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)采用離心的方法將發(fā)酵液直接破乳分離回收未反應(yīng)的烷烴，無需加熱，節(jié)約能耗的同時(shí)避免了發(fā)酵液加熱破乳時(shí)細(xì)胞破碎逸出的大量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)混合到發(fā)酵液中導(dǎo)致的后續(xù)處理困難、產(chǎn)品純度偏低；
(2)在堿性條件下對菌體進(jìn)行均質(zhì)處理，一方面堿液的加入能利用堿的皂化作用使菌體細(xì)胞壁溶解或部分溶解，細(xì)胞溶解的同時(shí)能夠提高均質(zhì)破碎的效果；另一方面均質(zhì)作用能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于堿溶液的滲透和胞內(nèi)產(chǎn)物的擴(kuò)散；堿液與均質(zhì)協(xié)同作用使菌體細(xì)胞的破碎更加徹底，存在于菌體細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物二元酸更好的分散到溶液中，從而為提聞二兀酸廣品的收率打下良好基礎(chǔ)；
(3)均質(zhì)過程僅針對發(fā)酵液中的菌體，大大減少了后續(xù)膜過濾的時(shí)間；通過對均質(zhì)條件的控制，使膜過濾除去細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時(shí)不宜堵塞膜，降低液體中雜質(zhì)含量，使后續(xù)處理脫除雜質(zhì)較容易；通過控制結(jié)晶的降溫速度，提高產(chǎn)品的結(jié)晶效果，提高產(chǎn)品的純度。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過實(shí)施例來進(jìn)一步對本發(fā)明方法予以說明。
[0014]實(shí)施例1
以正十二烷烴為底物，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)十二碳二元酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌濃為
12.9g/L，二元酸濃度為154.3 g/L，pH為8.0。取發(fā)酵液1000ml，將發(fā)酵液離心:5000rpm/ min,時(shí)間3min,尚心結(jié)束靜置30min?；厥丈蠈游捶磻?yīng)的燒烴,再將水相發(fā)酵液與菌體分開。向離心得到的菌體中加入100ml，40mg/L的NaOH溶液，菌體與氫氧化鈉溶液體積比為 1:1振蕩混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/2，轉(zhuǎn)速5000rpm，均質(zhì)時(shí)間20s。細(xì)胞均質(zhì)破碎后用膜孔徑為10—1 u m的微濾膜過濾，固液分離。將水相發(fā)酵液與經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為9 ;加入0.5% (m: V)的活性炭,脫色攪拌速度200rpm/min,脫色時(shí)間0.5h。之后過濾除去活性炭。液體用6M的硫酸調(diào)節(jié)pH至3并加熱至85°C，恒溫lh。以8°C /min勻速降至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到產(chǎn)品。產(chǎn)品純度及收率見表1。
[0015]實(shí)施例2
以正十二烷烴為底物，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)十二碳二元酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌濃為11.7g/L，二元酸濃度為155.3g/L, pH為7.9。取發(fā)酵液1000ml，將發(fā)酵液離心:8000rpm/min,時(shí)間5min,尚心結(jié)束靜置50min?；厥丈蠈游捶磻?yīng)的燒烴,再將水相發(fā)酵液與菌體分開。向離心得到的菌體中加入200ml，20mg/L的NaOH溶液，菌體與氫氧化鈉溶液體積比為1:2，振蕩混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/3，轉(zhuǎn)速6000rpm，均質(zhì)時(shí)間10s。細(xì)胞均質(zhì)破碎后用膜孔徑為10_2 Pm的納濾膜過濾，固液分離。將水相發(fā)酵液與經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為9.5 ;加入1.5% (m: V)的活性炭，脫色攪拌速度250rpm/min，脫色時(shí)間1.0h。之后過濾除去活性炭。液體用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH至3并加熱至90°C，恒溫0.5h。以10°C /h勻速降至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到產(chǎn)品。產(chǎn)品純度及收率見表1。
[0016]實(shí)施例3
以正十三烷烴為底物，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)十三碳二元酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌濃為11.9g/L，二元酸濃度為158.lg/L，pH為7.8。取發(fā)酵液1000ml，將發(fā)酵液離心:7000rpm/min,時(shí)間4min,尚心結(jié)束靜置60min?；厥丈蠈游捶磻?yīng)的燒烴,再將水相發(fā)酵液與菌體分開。向離心得到的菌體中加入300ml，10mg/L的KOH溶液，菌體與氫氧化鉀溶液體積比為1:3，振蕩混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/2轉(zhuǎn)速7000rpm，均質(zhì)時(shí)間40s。細(xì)胞均質(zhì)破碎后用膜孔徑為10_3 Pm的納濾膜過濾，固液分離。將水相發(fā)酵液與經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為10.5 ;加入3.0% (m: v)的活性白土,脫色攪拌速度350rpm/min,脫色時(shí)間1.0h。之后過濾除去活性白土。液體用6M的硼酸調(diào)節(jié)pH至2并加熱至80°C，恒溫lh。以5°C/h勻速降至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到產(chǎn)品。產(chǎn)品純度及收率見表1。
