結(jié)合egfr家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體，包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽以及跨膜區(qū)，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽包含HERIN。本發(fā)明在維持T細(xì)胞殺傷特異性的前提下，提高了T細(xì)胞的增殖能力與殺傷作用。
【專利說明】結(jié)合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)合EGFR家族蛋白的嵌合抗原受體、其組合物及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤過繼細(xì)胞治療(adoptive cell therapy, ACT)是將經(jīng)處理的自體或異體免疫細(xì)胞(主要是自體細(xì)胞)回輸給腫瘤患者，以增強(qiáng)患者免疫功能，達(dá)到治療目的的方法。當(dāng)前腫瘤ACT進(jìn)展迅速,利用腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-1nfiltrating lymphocyte, TIL)開展的過繼免疫治療方案針對黑色素瘤取得了非常好的臨床效果(Science2002; 298:850-4)。然而，T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號的刺激，即兩種T細(xì)胞活化相關(guān)信號。其中，T細(xì)胞表面TCR-CD3復(fù)合體與抗原肽-MHC分子結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第一信號，決定T細(xì)胞的殺傷特異性；T細(xì)胞表面的共刺激分子(如CD28)與相應(yīng)配體(如Β7)結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第二信號，促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖與存活。但腫瘤細(xì)胞第一信號刺激源(如MHC分子)與第二信號配體(如Β7)等缺乏或表達(dá)下降，無法有效提供T細(xì)胞活化相關(guān)的信號，從而激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因而，需要對T細(xì)胞進(jìn)行基因改造。目前主要通過轉(zhuǎn)基因TCR(T cell receptor)及嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors, CAR)兩種方式來實(shí)現(xiàn)這種T細(xì)胞的基因改造(Blood 2010;116:103 5-44 ；Nat Rev Clin Oncol 2011;8:577-85)。
[0003]TCR改造具有比較大的限制性，①轉(zhuǎn)基因TCR鏈可能與病人的內(nèi)源性的TCR鏈發(fā)生錯(cuò)配，從而導(dǎo)致T細(xì)胞表面腫瘤反應(yīng)性的TCR密度減少；(D TCR識(shí)別MHC分子遞呈的抗原，但不同的病人MHC分子是不同的，所以必須分離對所有MHC單體型特異的TCR，可操作性低；
③大部分TCR不能識(shí)別糖類或糖脂類抗原，抗原選擇范圍較窄只提供T細(xì)胞活化相關(guān)的第一信號，沒有提供第二信號，療效不足。因而，嵌合抗原受體CAR受體受到更多的青睞。
[0004]嵌合抗原受體(CAR)由一個(gè)scFv單鏈抗體(由抗體VL區(qū)氨基酸序列和VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)Linker連接而成),通過鉸鏈結(jié)構(gòu)與源于TCR復(fù)合體或者IgE高親和受體的跨膜和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)連接構(gòu)成。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可通過非MHC限制性途徑與抗原反應(yīng)。此外，與常規(guī)的TCR只能針對的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，還包括糖類和糖脂類TAA,而這些抗原不像蛋白抗原那么容易突變(Curr Opin Immunol 2009;21:215-23 ；Blood2010;116:1035-44 ；Cancer Res2011;71:3175-81 ；J Cancer 2011;2:378-82)。
[0005]自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以來，其已經(jīng)歷了三個(gè)不同的發(fā)展階段。
[0006]第一代CAR，包含胞外特異識(shí)別腫瘤抗原的scFv片段，胞內(nèi)激活信號由⑶3 ζ或Fe ε RI y 的 ITAM (immunoreceptor tyros ine-based activation motifs)信號鏈來傳遞。但是第一代CAR受體缺乏T細(xì)胞的共刺激信號，導(dǎo)致T細(xì)胞只能發(fā)揮瞬間效應(yīng)，在體內(nèi)存在時(shí)間短、細(xì)胞因子分泌少。
[0007]第二代CAR在第一代CAR的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)共刺激信號分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，提供 T 細(xì)胞活化的兩種信號，包括如 CD28，CD134/0X40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase (LCK), inducible T-cell co-stimulator (ICOS)以及DNAX-activation protein 10 (DAPlO)等結(jié)構(gòu)域,增強(qiáng)了 T細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-Y以及GM-CSF增加，從而突破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、延長Al⑶(activation induced cell death, Al CD)。
[0008]第三代CAR，在第二代CAR的基礎(chǔ)上，增加了另外一種共刺激信號分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如在共刺激結(jié)構(gòu)⑶28和I TAM信號鏈的之間再融合一個(gè)二級共刺激分子如4-1BB，產(chǎn)生一個(gè)三重信號的CAR，第三代CAR改造的T細(xì)胞具有更好的效應(yīng)功能和體內(nèi)存活時(shí)間。
[0009]目前，美國已有29項(xiàng)CAR修飾的T細(xì)胞過繼治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)(Blood2010;116:1035-44 ；Nat Rev Clin Oncol 2011 ;8:577_85)?？梢钥吹剑谝淮鶦AR只提供T細(xì)胞活化的第一信號，第二代與第三代的CAR是將T細(xì)胞激活所需的兩個(gè)信號進(jìn)行了合并，將第二信號CD28或/和4-1BB細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)域直接連接到CD3z分子，從而繞過了腫瘤細(xì)胞通常第二信號如B7等缺乏所引起T細(xì)胞不能激活的障礙，第一信號與第二信號合并后，大大提高了對T細(xì)胞激活、增殖及殺傷能力，使之療效大幅度增加。但隨之給臨床治療帶來了一定風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榈诙c第三代CAR修飾后T細(xì)胞會(huì)針對某些少量表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的正常組織產(chǎn)生超強(qiáng)的反應(yīng)，呈“瀑布”式過量增加，造成對正常組織的過激免疫反應(yīng)。目前已有兩個(gè)注射CAR修飾后的T細(xì)胞而導(dǎo)致死亡的病例報(bào)道。其一例應(yīng)用第三代CAR(針對Her2)，患者由于急性肺水腫而死亡，其原因是CAR+的T細(xì)胞誤攻擊低表達(dá)Her2的肺上皮細(xì)胞(MolTher 2010; 18:843-51);另一例應(yīng)用第二代CAR (針對CD19)，死亡原因復(fù)雜，但伴隨著血液中細(xì)胞因子水平的增高(Hum Gene Ther 2010;21:1039-42 ；Mol Ther 2010;18:666-8)。
