專利名稱：一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白tat-gh及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因生物工程技術領域，具體涉及一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白，還涉及一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白的制備方法，還涉及一種表達口服重組蛋白的大腸桿菌基因工程菌株，同時還涉及一種口服重組蛋白在促進黃鱔生長中的應用。
背景技術：
黃鱔(Monopterus albus),俗稱鱔魚、田鰻和長魚等,它是一種淡水硬骨魚類，廣泛分布于中國、印度、馬來西亞和印度尼西亞，已在中國中南部開展大面積的養(yǎng)殖。中國目前的養(yǎng)殖總產(chǎn)量已經(jīng)達到18萬噸，由于其生長快，成活率高以及對網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件的適應性好，它被當作中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的首選品種之一。鱔肉質(zhì)細嫩，鮮美可口，營養(yǎng)價值高，具有滋補 強身和藥用功能，是人們喜愛的滋補水產(chǎn)品，深受中國消費者的青睞。為了繁榮市場，豐富人民生活，發(fā)展池塘養(yǎng)殖已變得日益迫切，對黃鱔的生物學特性、生長變化規(guī)律等方面的研究已成為重要的課題。近年來其水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展很快。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中高效餌料的研制是增產(chǎn)增收的基本途徑。如何提高餌料轉(zhuǎn)化率，縮短養(yǎng)殖周期，降低生產(chǎn)成本，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖品的產(chǎn)量和質(zhì)量被越來越多的科研工作者和養(yǎng)殖戶所關注。魚類生長激素是由魚的腦垂體前葉細胞合成分泌的一種單鏈多肽，具有提高餌料轉(zhuǎn)化率、促進魚類生長發(fā)育、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和脂肪代謝等多種生理功能。GH的作用途徑有兩種，一種是誘導肝細胞、肌細胞產(chǎn)生IGFs等生長介導素(somatomedins),再經(jīng)IGF間接起作用，另一種是GH激活JAK2 (Janus Kinase)，JAK2及GHR (生長激素受體)磷酸化，并同磷酸化的受體一起將GH信號向下游傳遞。無論哪一種方式GH都需要首先同細胞表面的特異性受體即GHR結(jié)合，再由受體介導，激發(fā)一系列生化反應并最終產(chǎn)生生物效應。魚類GH的作用的發(fā)生，主要是通過IGFs的間接方式。IGFs屬于胰島素家族成員，包括IGF-I和IGF-II兩個亞型，合成部位主要在肝臟，其合成和分泌主要由GH控制，生長激素能誘導肝臟中IGF-I和IGF-II的合成。反過來，IGF對GH的合成和分泌有抑制作用。魚類的生長和其它脊椎動物一樣，是通過腦神經(jīng)內(nèi)分泌-GH-IGF軸來實現(xiàn)的。但正常魚體內(nèi)的生長激素含量甚微，每升魚血僅含20 yg。生長激素直接投喂給魚苗，可以促進魚體的生長，表明生長激素多肽可以活性成分的形式進入魚體。研究發(fā)現(xiàn)，魚類小腸上皮細胞可以通過胞飲作用吸收大分子并轉(zhuǎn)移進入血液循環(huán)。同時許多研究已經(jīng)證實，用基因工程方法獲得的生長激素具有代償內(nèi)源生長激素的功能，肌肉注射外源生長激素，可促進魚體生長；餌料中添加的重組生長激素可通過魚體消化道后腸上皮細胞的胞飲作用吸收，提高魚體的生長速度，并且在魚體內(nèi)半衰期一般在6h以內(nèi)，在12 24h之后，基本檢測不到。Atia等(1999)將外源表達的金頭鰓生長激素蛋白經(jīng)口投喂魚苗38天，生長率比對照組提高55飛5%。而經(jīng)注射重組GH 90天后，生長率也比對照魚提高了 29 33%。同樣，白俊杰等(1998)將鮭魚生長激素通過PCR技術改造后，克隆到大腸桿菌中獲得表達，重組蛋白為可溶性，占細胞總蛋白的10%。鮭魚重組蛋白經(jīng)純化、復性后，同飼料一起投喂羅非魚，產(chǎn)生了明顯的促生長作用。2001年王偉等人工合成了草魚GH基因，在大腸桿菌中的表達量占到細胞總蛋白量的40%。2003年Li等在畢赤酵母中用AOX基因啟動子表達鯉魚生長激素，其表達量為300-400mg/L0羅非魚經(jīng)注射重組鯉魚GH 5周后，實驗魚的增長率比對照提高53. 1%。1998年陳丹等也在畢赤酵母中用AOX基因啟動子構(gòu)建了鱸魚生長激素表達載體，經(jīng)甲醇誘導后，成功表達了鱸魚生長激素。2003年陳榮忠等則將表達鱸魚GH基因的重組酵母菌制成干粉，摻入到飼料中進行促生長試驗，發(fā)現(xiàn)重組酵母能明顯促進大黃魚、卵形鰓、花尾胡椒鰓等魚種的生長。因此，用基因工程方法獲得廉價的重組魚生長激素具有產(chǎn)量高、成本低的優(yōu)點，適宜大量制備，將其應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是增收節(jié)支的有效途徑。