專(zhuān)利名稱(chēng)：利用豬股骨制備降血壓肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備降血壓肽的方法，具體涉及一種利用豬股骨制備降血壓肽的方法。
背景技術(shù)：
高血壓病是一種常見(jiàn)的多發(fā)病，據(jù)推測(cè)目前世界四分之一的成年人患有高血壓， 這一數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)到2025年會(huì)增加到30%。全球約有760萬(wàn)人由于高血壓病早逝，約占全率 13. 5% ;由高血壓引起的卒中和缺血性心臟病分別達(dá)54%和47%。高血壓病已成為一個(gè)十分嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。天然食品中的降血壓肽通常是由蛋白質(zhì)水解酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得的一類(lèi)多肽，具有降壓效果且無(wú)副作用。許多動(dòng)物、植物、微生物蛋白及發(fā)酵食品中都含有豐富的降血壓肽，目前已成功地從牛奶、魚(yú)、貝、雞蛋、大豆、清酒和酒柏、 玉米、麥胚等食物中分離出了各種不同的ACE抑制肽。
我國(guó)是一個(gè)畜牧業(yè)大國(guó)，在肉類(lèi)生產(chǎn)中，每年產(chǎn)生近2000萬(wàn)噸的各類(lèi)畜禽骨，絕大多數(shù)的畜禽骨沒(méi)有得到充分利用。這不僅浪費(fèi)了寶貴的蛋白質(zhì)資源，而且對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。目前，對(duì)骨的開(kāi)發(fā)利用多集中在對(duì)骨鈣研究，而骨蛋白質(zhì)多集中于調(diào)味品和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化方面的研究開(kāi)發(fā)，而功能性方面的深入研究報(bào)道較少。利用現(xiàn)代高新技術(shù)開(kāi)發(fā)高附加值的降壓產(chǎn)品，進(jìn)一步提高副產(chǎn)物的利用率，對(duì)副產(chǎn)制品的工業(yè)化和生態(tài)環(huán)境保護(hù)都具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次以豬股骨為原料制備降血壓肽，并突破性的發(fā)現(xiàn)豬股骨不同部位對(duì)血壓影響不同，豬骨股干和全股骨膠原多肽在體內(nèi)沒(méi)有顯著降壓效果而豬股骨頭則是降血壓肽的良好來(lái)源。本研究以取材容易的豬股骨為原料，提供了一種簡(jiǎn)單、易行的降血壓肽制備方法，制備出的降血壓·肽與多種食源性材料制備的降血壓產(chǎn)品對(duì)比，豬股骨頭膠原蛋白降血壓肽的灌胃量更小，降壓效果也略?xún)?yōu)，且具有更好的長(zhǎng)期降壓效果。同時(shí)本研究以NO、 PGI2、Ang IKET-1以及TXA2為指標(biāo)，綜合全面的探索了豬股骨頭膠原多肽的降血壓途徑， 發(fā)現(xiàn)，該肽除了能通過(guò)抑制ACE活性降低血漿Ang II濃度，還可通過(guò)促進(jìn)NOS活性顯著升高血漿中NO含量，同時(shí)抑制ECE活性降低血漿ET-1含量，三種途徑共同作用，達(dá)到降低血壓效果。解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題。
為解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種利用豬股骨制備降血壓肽的方法，包括以下步驟
步驟1，將新鮮豬股骨頭進(jìn)行碎骨、脫脂、浸酸、浸灰和中和淌干備用；
步驟2，將步驟I中處理好的備用骨料用濃度O. 5%的H2O2按料液比1:5在常溫下浸泡24h后，用濃度為O. 5%的H2O2在100°C、pH值8. O條件下處理7小時(shí)提取膠原蛋白；
步驟3，再采用胰蛋白酶在溫度50°C、pH值7. 5、底物濃度6%、酶底比8000u/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6小時(shí)；
步驟4，用超濾分級(jí)的方法分離純化_解液中__血^駄，取超濾離心后分子量小牙的駄段冷凍++++卜燥k:1制得O
更進(jìn)一步的是
所述的步驟I包括如下步驟
步驟1-1，剔除新鮮豬股骨中的包括殘肉、皮、筋腱的非骨骼成分，將骨破碎成5 IOmm左右的小塊，用水清洗去除部分脂肪和血紅蛋白；
步驟1-2，在石油醚中浸泡24h，以脫去殘余的脂肪；
步驟1-3，按料液比1:4加入4%的鹽酸浸泡3天，每12h換一次鹽酸，且新舊酸各半，待灰分含量降至O. 3%左右；
步驟1-4，置于O. 1%的Ca(OH)2中進(jìn)行浸泡5天左右，除去雜蛋白；
步驟1-5，用大量水清洗Ca(OH)2及其他雜質(zhì)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)骨料的pH值至7，使積存在骨料里的Ca(OH)2生成可溶性的鈣鹽，再用清水沖洗，除掉鹽酸與石灰相互作用生成的氯化鈣和余酸，淌干備用。
所述的步驟4具體包括如下步驟
步驟4-1先將步驟3中獲得的酶解產(chǎn)物過(guò)濾；