[0010]為解決這一安全性隱患，研究者將HSV-TK、A Fas、iCasp9、CD20_Rituximab等自殺系統(tǒng)引入T細(xì)胞的CAR修飾，發(fā)揮剎車作用，避免T細(xì)胞過量增殖(J Cancer2011;2:378-82 ；N Engl J Med 2011;365:1673-83)。然而，CAR+的 T 細(xì)胞脫靶引發(fā)的“瀑布”效應(yīng)速度非?？?，這些自 殺系統(tǒng)未必能及時(shí)發(fā)揮作用。另一種方法是減少CAR+的T細(xì)胞回輸數(shù)量，然而這種方案會(huì)使治療療效下降。
[0011 ] 因此，非常有必要對CAR自身的反應(yīng)體系進(jìn)行改造，提高CAR介導(dǎo)的腫瘤ACT的臨床安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種嵌合抗原受體。所述嵌合抗原受體能夠結(jié)合表皮生長因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)家族多個(gè)蛋白成員。具體地說，該嵌合抗原受體通過具有結(jié)合腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)的EGFR膜受體家族蛋白多個(gè)蛋白成員能力的多肽，來傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)信號。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用其傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)的第一信號，能修飾未經(jīng)抗原刺激活化的T細(xì)胞，特異殺傷EGFR家族蛋白過表達(dá)的細(xì)胞。用其傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)的第二信號，能與另一種識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的第一代嵌合抗體受體組成雙嵌合抗原受體系統(tǒng)，共修飾未經(jīng)抗原刺激活化的T細(xì)胞，或者單獨(dú)修飾經(jīng)腫瘤抗原活化的T細(xì)胞，在維持其殺傷特異性的前提下，提高了T細(xì)胞的增殖能力與殺傷作用。由此提供了下述發(fā)明:
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種嵌合抗原受體，包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽包含HERIN。
[0015]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其中，所述跨膜區(qū)選自CD28跨膜區(qū)、CD8跨膜區(qū)、⑶3 ζ跨膜區(qū)、⑶134跨膜區(qū)、⑶137跨膜區(qū)、ICOS跨膜區(qū)、和DAPlO跨膜區(qū)中的一種或多種。
[0016]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ζ和/或Fe ε RI Y。
[0017]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其中，所述共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段選自CD28、CD134/0X40、CD137/4_1BB、LCK、IC0S、和DAPlO胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的肽段中的一種
或多種。
[0018]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
[0019]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽還包含 MUCl scFv-VH 和 MUCl ScFv-VL0
[0020]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其還包含信號肽，并且所述信號肽選自SEQ ID NO:17 (信號肽I)或SEQ ID NO: 19所示的肽段(信號肽2)。
[0021]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其中，其各部分即高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段、以及可選的信號肽之間`通過linker連接,優(yōu)選地,所述linker選自SEQ ID NO:21(linkerl),SEQ ID NO:23 (linker2)、SEQ ID NO:25 (linker3)、SEQ ID NO:27 (linker4)、或 SEQ ID NO:29 (linker 5)所示的肽段。
[0022]不拘于理論的限制，本發(fā)明人通過選擇合適的信號肽和linker，增大了嵌合抗原受體的表達(dá)量，有利于得到空間構(gòu)象更佳的嵌合抗原受體，從而提高了嵌合抗原受體的活性。
[0023]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其氨基酸序列為或者包含選自SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45JPSEQID NO:49所示的氨基酸序列。
[0024]本發(fā)明的另一方面涉及一種核酸，其編碼本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體；具體地,所述核酸為或者包含SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50 所示的核苷酸序列。
[0025]本發(fā)明的再一方面一種重組載體，其包含本發(fā)明任一項(xiàng)所述的核酸；具體地，所述重組載體為重組真核表達(dá)載體或重組病毒載體；更具體地，所述重組真核表達(dá)載體為重組P⑶NA3.1 ( + )載體；所述重組病毒載體為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；進(jìn)一步具體地，所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為重組pMXs-1RES-GFP載體。
[0026]本發(fā)明的再一方面涉及一種重組細(xì)胞，其包含本發(fā)明任一項(xiàng)所述的重組載體；具體地，所述重組細(xì)胞為重組T細(xì)胞；更具體地,所述重組細(xì)胞為重組Jurkat E6.1細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明的再一方面涉及一種T細(xì)胞，其表達(dá)本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體。
[0028]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體遺傳修飾的T細(xì)胞；具體地,所述T細(xì)胞為Jurkat E6.1細(xì)胞；具體地,所述遺傳修飾為基因槍法、轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)、或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0029]本發(fā)明的再一方面涉及一種組合物，其包含一種或多種本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細(xì)胞或T細(xì)胞；可選地,其還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0030]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其為藥物組合物。
[0031]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其包含兩種嵌合抗原受體，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物由兩種嵌合抗原受體組成，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段。
[0032]本發(fā)明將第一信號與第二信號從單一 CAR中分開,構(gòu)建了雙信號獨(dú)立的兩種嵌合抗原受體，兩種CAR分別識(shí)別腫瘤細(xì)胞兩個(gè)不同家族的抗原，分別傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)的兩種信號，有效地避免了安全性問題。