TAT是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的高效運輸載體-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)(proteintransduction domains, pTDs)或稱細胞穿膜妝(cell penetrating peptides, CPP)。TAT能穿透細胞膜、細胞核膜，攜帶肽、蛋白質(zhì)和DNA分子等進入胞質(zhì)和胞核發(fā)揮生物效應，具有高效性、無須耗能或通過受體轉(zhuǎn)運的特點，為提高靶細胞在體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)移效率和蛋白質(zhì)表達提供了一個高效、簡便的方法。Tat蛋白是一個小型蛋白，其分子大小依HIV-I病毒的品系不同而有所差異，從86到130個氨基酸殘基不等，由兩個外顯子編碼。一般以86個氨基酸的Tat蛋白作為研究對象，分析其結(jié)構(gòu)與功能。根據(jù)氨基酸的組成，Tat序列可被 分為幾個不同的區(qū)N末端激活區(qū)(I 19位氨基酸)、半胱氨酸富集區(qū)(20 31位氨基酸)、中心區(qū)(32 47位氨基酸)、堿性氨基酸富集區(qū)(48 57位氨基酸)及谷胺酰胺富集區(qū)(60 76位氨基酸)。半胱氨酸富集區(qū)對維持Tat的功能是必需的，可介導體外金屬連接的二聚物的形成。堿性氨基酸富集區(qū)含有核定位序列，且在病毒Tat蛋白序列中具有高度保守性。中心區(qū)、堿性氨基酸富集區(qū)及谷胺酰胺富集區(qū)均與RNA結(jié)合相關。TAT分子中的富含堿性氨基酸、具有較多正電荷的多肽片段與跨膜轉(zhuǎn)導有關。Schwarze等確定具有蛋白轉(zhuǎn)導功能的最小肽段是47-57，由11個氨基酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR，該段等電點12. 7，為堿性多肽，轉(zhuǎn)導速度快，效率高。該結(jié)構(gòu)域已被證明能以一種快速高效的方式將外源融合蛋白轉(zhuǎn)導到真核細胞內(nèi)，這種方式不依賴細胞膜，轉(zhuǎn)運子，但其詳細機制目前還不是很清楚。自Nagahara等報道構(gòu)建了一個可通用的原核表達載體(pTAT_HA)之后，有關TAT介導的蛋白質(zhì)功能的研究報道急劇增加，如丁勁等利用該載體在大腸桿菌中成功地表達了 TAT2乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白。并且，其研究的方法學也趨于成熟。目前的體內(nèi)及體外試驗顯示HIV-TAT，可以穿過包括神經(jīng)元細胞在內(nèi)的所有組織細胞，且未觀察到明顯毒副作用。TAT可以將與之相連的多肽或全長蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導進入細胞，而且在體內(nèi)可以通過血液循環(huán)運輸至腦組織，跨越血腦屏障進入神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞內(nèi)。自PTD被識別并鑒定以來，數(shù)百種化合物和蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)導進入不同的細胞或者跨越血腦屏障入腦，并表現(xiàn)出了相應的生物活性，而且已將多種變性的蛋白質(zhì)如半乳糖苷酶轉(zhuǎn)導進入小鼠體內(nèi)并恢復了生物活性，被帶入細胞的分子基本上保留了它們各自原有的性質(zhì)，在細胞內(nèi)會各顯其能，各盡其責，這些特性使得這種技術特別具有吸引力。本發(fā)明將一種蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域多肽(TAT)和黃鱔生長激素成熟肽(簡稱GH)構(gòu)建成融合蛋白，通過黃鱔口服之后能有效發(fā)揮其生物學活性，促進黃鱔生長，為制備TAT介導的口服蛋白制劑提供了理論依據(jù)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供了一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白，其序列為SEQ IDNO. 2所示。本發(fā)明將TAT穿膜肽與GH蛋白融合表達，得到具有生物活性的TAT-GH蛋白，利用TAT的穿膜功能將GH蛋白穿過腸壁細胞進入血液發(fā)揮其生物學功能。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白的制備方法，該方法可應用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達量大，操作簡單，成本低。本發(fā)明的目的另一個目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株大腸桿菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-maGH, F_ompThsdSB(rB_mB0 gal dcm(DE3)；CCTCCNO :M2012147。