步驟4-2,再經(jīng)過(guò)8000r/min離心,取上清，以除去部分沉淀；
步驟4-3，取15mL上清液加入膜截留量為IOkDa的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行15分鐘超濾離心，收集的分子量小于IOkDa的濾液15mL加入5kDa膜截留量的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行60分鐘超濾離心，收集的濾液為分子量小于 5kDa的肽段組分；步驟4-4，將分子量小于5kDa的組分冷凍干燥后制得肽段粉末，凍藏備用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、本技術(shù)以豬股骨作為原料制備降血壓肽，取材容易、方法簡(jiǎn)便，為豬股骨的開(kāi)發(fā)利用提供一條新的途徑，同時(shí)，為研制高血壓的防治藥物提供一種安全無(wú)副作用的原料。
2、本研究突破性的發(fā)現(xiàn)豬股骨不同部位對(duì)血壓影響不同，確定了豬股骨頭是降血壓肽的最佳來(lái)源。
3、本研究以N0、PGI2、Ang II, ET-1以及TXA2為指標(biāo)，綜合全面的探索了豬股骨頭膠原多肽的降血壓途徑，發(fā)現(xiàn)該肽能同時(shí)影響N0、Ang II和ET-1三種內(nèi)皮血壓調(diào)節(jié)因子，達(dá)到降低血壓效果。優(yōu)于其他通過(guò)單一途徑降血壓的食源性降血壓肽。
圖1為本發(fā)明利用豬股骨制備降血壓肽的方法線性擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為本發(fā)明一標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖3為本發(fā)明一半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為本發(fā)明另一半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為本發(fā)明又一半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為本發(fā)明再一半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為本發(fā)明另一標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8為本發(fā)明又一標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9為本發(fā)明再一標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖10為本發(fā)明以ECE-1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖11為本發(fā)明以TXB2標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，0D值為橫坐標(biāo)(普通坐標(biāo))， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖12為本發(fā)明以TXAS標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(普通坐標(biāo))， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的制備方法所涉及的研究進(jìn)行詳細(xì)闡述。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1研究所需要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
自發(fā)性高血壓大鼠雌性。
1.1. 2原料與試劑
新鮮豬股骨頭；胰蛋白酶(Trypsin 1:250)美國(guó)Amresco公司；卡托普利 (Captopril)汕頭金石制藥廠。
1. 2儀器與設(shè)備
BP-98A智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)日本sof tron公司；BR4i型多功能冷凍離心機(jī)美國(guó) Thermo公司；UV_2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Unico公司；P0WERDRY PL 3000凍干機(jī)美國(guó)Thermo公司；超濾離心管(膜截留分子量5000Da、IOOOODa)美國(guó)Millipore公司； 數(shù)顯恒溫水浴鍋中國(guó)金壇市富華儀器有限公司；BT-12S電子天平德國(guó)Sartorius公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋中國(guó)金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)中國(guó)方舟科技公司；海爾臥式冷藏冰柜中國(guó)青島海爾集團(tuán)。
1. 3 方法
1. 3.1豬股骨頭膠原多肽制備
包括以下步驟