[0033]上述的兩種嵌合抗原受體可以在同一個(gè)載體中表達(dá)，也可以在獨(dú)立的載體中分別表達(dá)。
[0034]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述跨膜區(qū)選自CD28跨膜區(qū)、CD8跨膜區(qū)、⑶3 (跨膜區(qū)、⑶134跨膜區(qū)、⑶137跨膜區(qū)、ICOS跨膜區(qū)、和DAPlO跨膜區(qū)中的一種或多種。`
[0035]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ^ 和 / 或 Fe e RI Y。
[0036]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段選自 CD28、CD134/0X40、CD137/4-1BB、LCK、ICOSjP DAPlO 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的肽段中的一種或多種。
[0037]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
[0038]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的組合物，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽還包含MUCl scFv-VH和 MUCl ScFv-VL0
[0039]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，其氨基酸序列獨(dú)立地為或者包含選自SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:4U SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:45 JPSEQ ID NO:49所示的氨基酸序列中的一種、兩種、或多種。
[0040]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細(xì)胞或T細(xì)胞在制備治療和/預(yù)防和/輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、皰疫病毒(Herpesvirus)、或巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)。
[0041]本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或核酸或重組載體或重組細(xì)胞或T細(xì)胞的步驟；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、抱疫病毒(Herpesvirus )、或巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus ) o
[0042]發(fā)明詳述
[0043]如上文所述，本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體。更具體地說，該嵌合抗原受體通過具有結(jié)合腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)的EGFR膜受體家族蛋白能力的多肽來傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)信號。
[0044]本發(fā)明中術(shù)語“嵌合抗原受體”(chimeric antigen receptors, CAR)是人工改造受體，能夠?qū)⒆R(shí)別腫瘤抗原的特異性分子(如抗體)錨定在免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞)上，使免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原和殺死腫瘤細(xì)胞。
[0045]本發(fā)明中術(shù)語“T細(xì)胞活化相關(guān)信號”是指與T細(xì)胞活化所需要兩個(gè)信號，即T細(xì)胞表面TCR-CD3復(fù)合體與抗原肽-MHC分子結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第一信號，決定T細(xì)胞的殺傷特異性；T細(xì)胞表面的共刺激分子(如CD28)與相應(yīng)配體(如B7)結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第二信號，促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖與存活。
[0046]本發(fā)明中術(shù)語“ 免疫受體酪氨酸活化基序”(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs, ITAM )是指免疫細(xì)胞活化相關(guān)受體(如BCR/Ig a/Ig旦，TCR/Q33、Fca R和FcRy等)胞漿區(qū)所共有的以酪氨酸殘基(tyrosine，Y)為基礎(chǔ)的氨基酸序列基序，其特征為:兩個(gè)酪氨酸殘基被大約13外其它氨酸殘基隔開(...YXX[L/V]X 7-1IYXX[L/V]...)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，被磷酸化后能夠與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的信號分子結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞的活化。
[0047]本發(fā)明中術(shù)語“共刺激信號分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫細(xì)胞表面的一些粘附分子，如⑶28、⑶134/0X40、⑶137/4-1BB、⑶40等，通過與其配體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞的第二信號，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌功能，延長活化免疫細(xì)胞的存活時(shí)間。
[0048]本發(fā)明中術(shù)語“單鏈抗體”(single-chainantibody variable regionfragment, scFv)是指由抗體VL區(qū)氨基酸序列和VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)Linker連接而成,具有結(jié)合抗原能力的抗體片段。
[0049]本發(fā)明中術(shù)語“EGFR”是指人類表皮生長因子受體(epidermal growth factorrec印tor)，又簡稱為 ERBBl 或 HER1，其家族成員包括 EGFR、ERBB2 (HER2)、ERBB 3 (HER 3)、ERBB4 (HER4)。
[0050]本發(fā)明中術(shù)語“Herin”或“HERIN”是指人類Her2的第8個(gè)內(nèi)含子中編碼Herstatin的C末端79個(gè)氨基酸的DNA序列。
[0051]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成嵌合抗原受體為HERIN、⑶28跨膜區(qū)、⑶3 ^信號鏈(G1-CARecfkX
[0052]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成嵌合抗原受體為HERIN、⑶28跨膜區(qū)、⑶28胞內(nèi)區(qū)、CD3(信號鏈(G2-CAREeFK)。
[0053]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成嵌合抗原受體為HERI N、⑶28跨膜區(qū)、⑶28胞內(nèi)區(qū)、4-1BB共刺激肽段、CD 3(信號鏈(G 3-CARegfe)0
[0054]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區(qū)、⑶28胞內(nèi)區(qū)(CAR2aEGFK)。
[0055]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區(qū)、4-1BB共刺激肽段(CAR2b_)。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成抗原嵌合受體為HERIN、⑶28跨膜區(qū)、⑶28胞內(nèi)區(qū)、4-1BB共刺激肽段(CAR2cegfk)。