該菌株可以表達蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域多肽(TAT)和黃鱔生長激素成熟肽(GH)基因工程融合蛋白TAT-GH。其優(yōu)點是表達量大，部分可溶，表達的包涵體蛋白復性容易，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，安全性好。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種黃鱔生長激素基因工程融合蛋白在促進黃鱔生長中的應用。通過口服方式，TAT-GH蛋白穿過腸壁細胞進入血液發(fā)揮其生物學功能，產(chǎn)生了明顯的促進黃鱔生長的效應。 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白的制備方法，其步驟為I 黃鱔GH基因的制備根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的GH(GeneBank AY265351. I)的序列人工合成黃鱔GH基因(由上海Generay公司合成)，并設計PCR引物進行基因擴增。2.融合基因TAT-GH的制備通過PCR重疊延伸技術分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黃鱔GH基因為模板，通過搭橋的方法在GH序列的前端加上TAT序列，得到TAT-GH片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I 所示。3.融合基因的制備及表達載體的構(gòu)建用EcoR I 和 BamH I 雙酶切 TAT-GHPCR 片段和質(zhì)粒 pET_32a ( + )(購自 Novagen公司)，目的片段TAT-GH和開環(huán)pET-32a ( + )膠回收后4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(購自Novagen公司)感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，參照《分子克隆實驗指南》進行，DNA產(chǎn)量在IOOng和5 ii g之間，依質(zhì)粒的拷貝數(shù)而定。對提取的質(zhì)粒進行酶切鑒定，得到的陽性克隆命名為pET-32a ( + ) -TAT-GH。4.大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET_32a ( + ) -TAT-GH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Novagen公司)感受態(tài)細胞。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達TAT-GH 的重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3) pET_32a_TAT - GH，申請人已于2012年4月26日將該菌送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCCNO:M 2012147，分類命名大腸桿菌 BL21 (DE3) pET-32a-TAT_maGH，F(xiàn)^ompThsdSe (rB_mB0 gal dcm(DE3), Escherichia coli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_maGH,F ompThsdSg (rB mB) gal dcm (DE3)。通過上述方法獲得了一種大腸桿菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-GH，它屬于革蘭氏陰性桿菌，無芽胞。最適生長溫度為37°C，菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色。該菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好，能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。所述的大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a_TAT_GH 能夠表達 TAT-GH融合蛋白，該蛋白的基因為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。5.基因工程融合蛋白TAT-GH的誘導表達重組基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET_32a-TAT_GH 的單菌落接種于含氨芐青霉素(終濃度為IOOii g/ml)的20ml LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床中，300rpm振搖過夜培養(yǎng)10 12h。按I :100的比例接種到20ml新鮮的LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫、300rpm培養(yǎng)3h左右，至OD6tltl約0. 6^0. 8，加入誘導劑IPTG至終濃度為0. 6mM,于37°C恒溫、300rpm誘導表達 5h。離心 12000g, 4°C, IOmin 收集菌體，用 20ml 的 Lysis Buffer重懸菌體進行超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。進一步擴大培養(yǎng)，超聲波破碎后，12000g，4°C離心，20min收集沉淀。