步驟1，剔除新鮮豬股骨中的殘肉、皮、筋腱等非骨骼成分，將骨破碎成5 IOmm左右的小塊，用水清洗去除部分脂肪和血紅蛋白。在石油醚中浸泡24h，以脫去殘余的脂肪。 料按料液比1:4(W/V)加入4%的鹽酸浸泡3天，每12h換一次鹽酸，且新舊酸各半，待灰分含量降至O. 3%左右。置于O. 1%的Ca(OH)2中進(jìn)行浸泡5天左右，除去雜蛋白。用大量水清洗Ca (OH) 2及其他雜質(zhì)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)骨料的pH至7，使積存在骨料里的Ca (OH) 2生成可溶性的鈣鹽，再用清水沖洗，除掉鹽酸與石灰相互作用生成的氯化鈣和余酸，淌干備用。
步驟2，將處理好的骨料用濃度O. 5%的H2O2按料液比1:5在常溫下浸泡24h后， 用濃度O. 5%的H2O2在100°C、pH值8. O條件下處理7小時(shí)提取膠原蛋白；
步驟3，再采用胰蛋白酶在溫度50°C、pH值7. 5、底物濃度6%、酶底比8000u/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6小時(shí)；
步驟4，先將水解產(chǎn)物過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)8000r/min離心，取上清，以除去部分沉淀。取 15mL上清液加入膜截留量為IOkDa的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行15分鐘超濾離心，收集的分子量小于IOkDa的濾液15mL加入5kDa膜截留量的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行60分鐘超濾離心，，收集的濾液即為分子量小于5kDa的肽段組分。將分子量小于5kDa的組分冷凍干燥后制得肽段粉末，凍藏備用。
1.3.2單次灌胃實(shí)驗(yàn)研究
1. 3. 2.1豬股骨不同部位膠原多肽對(duì)SHR單次灌胃試驗(yàn)
將SHR大鼠適Mm喂棄--Mln, Sttl分俎為陰性對(duì)照組(NO, W性對(duì)照0UPO, 3種樣品各分成低(L)、屮(M)、■性對(duì)照ilb'in蒸餾水Wl性對(duì)!！托+Ii利M:濁液，劑- Αλι lOmg/kg.1g:實(shí)驗(yàn)組分別灌 豬股1 Γ-、股竹頭和全股竹膠灌W最為低劑m組20mg/kg.1g，中劑懾組40mg/kg.1g，高劑最組60mg/kg.1g。測(cè)
SHR尾動(dòng)脈收縮壓，灌胃后8h內(nèi)每2h測(cè)定SHR尾動(dòng)脈收縮壓。
1. 3. 2. 2不同劑量的豬股骨頭膠原多肽對(duì)SHR單次灌胃試驗(yàn)
將SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后，隨機(jī)分為8組，每組8只陰性對(duì)照組(NC)灌胃蒸餾水；A, B, C，D，E試驗(yàn)組，分別按30. 0,40. 0,50. 0,60. 0,70. Omg/kg.1g劑量灌胃豬股骨頭膠原多肽(用蒸餾水溶解)；陽(yáng)性對(duì)照組(PC)灌胃10mg/kg.1g卡托普利懸濁液。
灌胃前用尾動(dòng)脈血壓測(cè)量器測(cè)定每只SHR尾動(dòng)脈血壓，然后空腹灌胃相應(yīng)劑量溶液，灌胃后每2h分別測(cè)定各組大鼠SHR尾動(dòng)脈血壓。選取降壓效果較好的3個(gè)劑量組作為連續(xù)灌胃的實(shí)驗(yàn)組。
1. 3. 3連續(xù)灌胃實(shí)驗(yàn)
1.3. 3.1 灌胃實(shí)驗(yàn)
SHR隨機(jī)分為5組，每組8只陰性對(duì)照組(NC):灌胃蒸餾水，劑量為lmL/kg.1g ； 實(shí)驗(yàn)組灌胃豬股骨頭膠原多肽，分為低(L)、中(M)、高(H)三組，灌胃量分別為低劑量組 30mg/kg.1g,中劑量組50mg/kg.1g,高劑量組70mg/kg.1g ;陽(yáng)性對(duì)照組(PC)灌胃卡托普利懸濁液，灌胃量為10mg/kg.1g。同時(shí)設(shè)正常大鼠對(duì)照組SD大鼠8只，灌胃股骨頭膠原蛋白降血壓肽，灌胃量為70mg/kg.1g，其余處理均與SHR相同。每天同一時(shí)間空腹灌胃相應(yīng)劑量溶液，連續(xù)灌胃40天，每5天測(cè)定各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。
1. 3. 3. 2血漿標(biāo)本采集及稀釋
SHR連續(xù)灌胃40天，末次灌胃后、處死前14h禁食，自由飲水。以肝素鈉為抗凝劑， 采用摘眼球取血法采集血衆(zhòng)樣本，采集后30min內(nèi)于4°C、1000Xg離心15min,取上清液分裝于2mL離心管中,數(shù)小時(shí)之內(nèi)使用，或于-20 0C儲(chǔ)存,避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后進(jìn)行檢測(cè)。
將血漿稀釋至一定倍數(shù)，以確保樣品(稀釋液)濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。
1. 3. 3. 3連續(xù)灌胃對(duì)SHR內(nèi)皮血壓調(diào)節(jié)因子的影響