[0057]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用CAR2cE(；FK與針對腫瘤相關(guān)抗原MUCl的第一代嵌合抗原受體CARl ?01 (由抗MUCl的ScFv、⑶8跨膜區(qū)、⑶3(信號鏈構(gòu)成)共同修飾未經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞株。
[0058]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用CAR2aEeFK或CAR2bEeFK修飾肝癌組織中分離培養(yǎng)的TIL細(xì)胞。
[0059]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用CARlffiia與CAR2cE(；FK修飾的T細(xì)胞體外殺傷A431腫瘤細(xì)胞。
[0060]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用CAR2aKFK或CAR2bKFK修飾后的TIL細(xì)胞體外殺傷SMMC-7721肝癌細(xì)胞。[0061]在本發(fā)明中，
[0062]術(shù)語“有效量”是指可在受試者中實(shí)現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。
[0063]本文所用的術(shù)語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。
[0064]術(shù)語“組合物”，其還可以是指藥物組合物，可用于在受試者中實(shí)現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥。
[0065]術(shù)語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明組合物以治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、猴、牛、馬等。
[0066]術(shù)語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關(guān)。
[0067]可改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實(shí)際劑量水平，以便得到能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。
[0068]發(fā)明的有益效果
[0069]與現(xiàn)有T細(xì)胞的CAR修飾方法相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0070]本發(fā)明將具有結(jié)合腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)如EGFR家族成員蛋白能力的多肽引入嵌合抗原受體，用其傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)的第一信號，能修飾未經(jīng)抗原刺激活化的T細(xì)胞，特異殺傷EGFR過表達(dá)的細(xì)胞。用其傳遞T細(xì)胞活化相關(guān)的第二信號，能與另一種識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的第一代嵌合抗體受體組成雙嵌合抗原受體系統(tǒng)，共修飾未經(jīng)抗原刺激活化的T細(xì)胞，在保證安全性(如實(shí)施實(shí)例6-8所示，相對于MUCl的第三代CAR,對MUCl低表達(dá)的細(xì)胞的非特異性殺傷明顯減弱)的前提下，提高T細(xì)胞的增殖能力與殺傷作用；或者用于修飾經(jīng)腫瘤抗原活化的T細(xì)胞，在維持其殺傷特異性的前提下，提高T細(xì)胞的增殖能力與殺傷作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0071]圖1:CAR的結(jié)構(gòu)模式圖。SP表不信號肽，SPl表不信號肽I, SP2表不信號肽2 ；L1- L5 分別表示 Linker 1-Linker 5; CD28TM 表示 CD28 跨膜區(qū)；CD28IR 表示 CD28 胞內(nèi)區(qū)；⑶28表示或包含⑶28跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)。
[0072]圖2:CARImuciCAR2egfe 的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖(簡稱 pcDNA 3.1-CARl: 2)。
[0073]圖3:A-B,經(jīng)EGFR家族特異性 CAR修飾的 Jurka t 細(xì)胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eCAK、JurkatG3^eCAE)接觸A431或MCF7腫瘤細(xì)胞后的增殖情況。
[0074]圖4:經(jīng) EGFR 家族特異性 CAR 修飾的 Jurkat 細(xì)胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2_eCAE,JurkatG3^eCAE)與A431或MCF7腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，INFr y的分泌量。
[0075]圖5:A-B,經(jīng)EGFR家族特異性 CAR修飾的 Jurka t 細(xì)胞(JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eCAK、JurkatG3^eCAE)對A431或MCF7腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
[0076]圖6:A-C,經(jīng)雙 CAR 修飾的 Jurkat 細(xì)胞(JurkatmGAKleGAK2)及 MUCl 特異性單 CAR 修飾的 Jurka t 細(xì)胞(JurkatmGAK1、JurkatG3_mGAK1)接觸 A431、MCF7、U_20S 腫瘤細(xì)胞后的增殖情況。
[0077]圖7:經(jīng)雙CAR修飾的Jurkat細(xì)胞(JurkatmGAKleGAK2)及MUCl特異性單CAR修飾的Jurka t 細(xì)胞(Jurka tmG AK1、JurkatG3-mGAK1)與 A431、MCF7、U_20S 腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，INFr y的分泌量。
[0078]圖8:A-C,經(jīng)雙 CAR 修飾的 Jurkat 細(xì)胞(JurkatmGAKleGAK2)及 MUCl 特異性單 CAR 修飾的 Jurkat 細(xì)胞(Jurka tmCAE\ JurkatG3_mCAE1)對 A431、MCF7、U-20S 腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
[0079]圖9:經(jīng)CAR修飾前后TI L細(xì)胞接觸SMMC-7721后的增殖情況。
[0080]圖10:經(jīng)CAR修飾前后TIL細(xì)胞對SMMC-7721的殺傷作用。
【具體實(shí)施方式】
[0081]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)、相應(yīng)的參考文獻(xiàn)、或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0082]實(shí)施例1 =CAR表達(dá)框的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建
[0083]根據(jù)構(gòu)成CAR各組分的氨基酸序列與編碼序列，拼接成整個(gè)融合的氨基酸序列與編碼DNA表達(dá)框，其中構(gòu)成CAR2aE(；FK及CAR2bKFK的肽段包括:
[0084]HERIN的氨基酸殘基序列為:
[0085]GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG(SEQ ID NO:1)。[0086]HERIN的編碼序列為:
[0087]GGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGC(SEQ ID NO:2)。
[0088]⑶28跨膜區(qū)(⑶28TM)氨基酸殘基序列為:
[0089]PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFffVRS(SEQ ID NO:3)。
[0090]⑶28跨膜區(qū)(⑶28TM)的編碼序列為:
[0091 ] CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGT(SEQ ID NO:4)。