6.基因工程融合蛋白TAT-GH的純化收集濕菌體后，加入20ml細胞lysis buffer重懸菌體沉淀,于_20°C反復凍融3次，再進行超聲波破碎(400W，工作3s，間歇3s)，菌液破碎至清亮。將破碎后的菌液于4°C離心，12000rmp、20min，分別收集上清和菌體沉淀。用2M尿素洗滌菌體沉淀，重復2次，再用水洗漆I次。加入適量20ml包涵體lysis buffer, 4°C裂解過夜,4°C離心，12000rpm> IOmin,棄去沉淀，將上清液稀釋于IOOml蛋白復性液中，4°C、復性24h。將復性液用0. 45 y m濾膜過濾，裝入處理過的透析袋中(在IOmM NaHCO3^lmM EDTA的溶液中煮沸l(wèi)Omin)，透析袋兩端用夾子夾好，將其放入透析液中，4°C、透析12 24h。期間需更換一次或兩次透析液，以便完全除去尿素。經(jīng)PEG20000濃縮后，4°C離心，12000rpm、10min，上清即為復性好的重組蛋白。用SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果。即得到純化的TAT-GH蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2。Ni-NTA Superflow柱親和層析法進一步純化重組蛋白，其步驟如下(I)用移液器吸取Iml Ni-NTA Agarose裝入層析柱底部，用10倍柱體積的雙蒸水洗滌柱子。(2)用10倍柱體積的Lysis Buffer平衡鎳柱。(3)將復性好的蛋白溶液經(jīng)0. 45 ii m的濾膜過濾后，用蠕動泵以lml/min的速率，加入到平衡好的鎳柱子中，使蛋白前端的6-His與Ni2+充分結(jié)合。(4)依次用適量的含 2OmM Imidazole>40mM Imidazole>60mM Imidazole、80mMImidazole的Wash Buffer以lml/min的速率洗脫柱子，以洗脫下Ni2+柱上結(jié)合不牢固的或少量未與Ni2+結(jié)合的非目的蛋白。用核酸蛋白檢測儀檢測每次洗脫后的流出液的OD■，待OD28tl持續(xù)為0時停止洗滌。(5)用含 250mM Imidazole 的 Elution Buffer 以 200 u 1/min 的速率洗脫柱子，用Eppendorf管收集目的蛋白。取收集的蛋白進行12%SDS_PAGE檢測純化效果。(6)進行SDS-PAGE電泳，檢測所收集的蛋白的純化效果。一種黃鱔生長激素基因工程融合蛋白在促進黃鱔生長中的應用，其應用過程是A. ELISA-RA法檢測基因工程融合蛋白TAT-GH的生物活性取新鮮處死的黃鱔肝臟剪碎，加5倍于肝重的膜受體緩沖液，4°C反復勻漿。4°C高速離心，15000rpm>30min,取上清。4°C超速離心，100000rpm>60min,棄上清，收集沉淀，以10mg/ml重懸于0. 05M Na2CO3-NaHCO3緩沖液。用該緩沖液以1:50稀釋受體膜，使終濃度為200ii g/ml，添加到酶標板中，每孔100iU，4°C包被過夜。用5%BSA封閉96孔酶標板，每孔添加100 u 1，37°C封閉2h。甩干封閉液，每孔用300 u L PBST緩沖液振蕩洗滌5min，重復三次。每孔加入IOOiU梯度稀釋的蛋白溶液，每個濃度3個平行，37°C孵育2h。甩干封閉液，每孔用300 u L PBST緩沖液振蕩洗滌5min，重復三次。每孔加入100 U I稀釋400倍的GH抗體溶液，37°C孵育2h。甩干封閉液，每孔用300 u L PBST緩沖液振蕩洗滌5min，重復三次。每孔加入100 ill稀釋10000倍的HRP標記的羊抗兔IgG，37°C孵育2h。甩干封閉液，每孔用300 u L PBST緩沖液振蕩洗滌5min，重復三次。每孔加入100 U I OPD顯色液，37°C避光反應10-20min。每孔加入50 U I終止液，終止顯色。用Bio_Rad450全自動酶標儀檢測每孔在490nm波長下的吸光值。B.基因工程融合蛋白TAT-GH的促生長實驗挑選健康鮮活且大小相近的黃鱔分成3組，每組20尾，平均20g/尾。飼養(yǎng)在同一 室內(nèi)同樣規(guī)格的塑料箱中，水溫控制在22 25°C，24h通氧，飼喂時間為20天。實驗組I 口頭灌喂100 y g的GH純化蛋白，實驗組2 口頭灌喂100 ii g的TAT-GH純化蛋白，對照組口頭灌喂等量的生理鹽水。每天下午5 00投喂餌料，投喂量以喂飽為度，而后清走殘留餌料。每天觀察黃鱔生長狀況并換水。稱重前一天停止喂食，比較實驗前和實驗結(jié)束時黃鱔體重及體長的變化，分析是否有顯著的差別。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下特點(I)本發(fā)明所涉及的融合蛋白TAT-GH表達量大，為部分可溶蛋白，包涵體蛋白也容易復性，便于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，操作工藝簡單；(2)本發(fā)明利用大腸桿菌表達TAT蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域和黃鱔GH的融合蛋白，意在采用口服方式到達促進黃鱔生長的目的。蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域多肽TAT目前還沒有直接應用于養(yǎng)殖業(yè)，但其獨特的穿膜效率十分具有吸引力。本發(fā)明公開的基因工程菌株制備的TAT-GH重組蛋白，TAT可以攜帶GH蛋白不經(jīng)口服而直接進入血液中，可以應用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)，使其具有實際操作的可行性。