用試劑盒檢測(cè)各組血漿樣本中五種內(nèi)皮血壓調(diào)節(jié)因子NO、PGI2, ET-U TXB2及 Ang II的血漿濃度，并檢測(cè)五種因子各自的前體物質(zhì)L-Arg、PGH2、大ET-l、PGH2、Ang I以及合成酶NOS、PGIS、ECE-1、TXAS、ACE的血漿濃度，嚴(yán)格按照各自試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。
1. 4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
采用EXCEL做圖，SPSS17. O軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。SHR尾動(dòng)脈血壓及內(nèi)皮血壓調(diào)節(jié)因子含量用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(I 土S)表示，組間數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，采用雙尾檢驗(yàn)，P < O. 05時(shí)顯著，P < O. 01時(shí)極顯著。
2結(jié)果與分析
2.1豬股骨不同部位膠原多肽對(duì)SHR單次灌胃試驗(yàn)
豬股骨不同部位膠原多肽對(duì)SHR單次灌胃對(duì)SHR收縮壓的影響結(jié)果如表I所示。
權(quán)利要求
1.一種利用豬股骨制備降血壓肽的方法，其特征在于包括以下步驟步驟1，將新鮮豬股骨頭進(jìn)行碎骨、脫脂、浸酸、浸灰和中和淌干備用；步驟2，將步驟I中處理好的備用骨料用濃度O. 5%的H202按料液比1:5在常溫下浸泡24小時(shí)后，用濃度為O. 5%的H202在100°C、pH值8. O條件下處理7小時(shí)提取膠原蛋白；步驟3，再采用胰蛋白酶在溫度50°C、pH值7. 5、底物濃度6%、酶底比8000u/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6小時(shí)；步驟4，用超濾分級(jí)的方法分離純化酶解液中的降血壓肽，取超濾離心后分子量小于 5000Da的肽段冷凍干燥后制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用豬股骨制備降血壓肽的方法，其特征在于所述的步驟 I包括如下步驟步驟1-1，剔除新鮮豬股骨中的包括殘肉、皮、筋腱的非骨骼成分，將骨破碎成5 IOmm 左右的小塊，用水清洗去除部分脂肪和血紅蛋白；步驟1-2，在石油醚中浸泡24小時(shí)，以脫去殘余的脂肪；步驟1-3，按料液比1:4加入4%的鹽酸浸泡3天，每12小時(shí)換一次鹽酸，且新舊酸各半，待灰分含量降至O. 3%左右；步驟1-4，置于O. 1%的Ca(OH) 2中進(jìn)行浸泡5天左右，除去雜蛋白；步驟1-5，用大量水清洗Ca (OH) 2及其他雜質(zhì)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)骨料的pH值至7，使積存在骨料里的Ca(0H)2生成可溶性的鈣鹽，再用清水沖洗，除掉鹽酸與石灰相互作用生成的氯化鈣和余酸，淌干備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用豬股骨制備降血壓肽的方法，其特征在于所述的步驟4 具體包括如下步驟步驟4-1先將步驟3中獲得的酶解產(chǎn)物過(guò)濾；步驟4-2,再經(jīng)過(guò)8000r/min離心,取上清，以除去部分沉淀；步驟4-3，取15mL上清液加入膜截留量為IOkDa的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行15分鐘超濾離心，收集的分子量小于IOkDa的濾液15mL加入5kDa膜截留量的超濾管中于離心力為4000g的離心機(jī)中進(jìn)行60分鐘超濾離心，收集的濾液為分子量小于5kDa 的肽段組分；步驟4-4，將分子量小于5kDa的組分冷凍干燥后制得肽段粉末，凍藏備用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用豬股骨制備降血壓肽的方法，包括以下步驟將新鮮豬股骨頭進(jìn)行碎骨、脫脂、浸酸、浸灰和中和淌干備用；將處理好的備用骨料用濃度0.5%的H2O2按料液比1:5在常溫下浸泡24h后，用濃度為0.5%的H2O2在100℃、pH值8.0條件下處理7小時(shí)提取膠原蛋白；再采用胰蛋白酶在溫度50℃、pH值7.5、底物濃度6%、酶底比8000u/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6小時(shí)；用超濾分級(jí)的方法分離純化酶解液中的降血壓肽，取超濾離心后分子量小于5000Da的肽段冷凍干燥后制得。本發(fā)明以豬股骨作為原料制備降血壓肽，取材容易、方法簡(jiǎn)便，為豬股骨的開(kāi)發(fā)利用提供一條新的途徑，同時(shí)，為研制高血壓的防治藥物提供一種安全無(wú)副作用的原料。
文檔編號(hào)C07K1/34GK103014105SQ20121018956
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者李 誠(chéng), 付剛, 李娜, 陳碩, 魏庭浩 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)