[0092]⑶28胞內(nèi)區(qū)(⑶28IR)氨基酸殘基序列為:
[0093]KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:5)。
[0094]⑶28胞內(nèi)區(qū)(⑶28IR)的編碼序列為:
[0095]AAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:6)。
[0096]⑶28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)(⑶28)氨基酸殘基序列為:
[0097]PFWVLVVVGGVLAC`YSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:7)。
[0098]⑶28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)(⑶28)的編碼序列為:
[0099]CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:8)。
[0100]⑶3 (的氨基酸殘基序列為:
[0101 ] RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。
[0102]⑶3 4的編碼序列為:
[0103]AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:10)。
[0104]4-1BB共刺激信號域肽段(41BB)的氨基酸殘基序列為:
[0105]KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:11)。
[0106]4-1BB共刺激信號域肽段(41BB)的編碼序列為:
[0107]AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:12)。
[0108]MUCls cFv-VH (VHmuci)的氨基酸殘基序列為:EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)。[0109]MUCl scFv-VH (VHmuci)的編碼序列為:
[0110]GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:14)。
[0111]MUCl scFv-VL (VLmuci)的氨基酸殘基序列為:
[0112]DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLI⑶KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE(SEQ ID NO:15)。
[0113]MUCls cFv-VL ( VLmuci )的編碼序列為:
[0114]GATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAG(SEQ ID NO:16)。
[0115]信號肽I的氨基酸殘基序列為:
[0116]MEFffLSffVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO: 17)。
`[0117]信號肽I編碼序列為:
[0118]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:18)。
[0119]信號肽2的氨基酸殘基序列為:
[0120]MEAPAQLLFLLLLffLPDTTG(SEQ ID NO: 19)。
[0121]信號肽2編碼序列為:
[0122]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:20)。
[0123]Linkerl的氨基酸殘基序列為:
[0124]EPKSCDKTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:21)。
[0125]Linkerl的編碼序列為:
[0126]GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA(SEQ ID NO:22)。
[0127]Linker2的氨基酸殘基序列為:
[0128]GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。
[0129]Linker2的編碼序列為:
[0130]GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCG(SEQ ID NO:24)。
[0131]Linker3的氨基酸殘基序列為:
[0132]GGGGGGGGG (SEQ ID NO:25)。
[0133]Linker3的編碼序列為:
[0134]GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO:26)。
[0135]Linker4的氨基酸殘基序列為:[0136]GGSGSGGSGSGGSGS(SEQ ID NO:27)。
[0137]Linker4的編碼序列為:
[0138]GGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCT(SEQ ID NO:28)。
[0139]Linker5的氨基酸殘基序列為:
[0140]PKLEEGEFSEARVDIVLTQSP (SEQ ID NO:29)。
[0141]Linker5的編碼序列為:
[0142]CCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCA (SEQID NO:30)。
[0143]⑶8跨膜區(qū)肽段(⑶8TM)的氨基酸殘基序列為:
[0144]YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:31)。
[0145]⑶8跨膜區(qū)肽段(⑶8TM)的編碼序列為:
[0146]TACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:32)。
[0147]Furin_2A的氨基酸殘基序列為:
[0148]RAKRAPVKQTLNFDL LKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:33)。
[0149]Furin_2A的編碼序列為:
[0150]CGTGCTAAACGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC(SEQ ID NO:34)。
[0151]G1-CARegfk 依次由信號肽 1-HERIN-Linkerl-CD28TM-Linker2-CD3 4 融合構(gòu)成(見圖1)，其氨基酸序列為:
[0152]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:35)。
[0153]G1-CARkfk的編碼序列為:
[0154]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:36)。
[0155]G2-CARegfk 依次由信號肽 1-HERIN-Linkerl-CD28TM-CD28IR—Linker2-CD3 ^ 融合構(gòu)成(見圖1)，其氨基酸序列為:
[0156]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:37)。
[0157]G2-CAREeFK的編碼序列為:
[0158]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:38)。
[0159]G3-CARegfe 依次由信號肽-HERIN-Linkerl-CD28TM-CD28IR—Linker2-4-lBB-Linker3-CD3 (融合構(gòu)成(見圖1):
[0160]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGSGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGGGGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:39)。
[0161]G3-CAREeFR的編碼序列為:
[0162]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:40)。
[0163]CAR2aEGFE依次由信號肽1_HERIN-Linker2-CD28融合構(gòu)成(見圖1)，其氨基酸序列為:
[0164]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:41)。
[0165]CAR2aEGFE的編碼序列為:
[0166]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:42)。