圖I為一種重組表達質(zhì)粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的構(gòu)建過程示意圖。圖2A為一種重組表達質(zhì)粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的PCR示意圖。通過PCR重疊延伸技術分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黃鱔GH基因為模板，通過搭橋的方法在GH序列的前端加上TAT序列。圖2B為一種重組表達質(zhì)粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的酶切鑒定示意圖。從LB (Amp+)平板上挑取白色的單菌落進行擴大培養(yǎng)，對菌液進行小量提取質(zhì)粒進行BamH I/EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定陽性重組子。M DL2000泳道I :PET32a-TAT_GH BamH I/EcoR I 雙酶切泳道2 PET32a-TAT-GH 質(zhì)粒圖3為一種重組蛋白TAT-GH經(jīng)IPTG誘導表達示意圖。
M :蛋白 Maker泳道I :IPTG 誘導前 BL21/PET_32a 空載泳道2 IPTG 誘導前 BL21/PET-32a_GH泳道3 IPTG 誘導前 BL21/PET-32a_TGH泳道4 =IPTG誘導后破碎上清BL21/PET_32a空載泳道5 =IPTG誘導后破碎上清BL21/PET-32a_GH泳道6 =IPTG 誘導后破碎上清 BL21/PET-32a_TGH泳道7 =IPTG誘導后破碎沉淀BL21/PET_32a空載
泳道8 =IPTG誘導后破碎沉淀BL21/PET-32a_GH泳道9 =IPTG 誘導后破碎沉淀 BL21/PET-32a_TGH泳道10 =IPTG誘導后破碎全菌體BL21/PET_32a空載泳道11 =IPTG誘導后破碎全菌體BL21/PET-32a_GH泳道12 =IPTG誘導后破碎全菌體BL21/PET-32a_TGHM :蛋白 Maker圖4為一種魚肝膜受體與TAT-GH結(jié)合曲線示意圖。ELISA-RA檢測表明，黃鱔肝膜受體和TAT-GH重組蛋白能夠發(fā)生特異性結(jié)合。當肝膜受體濃度一定時，隨著黃鱔生長激素濃度的提高，光密度值會相應升高；當以加熱失活的黃鱔生長激素和肝膜受體結(jié)合時，光密度值有顯著下降；當黃鱔生長激素和肝膜受體同時失活時，光密度值進一步降低。當黃鱔生長激素濃度一定時，隨著肝膜受體濃度的降低，光密度值會相應下降。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及具體實施例子對本發(fā)明作進一步說明。在實施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學操作方法為本領域技術人員所熟知。本實驗所涉及的分子生物學方法為常規(guī)方法，為本領域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。實施例I :黃鱔GH基因的制備人工合成黃鱔GH基因根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的GH (GeneBank AY265351. I)的序列人工合成黃鱔GH基因，并設計PCR引物。GH的上游引物Pl :5’-GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’ (劃線處為 BamH I 位點)，即為 SEQ ID NO. 3，GH 的下游引物 P2 :5，_GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3 (劃線處為 EcoR I 位點)，即為 SEQ ID NO. 4。以人工合成的黃鱔GH基因為模板，PCR擴增目的基因GH。GH基因的PCR反應條件為①94°C 2分鐘，②(94°C 30秒一560C 40秒一68°C 40秒)共32個循環(huán)，③68°C 5分鐘。將反應后的產(chǎn)物貯于_20°C備用。PCR反應體系
權利要求
1.一種分離重組的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.一種分離重組的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達權利要求2所述融合蛋白的基因工程菌株，其特征在干大腸桿菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-maGH, ompT hsdSB (rBmB)gal dcm (DE3)；CCTCC NO M2012147o