[0017]實(shí)施例4
以正十二烷烴為底物，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)十二碳二元酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌濃為12.7g/L，二元酸濃度為160.4g/L，pH為8.0。取發(fā)酵液1000ml，將發(fā)酵液離心:8000rpm/min,時(shí)間8min,尚心結(jié)束靜置120min?；厥丈蠈游捶磻?yīng)的燒烴,再將水相發(fā)酵液與菌體分開。向離心得到的菌體中加入150ml，40mg/L的NaOH溶液，菌體與氫氧化鈉溶液體積比為1:1.5，振蕩混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/6轉(zhuǎn)速8000rpm，均質(zhì)時(shí)間5s。細(xì)胞均質(zhì)破碎后用膜孔徑為2 u m的微濾膜過濾，固液分離。將水相發(fā)酵液與經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為10 ;加入2.0% (m: v)的活性白土,脫色攪拌速度300rpm/min,脫色時(shí)間0.5h。之后過濾除去活性白土。液體用6M的硫酸調(diào)節(jié)pH至2并加熱至95°C，恒溫1.5h。以6°C/h勻速降至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到產(chǎn)品。產(chǎn)品純度及收率見表1。
[0018]實(shí)施例5
以正十二烷烴為底物，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)十二碳二元酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌濃為13.6g/L，二元酸濃度為161.7g/L，pH為8.0。取發(fā)酵液1000ml，將發(fā)酵液離心:5000rpm/min,時(shí)間IOmin,尚心結(jié)束靜置70min?；厥丈蠈游捶磻?yīng)的燒烴,再將水相發(fā)酵液與菌體分開。向離心得到的菌體中加入250ml，20mg/L的NaOH溶液，菌體與氫氧化鈉溶液體積比為1:2.5，振蕩混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/4轉(zhuǎn)速5000rpm，均質(zhì)時(shí)間60s。細(xì)胞均質(zhì)破碎后用膜孔徑為10 Pm的微濾膜過濾，固液分離。將水相發(fā)酵液與經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH值為9.0 ;加入1.0% (m: v)的活性炭，脫色攪拌速度140rpm/min,脫色時(shí)間1.0h。之后過濾除去活性炭。液體用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2并加熱至87°C，恒溫
1.5h。以TC/h勻速降至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到產(chǎn)品。產(chǎn)品純度及收率見表1。
[0019]表 I
【權(quán)利要求】
1.一種精制長鏈二元酸的方法，其特征在于:包括如下步驟:(1)將終止發(fā)酵液離心，回收上層未反應(yīng)的烷烴并分離水相發(fā)酵液和菌體；(2)向步驟I得到的菌體中加入濃度為4mg/L-400mg/L的堿液，堿液的加入量與菌體的體積比為1:1-3:1，混勻后進(jìn)行均質(zhì)過程破碎菌體，均質(zhì)結(jié)束后用膜過濾固液分離；(3)將步驟I得到的水相發(fā)酵液與步驟2經(jīng)膜過濾得到的液體混合，并調(diào)整混合液pH 值為8.0-10.5 ;加入脫色劑脫色0.5-1.5h，過濾除去脫色劑；(4)用無機(jī)酸調(diào)節(jié)步驟(3)得到的混合液pH至1-4并加熱至80-95°C，恒溫一段時(shí)間后冷卻至室溫結(jié)晶，過濾得二元酸濾餅，水洗至中性，干燥濾餅即得到長鏈二元酸產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為 5000-8000rpm/min,離心時(shí)間為 2-lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:離心后靜置0.5h-2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的堿液為NaOH、KOH水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的均質(zhì)過程如下:菌體與堿液混合均勻后裝入樣品瓶中，裝液量1/6-1/2，放入均質(zhì)器中，轉(zhuǎn)速5000-8000rpm，均質(zhì)時(shí)間5-60S。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的膜過濾采用納濾膜或微濾膜等，膜孔徑范圍為10_3 ii m-10 ii m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所·述的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的脫色劑為活性炭或活性白土，脫色劑加入量與混合液的比為0.5%-3% (m: V)，脫色時(shí)間為0.5h-l.5h，脫色同時(shí)進(jìn)行攪拌，攪拌速度為140-350rpm/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的無機(jī)酸為硫酸、鹽酸或硼酸，調(diào)節(jié)混合液PH至2-3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中恒溫時(shí)間為0.1-2h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中恒溫結(jié)束后自然冷卻至室溫或者以5-10°C /h勻速降至室溫。
【文檔編號(hào)】C07C51/42GK103570525SQ201210257796
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】李曉姝, 高大成, 黎元生, 王領(lǐng)民, 師文靜, 張霖 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院