[0167]CAR2bEGFE 依次由信號肽 1_HERIN-Linker2-CD28TM-Linker3-41BB 融合構(gòu)成(見圖1)，其氨基酸序列為:
[0168]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:43)。
[0169]CAR2bEGFK的編 碼序列為:
[0170]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:44)。
[0171]CAR2cEeFK 依次由信號肽 1-HERIN-Linker2-CD28-Linker3-41BB 融合構(gòu)成(見圖 1)，其氨基酸序列為:
[0172]MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:45)。
[0173]CAR2cEGFK的編碼序列為:
[0174]ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:46)。
[0175]CARImuci 依次由信號肽 S-VHffiic1-LinkeM-VLffiic1-Linkerl-CDSTM-LinkerS-CDS ζ 融合構(gòu)成(見圖1)，其氨基酸序列為:
[0176]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:47)。
[0177]CARImuci的編碼序列為:[0178]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:48)。
[0179]CAR1muc1CAR2egfe 由 CARImuci 與 CAR2cE(；FK 經(jīng) Furin_2A 連接構(gòu)成，其氨基酸序列為:
[0180]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFffVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:49)。
[0181]CAR1muc1CAR2egfe 的編碼序列為:
[0182]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCGTGCTAAACG`AGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:50)。
[0183]對照G S-CkRwci 依次由信號肽 Z-VH^a-LinkeM-VLj^-Linkerl-a^S-Linkerfl1BB-Linker5-CD3 ζ融合構(gòu)成(見圖1 )，其氨基酸序列為:[0184]MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLI⑶KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:51)。
[0185]GS-CARmuci的編碼序列為:[0186]ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQID NO:52)。
[0187]分別按G1-CARkfk 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:36)、G2-CARegfe 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:38)、G3-CAR腿的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:40)，CAR2aEGFE 的 DNA 編碼序列(SEQ ID 勵(lì):42)、0么1?21^(^的0嫩編碼序列(SEQ ID NO:44)、CAR2cEeFK 的 DNA 編碼序列(SEQID NO:46) XARImuci 的 DNA 編碼序列(SEQ ID NO:48),CARImuciCAR2EGFE 的編碼序列(SEQ IDNO:50)、G3-CAR?cl的編碼序列(SEQ ID NO:52)，委托生工⑧生物工程(上海)有限公司合成其整個(gè)表達(dá)框，插入PCDNA3.1 ( + )載體(Invitrogen) EcoR1-XbaI位點(diǎn)(見圖2)，轉(zhuǎn)化到E.coli (DH5 a )，經(jīng)測序正確后,使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒,獲得各重組表達(dá)載體的聞品質(zhì)質(zhì)粒。[0188]實(shí)施例2:T細(xì)朐株的遺傳修飾
[0189]將實(shí)施例1中構(gòu)建并純化獲得的各重組表達(dá)載體的高品質(zhì)質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)分別轉(zhuǎn)染至Jurkat Ε6.1 (Τ淋巴細(xì)胞株，購自美國典型物保藏中心，ATCC)。2天后，將轉(zhuǎn)染后的Jurkat Ε6.1細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有新霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，并通過有限稀釋法將細(xì)胞克隆化。經(jīng)21天的篩選，分別建立具有新霉素抗性、經(jīng) G1-CARegfk、G2-CARegfe, G3-CAR腿、CARImuci, CAR1muc1CAR2egfe, G3-CAR腿遺傳修飾的Jurkat Ε6.I 細(xì)胞株 Jurkat G1_eGAK、Jurkat G2_eGAK、JurkatG3_eGAK、JurkatmGAK1、JurkatmGAKleGAK2 及JurkatG3‘AK。
_0] 實(shí)施例3:經(jīng)EGFR家族特異性CAR遺傳修飾后T細(xì)胞株增殖情況測定[0191 ]將 JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eGAK、Jurkat~eGAK 以及未修飾的 JurkatE6.1 細(xì)胞(5 X IO5/孔，RPMI 1640培養(yǎng)基，含20U/ml IL-2)，分別加入預(yù)鋪經(jīng)放射處理的A431、MCF7細(xì)胞(均購自ATCC)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天，對懸浮的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，接觸EGFR陽性的A431細(xì)胞后，JurkatG2_e?、JurkatG3^eCAE均能大量增殖，而JurkatG1_e?基本不增殖；接觸EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細(xì)胞后，JurkatG1^eCAE,JurkatG2_eCAE, JurkatG3_eCAE 均基本不增殖(見圖 3A-B)。
[0192]實(shí)施例4 ?經(jīng)EGFR家族特異件CAR遺傳修飾后T細(xì)朐株IFN Y分泌量測定
[0193]將JurkatG1-eGAK、JurkatG2-eGAK、Jurkat~eGAK 以及未修飾的 JurkatE6.1 細(xì)胞(5 X IO5/孔)在24孔板中與A431、MCF7細(xì)胞(均購自ATCC，IX IO5/孔)共培養(yǎng)，72小時(shí)后收集上清，通過IFNy的ELI SA檢測試劑盒(BD Biosciences)檢測IFNy的分泌量。結(jié)果表明，與EGFR陽性的A431細(xì)胞共培養(yǎng)后，JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK能大量分泌IFN Y，分泌量高于 JurkatG1_eGAK ;與 EGF R 家族蛋白弱陽性的 MCF7 細(xì)胞共培養(yǎng)后，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eCAE均基本不分泌 IFN Y。
[0194]實(shí)施例5:經(jīng)EGFR家族特異性CAR遺傳修飾后T細(xì)胞株的體外殺傷作用測定