4.一種權利要求2所述融合蛋白的制備方法，其步驟為 黃鱔GH基因的制備根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的GH的序列GeneBank AY265351. I人工合成黃鱔GH基因，并設計PCR引物，以人工合成的黃鱔GH基因為模板，PCR擴增目的基因GH;GH 的上游引物 Pl :5’ -GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’ ；GH 的下游引物 P2 :5’ - GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG -3’ ； TAT-GH融合基因的制備通過PCR的方法擴增蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域多肽TAT，并將其與GH基因融合，其具體步驟是 以人工合成的黃鱔GH基因為模板，上游引物 P3: 5 ’ -CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGACAAAGTCGTCC-3，； 下游引物 P4: 5’ -GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ .劃線處為 EcoR I 位點，退火溫度為55°C，PCR擴增目的片段，電泳并作回收； 以上一歩回收產(chǎn)物為模板，上游引物 P5: 5 ’ -CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3，；下游引物 P4: 5’ -GCCGAAITCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ ； 退火溫度55°C做PCR，電泳并作回收； 以上一歩回收產(chǎn)物為模板， 上游引物 P6: 5’ -GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’ ,劃線處為 BamH I 位點，下游引物 P4: 5’ -GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ ,劃線處為 EcoR I 位點，退火溫度55°C，PCR擴增目的基因TAT-GH ； PCR反應條件為①94°C 2分鐘，②94°C 30秒一56°C 40秒一68°C 40秒，共32個循環(huán)，③68°C 5分鐘，將反應后的產(chǎn)物貯于-20°C備用； 融合基因表達載體的構(gòu)建首先雙酶切TAT-GH融合基因和質(zhì)粒pET-32a ( + )，膠回收含TAT-GH基因的片段和開環(huán)pET-32a( + )片段，22°C連接兩小時后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)萬.coh'中，所得到的陽性克隆子是TAT-GH融合基因的大腸桿菌，該質(zhì)粒命名為pET-32a ( + )_TAT_GH ； D.大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET-32a(+ )-TAT-GH轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL2KDE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠表達TAT-GH的大腸桿菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制備將步驟D中獲得的基因工程菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG誘導，融合蛋白TAT-GH以包涵體的形式高效表達。
5.權利要求2所述的融合蛋白在促進黃鱔生長中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白TAT-GH及制備方法和應用。一種促進黃鱔生長的口服重組蛋白的制備方法，其步驟是A、根據(jù)已知序列人工合成黃鱔GH基因；B、通過PCR的方法擴增蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域多肽TAT，并將其與GH基因融合；C、雙酶切TAT-GH融合基因和質(zhì)粒，膠回收含TAT-GH基因的片段和開環(huán)片段，得到TAT-GH質(zhì)粒；D、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE3)中，所得陽性克隆即為目的菌株。E、分離純化目的菌株表達的蛋白。純化后的TAT-GH重組蛋白經(jīng)口服方式能有效促進黃鱔生長，為制備TAT介導的口服重組蛋白制劑提供了依據(jù)。
文檔編號C07K19/00GK102766645SQ201210190098
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者周莉, 孟小林, 徐進平, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司