[0195]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1)，將^ JurkatG1_eCAE, JurkatG2_eCAE,JurkatG3^eCAE以及未修飾的Jurkat E6.1細(xì)胞與A431、MCF7共培養(yǎng)，應(yīng)用LDH乳酸脫氫酶-細(xì)胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit, Biovision)檢測不同方法遺傳修飾后的Jurkat E6.1細(xì)胞對不同類型腫瘤細(xì)胞的體外殺傷能力。方法如下:靶細(xì)胞鋪96孔板(5 X IO3/孔)，設(shè)培養(yǎng)基背景、體積校正、靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放、靶細(xì)胞最大LDH釋放、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放對照孔，治療組孔，每組重復(fù)3孔，每個(gè)孔的終體積相同且不少于100 μ L0250g離心4min，在37°C，5%C02孵育至少4h。在離心前45min，向靶細(xì)胞最大釋放孔加入IOX裂解液，體積校正孔加入等量的裂解液。再次離心，從每孔轉(zhuǎn)移50 μ L上清至新的96孔板中，再加入50 μ L底物溶液，室溫避光孵育30min。每孔加入50 μ L終止液，Ih內(nèi)測定D490。細(xì)胞毒性(％)=[ (D實(shí)驗(yàn)孔-D培養(yǎng)基背景孔)-(D效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔-D培養(yǎng)基背景孔)-(D靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔-D培養(yǎng)基背景孔)]/[ (D靶細(xì)胞最大LDH釋放孔-D體積校正孔)-(D靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔-D培養(yǎng)基背景孔)]X 100%。
[0196]結(jié)果表明，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK均能有效殺傷 EGFR 陽性的A431腫瘤細(xì)胞，殺傷作用JurkatG1-eGAK〈JurkatG2-eGAK〈JurkatG3-eGAK對EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7 的殺傷作用，JurkatG1_eGAK、JurkatG2_eGAK、JurkatG3_eGAK 與未經(jīng)修飾的 Jurkat 細(xì)胞相似，基本不殺傷(見圖5A-B)。[0197]實(shí)施例6:經(jīng)雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細(xì)朐株增葙情況測定
[0198]將JurkatmCAK1、JurkatmCAEleCAE2, JurkatG3_mCAE 以及未修飾的 JurkatE6.1 細(xì)胞(5X IO5/孔，RPMI 1640培養(yǎng)基，含20U/ml IL-2)，分別加入預(yù)鋪經(jīng)放射處理的A431 (人表皮癌細(xì)胞)、MCF7 (人乳腺癌細(xì)胞)、U-20S (人骨肉瘤細(xì)胞)(購自ATCC)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天,對懸浮的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，接觸MUCl與EGFR雙陽性的A431細(xì)胞后，JurkatmGAKleGAK2能大量增殖，增殖倍數(shù)高于JurkatG3_mGAK ;接觸MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細(xì)胞后，Jurkatm_eGAK2的增殖倍數(shù)與JurkatmGAK1相似，略低于JurkatG3_mGAK ;接觸MUCl弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細(xì)胞后，JurkatmGAKleGAK2基本不增殖，而JurkatG3_mGAK仍能增殖(見圖6A-C)。
[0199]實(shí)施例7:經(jīng)雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細(xì)朐株IFN Y分泌量測定
[0200]將JurkatmGAK1、JurkatmCAEleCAE2> JurkatG3_mCAE 以及未修飾的 JurkatE6.1 細(xì)胞(5X IO5/孔)在24孔板中與A431、MCF7、U-20S (均購自ATCC, IXlO5/孔)共培養(yǎng)，72小時(shí)后收集上清，通過IFNy的ELISA檢測試劑盒(BD Biosciences)檢測IFNy的分泌量。結(jié)果表明，與MUCl與EGFR雙陽性的A431細(xì)胞共培養(yǎng)后，JurkatmCAEleCAE2能大量分泌I FN Y，分泌量高于JurkatG3_mGAK ;與MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7細(xì)胞共培養(yǎng)后，JurkatmCAEleCAE2 的 IFNy 分泌量與 JurkatmCAE1 相似，低于 JurkatG3_mCAE ;與 MUCl 弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細(xì)胞共培養(yǎng)后，JurkatmCAEleCAE2基本不分泌IFN Y，而JUrkatG3_mGAK仍能分泌較多的IFNy (見圖7)。
[0201]實(shí)施例8:經(jīng)雙CAR修飾及MUCl特異件單CAR修飾的T細(xì)朐株的體外殺傷作用測定
[0202]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1)，將 JurkatmCAE1、JurkatmCAEleCAE2、JurkatG3_mCAK以及未修飾的Jurkat E6.1細(xì)胞與A431、MCF7、U-20S共培養(yǎng)，應(yīng)用LDH乳酸脫氫酶-細(xì)胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit, Biovision)檢測不同方法遺傳修飾后的Jurkat E6.1細(xì)胞對不同類型腫瘤細(xì)胞的體外殺傷能力，方法同實(shí)施例5。
[0203]結(jié)果表明，JurkatmGAKleGAK2能有效殺傷MUCl與EGFR雙陽性的A431腫瘤細(xì)胞；對MUCl高陽性而EGFR家族蛋白弱陽性的MCF7的殺傷作用與JurkatmGAK1相似，低于JurkatG3_mCAE ;對MUCl弱陽性、EGFR弱陽性的U-20S細(xì)胞基本不殺傷(見圖8A-C)。
[0204]實(shí)施例9:肝癌組織來源TIL的分離培養(yǎng)
[0205]收集新切除的肝癌標(biāo)本，立即在無菌條件下進(jìn)行處理。具體方法如下:去除肝癌標(biāo)本周圍的正常組織和壞死區(qū)域，從標(biāo)本的不同區(qū)域取下大小為l_2mm3的小組織塊，24孔板的每一孔放置一塊。每孔加2mL完全培養(yǎng)基(含10%FBS的GT-T551培養(yǎng)基)和3000 IU/mL的IL-2。將24孔板置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)起始后的第5_6天為所有孔進(jìn)行半量換液。之后，根據(jù)TIL生長情況，每隔1-2天進(jìn)行一次半量換液。一旦孔內(nèi)TIL長滿，且所有貼壁細(xì)胞已除去，就將各個(gè)長滿孔內(nèi)的TIL收集起來。
[0206]隨后，I X IO6TIL重懸于含150mL完全培養(yǎng)基、30ng/mL抗CD3抗體、不少于200倍于TIL的照射過的飼養(yǎng)細(xì)胞(來自3個(gè)不同健康人的PBMC)和6000IU/mL IL-2的T175培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶豎直培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天，瓶內(nèi)65%液體換為新的完全培養(yǎng)基和IL-2。培養(yǎng)至第7天，2個(gè)T175培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，加入300mL完全培養(yǎng)基和IL-2。從第6天開始，每隔I天進(jìn)行一次臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，通過加入新的完全培養(yǎng)基和IL-2控制細(xì)胞密度至0.5-2X106/mL。擴(kuò)增的第14天，收集細(xì)胞。
[0207]實(shí)施例10:TIL的遺傳修飾
[0208]將CAR2aEeFK的編碼序列(SEQ ID NO:42)、CAR2b_ 的編碼序列(SEQ ID NO:44)插入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體pMXs-1RES-GFP (購自Cell BioLabs) EcoR1-XhoI位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化到E.coli (DH5 α )，經(jīng)測序正確后，使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒。于175_cm2fIasks 中培養(yǎng)包裝細(xì)胞 Amphotropic(購自 Cell BioLabs,細(xì)胞數(shù)約為 1-2X107),利用Lipofec tamine 2000 (Invitrogen)將純化后的高品質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到中。3天后，收集含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基，以4000g離心lOmin，收集上清液，并用0.45 μ m濾器過濾，濾過的液體置于40mL超速離心管中，4°C，25000r/min離心20分鐘，使用500ul冰PBS液重懸病毒沉淀，分別獲得攜帶CAR2aEeFK、CAR2bE(；FK表達(dá)框的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。隨后，分兩次(每次100 μ L)將病毒懸液與2 X IO6的TIL細(xì)胞共培養(yǎng)，分別收集感染后的TIL細(xì)胞TIL?2a與
TIL麵。
[0209]實(shí)施例11:遺傳修飾后TIL細(xì)胞的增殖情況測定
[0210]將TIL獅、TILCAE2b以及未修飾的TIL細(xì)胞(5X IO5/孔，GT-T551培養(yǎng)基基，含3000U/ml IL-2)，分別加入預(yù)鋪經(jīng)放射處理的SMMC-7721 (購自上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)的6孔板(5X IO5/孔)中，分別在第3天、第7天，對懸浮的TIL細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，修飾后的TILeAK2a接觸SMMC-7721細(xì)胞后能大量增殖，而未修飾的TIL細(xì)胞則基本不增殖(見圖9)。
[0211]實(shí)施例12:遺傳修飾后TIL細(xì)胞的體外殺傷作用測定
[0212]按不同的效靶比(50:1，25:1，5:1，1:1 )，將TILCAE2\TILCAE2b以及未修飾的TIL細(xì)胞與SMMC-7721共培養(yǎng)，應(yīng)用 LDH乳酸脫氫酶-細(xì)胞毒性檢測分析試劑盒(LDH-CytotoxicityAssay Kit,Biovision)檢測遺傳修飾前后的TIL細(xì)胞對SMMC-7721細(xì)胞的體外殺傷能力，方法同實(shí)施例5。結(jié)果表明，經(jīng)遺傳修飾的TILeAK2a能有效殺傷SMMC-7721腫瘤細(xì)胞，殺傷作用顯著高于未經(jīng)修飾的TI L細(xì)胞(見圖10)。
[0213]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1.一種嵌合抗原受體，包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段和/或共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽包含ffiRIN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述跨膜區(qū)為CD28跨膜區(qū)、CD8跨膜區(qū)、⑶3 (跨膜區(qū)、⑶134跨膜區(qū)、⑶137跨膜區(qū)、ICOS跨膜區(qū)、和DAPlO跨膜區(qū)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述免疫受體酪氨酸活化基序肽段為CD3 ^ 和 / 或 Fe e RI Y。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段選自CD28、CD134/0X40、CD137/4_1BB、LCK、IC0S、和DAPlO胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的肽段中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽為單拷貝或多拷貝；具體地，為雙拷貝。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，所述高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽還包含MUCl scFv-VH 和 MUCl ScFv-VL0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其氨基酸序列為或者包含選自SEQID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45JPSEQ IDNO:49所示的氨基酸序列。
8.—種核酸，其編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體；具體地，所述核酸為或者包含 SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50`所示的核苷酸序列。
9.一種重組載體，其包含權(quán)利要求8所述的核酸；具體地，所述重組載體為重組真核表達(dá)載體或重組病毒載體；更具體地，所述重組真核表達(dá)載體為重組PCDNA3.1 ( + )載體；所述重組病毒載體為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體；進(jìn)一步具體地，所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為重組pMXs-1RES-GFP載體。
10.一種重組細(xì)胞，其包含權(quán)利要求9所述的重組載體；具體地，所述重組細(xì)胞為重組T細(xì)胞；更具體地，所述重組細(xì)胞為重組JurkatE6.1細(xì)胞。
11.一種T細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求1 一 7中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體。
12.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的重組載體遺傳修飾的T細(xì)胞；具體地,所述T細(xì)胞為Jurkat E6.1細(xì)胞；具體地，所述遺傳修飾為基因槍法、轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)、或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
13.—種組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的重組載體或權(quán)利要求10所述的重組細(xì)胞或權(quán)利要求11或12所述的T細(xì)胞；可選地，其還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其包含兩種嵌合抗原受體，其中，一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及免疫受體酪氨酸活化基序肽段，另一種嵌合抗原受體包含高效結(jié)合EGFR家族蛋白的多肽、跨膜區(qū)、以及共刺激信號分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域肽段。
15.權(quán)利要求1至I中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體或權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的重組載體或權(quán)利要求10所述的重組細(xì)胞或權(quán)利要求11或12所述的T細(xì)胞在制備治療和/預(yù)防和/輔助治療惡性腫瘤或病毒感染性疾病的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤為肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胰腺癌、或前列腺癌；具體地，所述病毒為艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、皰疫病毒(Herpesvirus)、或巨細(xì)胞病毒(cytomegalovir us )。
【文檔編號】C07K19/00GK103483453SQ201210191472
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月12日
【發(fā)明者】錢其軍, 金華君, 丁娜, 俞德超, 李林芳, 吳孟超 申請人:上海吳孟超醫(yī)學(xué)科技基金會(huì), 上海白澤生物科技有限公司